この作品は、自然科学とカナダの工学研究評議会によってサポートされていました。微細加工は、マギル大学のマギルナノツールのMicroFab施設、カールトン大学の電子部門の支援を受けて実施しました。

血液は、オタワ大学（H11-13-06）の倫理委員会の承認を得て、健康な個体から収集されます。 1.マイクロチャネルの作製マイクロチャネルは、標準的なフォトリソグラフィ法18に基づいて製造されています。 <ol><li>コンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを使用して、マイクロチャネルの幾何学的形状を設計し、透明性のフォトマスクの設定を印刷します。これらは、製造工程中に光路を決定するので、これらのマスクは重要です。この場合には、マイクロチャネルの寸法は、厚さ120ミクロン、深さ60ミクロン、長さ7ミリメートルです。 </li><li>クリーンルームでは、スピンコートは、エポキシ系負所望のマイクロチャネルの深さ（60μm）を得るために30秒間2000rpmでシリコンウェハ上にフォトレジスト。 </li><li> 70秒間ウェハ650ミリジュール/ cm 2でUVランプの下でフォトマスクを公開します。唯一の透明な領域を露出させることを確認しUV光へのフォトマスク。透明領域の曝露は、フォトレジストの硬化をもたらす鎖の重合を可能にします。 - フォトレジストの過剰を削除する開発者に、シリコン片を浸し。 </li><li>ポリジメチルシロキサン（PDMS）の溶液を作成するために1：金型が製造されると、10の比率で、シリコン系エラストマーと硬化剤を混合します。脱気真空チャンバ内にPDMS溶液を入れてください。金型にそれを注ぎ、マイクロチャネルを作成するために90分間60℃に加熱します。その後90秒間酸素プラズマボンディングを用いてガラススライドに個々のチャネルを結合。 NOTE：PDMSの脱ガス処理は、混合プロセスによって生じる気泡を除去するために行われます。 </li><li>マイクロチャネルの寸法が成功テストのために許可されていることを確認。このプロトコルでは、マイクロチャネルは、120×60μmの長方形の断面を有します。対照的に、平均RBCは8μmで2ミクロンの厚さの直径を有します。ザreforeは、マイクロチャネルの幅は、適切な凝集を観察し、正確な速度プロファイルを決定するのに十分です。 </li></ol> 2.血液の準備<ol><li>倫理委員会の承認を得た後、健康なボランティアドナーから血液を採取します。採血管に存在するエチレンジアミン四酢酸（EDTA）と血（血液4ml中7.2ミリグラムのEDTA）を扱います。 注：EDTAは、血液凝固を回避するために使用されます。 </li><li>血液成分を分離するために、1400×gで（3,000 rpm）で血液サンプルを10分間3回遠心。遠心分離の結果、三つの異なる層を観察します。 注：3層（管の底にある）RBC層、バフィーコート（RBC層の上に位置白血球及び血小板からなる）と、（他のすべての上に位置するプラズマ層であります成分）。 <ol><li>最初の遠心分離後、血液ピペットを用いて血漿を収集します。任意のCを回避バフィーコートでontact。 </li><li>収集し、10％に希釈した漂白剤で容器内にバフィーコートを処分。 </li><li>残りのRBC層と管のそれぞれにpH7.4のPBSの3ミリリットルを追加し、遠心分離機の適切なバランスを確保します。ゆっくり10分間1400×gで（3,000 rpm）で再びチューブと遠心分離機を混ぜます。 注：これらは細胞接着を変更する可能性があるのでPBS溶液は、任意のマグネシウムやカルシウムが含まれていないことを確認してください。 </li><li> 2回目の遠心分離後にチューブにPBSを処分し、存在する場合、残りのバフィーコートを除去します。繰り返して、きれいな赤血球を生成する第三の遠心分離のために2.2.3と2.2.4を繰り返します。 </li></ol></li><li>対応する（5％、10％及び15％のRBC懸濁物を得るために1 mlチューブにプラズマできれいな赤血球（0.95 0.9 0.85 ml）を必要量（0.05 0.1 0.15 ml）を混合します）ヘマトクリット。微量でヘマトクリットを確認してください。 </li></ol> 3.流体の準備<ol><li>蛍光トレーサー粒子溶液を60μl添加し（1％固体、D 粒子 = 0。86ミクロンは、λは= 542 nmの腹筋 1ミリリットルRBC-サスペンションチューブへ= 612 nmおよびλ 放射 ）。 注：蛍光トレーサー粒子（内部染めポリスチレン粒子）は、マイクロチャネル内の流れの速度を測定するために使用されます。レーザー光（λ= 542 nm）での対応する波長に曝露されたときにこれらの粒子は、蛍光を発します。 </li><li> pH7.4のPBS溶液を調製し、PBS溶液1mlで同じ蛍光トレーサー粒子溶液60μlを添加します。 </li></ol> 4.集約サイズ測定<ol><li>マイクロチャネル内の流体（RBC-懸濁液とPBS）を挿入するには、25μlの100μlに二枚のガラスの注射器を使用しています。この意志システムのコンプライアンスを減少させるのに役立ちます。エントリー穴をフィッティングチューブとコネクタを介して注射器にマイクロチャネルを接続します。流体容器と注射器との間に存在する圧力差を用いて、ガラスシリンジを埋めます。気泡がシステムに存在しないことを確認してください。別の方法としては、マイクロチャンネル内で両方の流体を駆動するために、圧力制御システムを使用しています。 </li><li>ハイスピー​​ドカメラとμPIVシステムに接続された倒立顕微鏡のステージ上にマイクロ流路を配置します。プログラム所望の流量（PBSのためのQ = 8μL/時の流量をengendering血液ため例えば、Q = 2μL/時）のシリンジポンプ。 注：唯一のシリンジポンプが使用されています。二つの異なる内径を有する、二つの異なるガラスシリンジを使用して、Y-マイクロチャネルの各ブランチに入る流量を変化させることが可能です。 </li><li>に示すように、異なるエントリ·ブランチから、異なる流量でそれぞれ二重Y-マイクロチャンネル内で両方の流体を挿入<stronG&gt;図1。異なるせん断速度をテストするために、ポンプの流量を変更します。これは、2つの分岐19（ 図2、図3）との間で同じ適切な比率（この場合は4）を維持します。流れは測定値を取得する前に定常状態に到達するのを待つ：視覚的に円滑な流れのための高速カメラの画像を検査します。 注：血液比は、層内の線形速度プロファイルを得るために重要です。 </li><li>ハイスピー​​ドカメラを使用して、赤血球を可視化します。流体の流れの画像を制御し、記録し、保存するために、カメラをコンピュータに接続します。二つの流体の流れが定常状態に到達すると、録音を開始します。 <ol><li>より良い処理結果を得るために複数の画像を取得します。凝集体の鮮明な画像に最適なカメラの露光時間を決定します。 注：この場合のカメラの露光時間は0.5ミリ秒でした。各フレーム間の時間間隔の選択は、カメラのフレームレート及びtでの流量に基づいています彼は、マイクロチャネル。この手順で処理された各フレーム間の時間は60ミリ秒でした。したがって、秒当たり18フレームを記録することが可能なカメラで十分です。 注：誤った測定結果につながる可能性がある、チューブ、シリンジに血液沈降を避けてください。 </li></ol></li><li>次のように画質を改善する画像処理技術（ここではMATLABプログラム）を用いて、（ 図4に示す）が画素強度に基づいて、各画像に凝集体を検出します。 <ol><li>画像は、フレーム毎に良好な画像品質を得るために、ヒストグラム等化法を用いてコントラスト向上。 </li><li>グレースケール画像は、二値画像に変換します。この目的のために、各ピクセルの変換を指示すること、0〜1の範囲の閾値を設定します。閾値よりも大きい値を持つ画素が白画素として検出され、一方、閾値以下の画像の任意の画素は、黒画素として検出されます。 </li><li>塗りつぶしより良い結果を得るために1つの集約内のギャップに対応する孔（存在し、必要に応じて）。 </li><li>隣接するセルが凝集体として関連しているように、二値画像における隣接白画素を決定することによって細胞を検出します。 </li><li>検出された別の集合体にラベルを付け、より良い視覚化のために、赤、緑、青（RGB）画像に二値画像に変換します。画像処理技術の有効性を確認し、 図5に示すように、すべてのセルは、考慮されることを確実にするために対応する処理画像のそれぞれにオリジナルフレームを組み合わせる。実行手順4.5.1、4.5.2、4.5.3キャプチャされたすべてのフレームのために、4.5.4および4.5.5。 </li><li>検出された画素の数に基づいて、フレーム内で検出された各集合体の面積を計算します。使用するレンズの倍率に基づいて、較正レチクルを使用して、変換係数を計算し、ミクロン2に結果を変換します。それぞれで検出された集合体サイズを平均化フレーム、その後はRBC-懸濁液の各記録の平均凝集体サイズを得るために、すべてのフレームの結果を平均します。 </li><li>各検出された集合体の中にRBCの代表推定数を決定するために1つのRBCの面積を計算します。 図6に示すように、これらの結果を用いて、（各集計内のセルの推定数によって表される）集計のサイズの関数として各集計内のRBCの割合の分布を計算します。 NOTE：RBC凝集体を測定するために、ImageJソフトウェアは、各フレームに同じタスクを実行する（代わりにMATLABの）使用することができます。 </li></ol></li></ol> 5.流体の速度とせん断速度測定流体の速度、ひいてはμPIVシステムを使用して、せん断速度を決定します。 <ol><li>データは、高速カメラを用いて取得された後、μPIVシステムに使用される二重パルスカメラに切り替えます。画像の交流のためのイメージングソフトウェアを使用して速度場の決意のフローと画像処理のquisition。 </li><li>レーザーをオンにする前に、レーザーのクラスに応じて、必要なすべての予防措置をとります。その後、システムは、カメラとレーザーの電源をオンにします。 </li><li>使用するレンズの倍率に基づいてカメラのキャリブレーション。この目的のために、顕微鏡下で10ミクロン精度のマイクロスケールを使用して、画像内の1画素のサイズを設定します。 </li><li>レーザーを起動して、両方の流体中の粒子を可視化します。流れの中で最速の粒子に着目して、マイクロチャネルの中央面を見つける（ すなわち、最も速い粒子は明るいはずです）。 </li><li>粒子の適切な移動を確実にするために、DT（2つの連続するフレーム間の時間間隔）を設定します。最速の粒子は、両画像間の約5〜10ピクセルを移動する必要があります。 </li><li>フローの記録を開始します。 5ミリ秒間隔で、画像の100ペアを取得するためのソフトウェアを設定します。すべてのDIFのために、手順5.4、5.5および5.6を実行しますferent RBC-懸濁液と異なる剪断速度のために。 注：方法論の詳細はピッツとフェネシュ20の研究で示されています。 </li><li>イメージングソフトウェアとの相互相関法を使用して取得された録音を処理します。 注：これは、（流体の流れと、ユーザが選択した時間間隔に基づいて）所定の大きさの小さなウィンドウに一対の画像を離散化で構成されて呼ばれる相関ウィンドウと各ウィンドウ内の粒子の変位を以下に示します。 <ol><li>取得された画像は、優れたデータ処理のために（バックグラウンド減算、「ベースクリッピング」21または22,23の重複画像を含む）の前処理を必要とする場合、最初に決定します。 </li><li>そして、相関窓の大きさや形状、ならびにの重複画像の割合を選択します。詳細な研究は、血液のための最適なパラメータと画像前処理技術を決定するために、ピッツら 24によって実行されました異なるチャネル構成に流れます。 100画像のペアと速度の二乗平均平方根（RMS）誤差から算出した平均速度場として結果を表現します。 </li></ol></li><li> 図7に示すように処理されたデータから、チャネル出口での速度プロファイルを抽出し、より良いプロファイルは、空間内の速度場を平均化します。 注：速度プロファイルを構成するバーは、チャネルの幅を基準に選択された相関ウィンドウサイズに対応しています。速度のRMS誤差はまた、実験的な速度推定の誤差を示す、 図7に示されています。 </li><li>すべての測定および処理が実行された後、レーザーをオフにし、。ソフトウェア、カメラ、ステージを移動し、コンピュータやレーザー：システムのすべてのコンポーネントをシャットダウンします。 </li><li>剪断速度を計算するには、最初に検出し、高速カメラの記録に基づいて、マイクロ流路内の血液の厚さを推定します。この目的のために、すべての平均特定の記録のフレームは、ビデオの背景画像を取得します。 （5％、10％、15％ヘマトクリットで懸濁とき10μL/ hrで流れるRBC懸濁物については、図8に示すように）血液層を区切り。対応する血液層の厚さのために速度値を取得し、血液層の厚さによって、速度値を除算することにより、剪断速度を計算します。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

本発明の方法論を使用して、異なる流れ条件及びヘマトクリット下定性的および定量RBC凝集体を分析することが可能です。成功したテストと集計検出のためには、マイクロチャネルの入口に二つの流体の間の適切な速度比を決定するために重要です。この比は、速度プロファイル19準線形である最適な血液層の厚さを得ることは非常に重要です。 成功したテスト?...

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

赤血球（RBC）は、血液のレオロジー挙動を決定する上で重要な役割を果たしています。彼らは、ほぼ単独でin vitroおよびin vivoでの血液の特定の性質を担当しています。生理的条件下では、赤血球は、血液量の40％〜45％を占めます。微小循環において、赤血球は、より小さな血管径とプラズマスキミング効果1の血液量の20％までを占めます。微小循環における血漿低減のこの現象は、フォーレウス効果として知られています。低剪断速度では、赤血球は、したがって、血液の非ニュートン挙動に寄与し、一緒にブリッジと「連銭」または凝集体と呼ばれる一次元又は三次元構造を形成することができます。しかし、RBC凝集のメカニズムは完全に理解されていません。二つの理論は、RBCの凝集をモデル化するために存在する：細胞理論の橋渡しを起因高分子2の架橋及び力attracへ浸透勾配3に起因する分子の枯渇によって引き起こさ化理論。 典型的には、ヒトの血液のために、凝集体は、1〜10秒-1までの範囲の非常に低いせん断速度4で形成されます。この範囲を超えると、RBCが脱凝集し、血管内に別々に流れる傾向にあります。 凝集体形成の条件を理解することは、血液のレオロジー挙動を定義するという点で血液レオロジーの分野に非常に重要です。これらの凝集体は、多くの場合、macrocirculationレベル（&gt; 300μmの直径）5で見られています。このスケールでは、血液は、ニュートン流体と均一な混合物と見なされます。しかし、これらの凝集体はほとんど毛細管レベル（直径4-10μm）の中に見られないと、通常、糖尿病6や肥満などの病的状態の指標です。 RBC凝集を変えることができる他の病的状態は、炎症性または感染状態を含み、高血圧やアテローム性動脈硬化症、遺伝性疾患および慢性疾患7などの心血管疾患。したがって、赤血球凝集メカニズムを理解し、（これらの凝集体の大きさや流れの状態との間の関係を定義することによって）、これらのエンティティを分析して、血液のmicrorheological行動の理解につながるので、臨床応用にそれを関連付けることができます。 RBC凝集物は、ヘマトクリット値（血液中の赤血球の体積）、剪断速度、血管径、RBC膜の剛性および懸濁培地組成8-10のようないくつかの要因によって変更することができます。したがって、制御された条件は、効果的にRBC凝集体を分析するために必要とされます。いくつかの方法は、血液の動作に関連する情報を提供しています静的アグリゲーション測定（集計インデックス）を提供することにより、凝集体形成を解析することができます。これらの方法は、とりわけ、赤血球沈降速度を含みます方法11、光透過法12、光反射法13と低剪断粘度法14。 いくつかの研究は、RBC凝集を研究し、制御された流れ条件15-17における凝集の程度を決定することを試みました。しかし、これらの研究は、間接的に凝集の程度についての情報だけでなく、地元の粘度を提供する顕微鏡血液画像に基づいて測定された剪断システム内の占有スペースの比率を決定することにより、赤血球凝集体の大きさを調べます。 そこで、直接制御し、一定のせん断速度下で、動的に、RBCは、微小循環に集約定量化するための新しい手順を提示します。 RBC懸濁物は、したがって、血液層にせん断流を作り出すリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液を、（ 図1に示されるように）二重Y字型マイクロチャネルに、同伴されます。この血液層定数シア以内R率を得ることができます。 RBC懸濁物は、異なるヘマトクリット値（H）レベル（5％、10％及び15％）で異なる剪断速度（2-11秒-1）下で試験されます。血流速度および剪断速度は、フローは、高速カメラを用いて可視化されている間、マイクロ粒子画像流速（μPIV）システムを使用して決定されます。得られた結果は、赤血球を検出し、凝集体のサイズを決定するために、画像強度に基づいて、MATLABコードで処理されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SU8-50 epoxy based negative Photo-resist</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-50 developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184</td>
			<td>Dow-Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-50 series Plasma system&#160;</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td>PE-50 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>B367861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poshpate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tracer fluorescent particles solution (15 mL)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>R800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggregometer</td>
			<td>RheoMeditech</td>
			<td>Rheo Scan AnD300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringes (50 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing (Tygon)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>AAA00001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed camera (Basler)</td>
			<td>Graftek Imaging Inc.</td>
			<td>basler acA2000-340km</td>
			<td>A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double pulsed camera&#160;</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>Imager Intense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope MITAS</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>MITAS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nd:YAG laser</td>
			<td>New Wave Research</td>
			<td>Solo-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus)</td>
			<td>Chemyx Inc. and Harvard Apparatus</td>
			<td>Nexus3000 and PicoPlus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DaVis software</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>Davis</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled microfluidic environment for dynamic investigation of red blood cell aggregation

血液は、非ニュートン生体液として、血液レオロジーの分野における多くの研究の焦点を表します。血液成分は、血漿中に懸濁された赤血球、白血球及び血小板を含みます。によるRBCの存在量（血液量の40％〜45％）に、彼らの行動は、特に微小循環の血液のレオロジー挙動を決定します。非常に低いせん断速度で、RBCが組み立てに見られている、フォームの実体は、血液の非ニュートン挙動を引き起こす、凝集体と呼ばれます。これは、微小循環における血液レオロジーを把握するために、凝集体形成の条件を理解することが重要です。ここで説明するプロトコルは、画像処理に基づいて、一定のせん断速度下で定量的に微小循環におけるRBC凝集体を決定するための実験手順について詳しく説明します。この目的のために、RBC-懸濁液は120×60μmのポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロチャネル中で試験され、分析されます。 RBC-懸濁液は、耳鼻咽喉科であります血液層内の線速度プロファイルを得るので、一定の剪断速度の広い範囲を達成するために、第2の流体を使用して雨が降りました。 RBC凝集は、高速カメラを用いて可視化しながら剪断速度は、マイクロ粒子画像流速（μPIV）システムを使用して決定されます。 RBC凝集体の捕捉されたビデオは、画像強度に基づいて、集合のサイズを決定するために画像処理技術を用いて分析されます。

ヒトの赤血球が5％、10％、15％ヘマトクリットで懸濁し、10μL/ hrで流れるために二重Y-マイクロチャネル内の2つの流体の流れの例を図2に示されている。 図3は、時集合サイズの差を示していますチャネル内の流れは、10％のヘマトクリット5μL/時間に10μL/時から減少されます。ヘマトクリットおよびせん断速度を変化させたときに凝集体の大きさの定性的な概念を与え...

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Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

プロトコルは、画像処理技術に基づいて、詳細に制御され、一定の剪断速度の下で赤血球（RBC）の凝集体を定量化するための実験手順を記載しています。このプロトコルの目的は、制御されたマイクロ流体環境で対応するせん断速度に赤血球凝集体のサイズを関連付けることです。

赤血球凝集の動的な調査のための制御されたマイクロ流体環境

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

controlled-microfluidic-environment-for-dynamic-investigation-red

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K ビュー.  University of Ottawa. プロトコルは、画像処理技術に基づいて、詳細に制御され、一定の剪断速度の下で赤血球（RBC）の凝集体を定量化するための実験手順を記載しています。このプロトコルの目的は、制御されたマイクロ流体環境で対応するせん断速度に赤血球凝集体のサイズを関連付けることです。 

ビデオ: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

機械的にダイナミックな細胞培養のための微細加工プラットフォーム

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

生物工学

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

堅牢、マイクロ流体細胞内送達プラットフォームとしての細胞絞る

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

未処理の全血から好中球走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォーム

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

推定細胞接着分子のキャラクタリゼーションのためのビーズ凝集アッセイ

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました<em&gt;インビトロ</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 &#181;L of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

全血からの超高感度のタンパク質検出のための全自動遠心マイクロ流体デバイス

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

軟骨再生のための3次元磁気幹細胞凝集およびバイオリアクター成熟

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

バルブ付き多層マイクロ流体デバイスのための多段階可変高さのフォトリソグラフィ

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...