We are indebted to Xuefei Yang, Sabine Both, Lin Chen and Kaitian Wang for coordinating the fieldwork and establishing the BEF-China experiment. We are also grateful to the whole BEF-China research group for their general support. BEF-China is mainly funded by the German Research Foundation (DFG FOR 891/1 and 2) and funding for this particular project was provided by the German Research Foundation to H.B. (DFG BR 1698/9-2). We are also thankful for the travel grants and summer schools financed by the Sino-German Centre for Research Promotion in Beijing (GZ 524, 592, 698, 699 and 785). In addition we would like to thank David Eichenberg, Michael Staab, Katja Grotius, Silvana Tornack, Lin Chen, and Shouren Zhang for their support in the field and in the lab.

1. condutância estomática <ol><li> As medições de condutância estomática NOTA: Os autores fizeram uso de um tipo simples de porômetro estado estacionário (Decagon SC1). O design do porômetro tem a vantagem de tamanho pequeno, a operação manual intuitiva e de alta confiabilidade. Ao medir a condutância estomática no campo, certifique-se de minimizar a distância entre indivíduos medidos para um ciclo de medição repetida de ser o mais eficiente possível. </li><li> Escolha folhas de diferentes espécies e indivíduos de acordo com um padrão reprodutível (mesma altura, mesma exposição, mesma posição dentro da planta, se possível somente a partir do mesmo nó, e só a partir de uma categoria; sol ou na sombra das folhas, etc.). <ol><li> Apenas medida deixa em condição saudável, não danificado e totalmente desenvolvido. Marque as folhas das pessoas (por exemplo, com laços de cabo ou fita cor), para assegurar que as medidas repetidas são feitas na mesma folha. NOTA: MEASURements de condutância estomática deve ser feita apenas na superfície da folha, evitando a nervura central e fortes veias da folha. </li><li> Comece medições nas primeiras horas da manhã, antes do nascer do sol, tendo cinco a dez medições repetidas até que os valores de condutância estomática mostra um claro declínio ao meio-dia. NOTA: Um curso diário das medições vai entregar bons dados para analisar as relações entre vpd e condutância estomática. </li></ol></li><li> Medições VPD <ol><li> Com cada medição S g, temperatura e umidade relativa do registro de preferência com loggers portáteis para medir directamente as condições na posição da mesma folha. Para o cálculo do déficit de pressão de vapor usar a fórmula de agosto a Roche Magnus 15. </li></ol></li></ol><img alt="Equação 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52738/52738eq1.jpg" width="300" /> pressão de vapor de água = saturação e s [hPa] <ol start="4"><li> Modelo g S - resposta VPD <ol><li> Agora espécie-sábios enredo de todos os dados g S contra vpd, combinando todos os cursos diários de folhas individuais em uma análise por cada espécie. Extrair o valor máximo observado a partir dos dados condutância estomática através de pesquisa para o valor máximo. Para dimensionar o modelo para a comparabilidade espécies-sábio, dividir os valores observados através do valor máximo observado para essa espécie (g S / g SMAX). </li><li> Para cada espécie, os regredir logitos g de S (g s / g SMAX) para VPD e o termo quadrático em VPD usando um modelo linear generalizado com uma distribuição de erro binomial (a, b e c representam parâmetros de regressão): </li></ol></li></ol><img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/52738/52738eq2.jpg" width="300" /><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/52738/52738fig1highres.jpg" width = &quot;700&quot; /&gt; Figura 1. Exemplo dos valores plotados e do modelo ajustado para g S -. Vpd condutância estomática plotados em função do déficit de pressão de vapor para as espécies Liquidambar formosana. Pontos vazios representam os valores observados. (A) condutância estomática máxima, o vpd a condutância estomática máxima e média condutância estomática foi extraído do absoluto condutância estomática, portanto, não-dimensionado (g S) de dados. (B) dados da condutância estomática Scaled (g S / g SMAX) foram plotados para extrair os parâmetros relativos (mostrados como pontos cheios) 20. Re-print com a permissão de 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52738/52738fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52738/52738fig2highres.jpg" width = &quot;400&quot; /&gt; Figura 2. Todos os modelos embutidos para todas as espécies. Gráficos modelo para os dados de condutância estomática a regressão vpd para todas as espécies. Espécies perenes são representadas por linhas pretas, espécies caducifólias por linhas vermelhas 20. Re-imprimir com a permissão de 20. NOTA: Utilizando as logits em vez de regredir g S diretamente para vpd, leva ao ponto que modelou os valores máximos não ultrapassam g SMAX e que g S se aproxima de 0 a alta vpd. <ol start="5"><li> Extraia parâmetro de regulação dos estômatos para cada espécie <ol><li> Calcular g modelado valores absolutos Smax (MaxFit na Figura 1B). Para fazer isto, calcule a condutância máxima em VPD estomática de fixar o primeiro derivado de 1.4.2 a zero, o que dá VPD gsMaxFit = -b / 2a. Insira vpd gsMaxFit na fórmula de 1.4.2 e elevar ao poder do e obter MaxFit. Calcula-se a mEAN de todas as medições de condutividade de cada espécie (ver Figura 1A). NOTA: Use o software estatístico R (http://www.r-project.org). </li><li> Para calcular os valores relativos, a partir do modelo escalado (g s / g Smax), extrair a condutância estomática e valores de VPD para os dois pontos seguintes: (1) a condutância estomática e VPD no máximo do modelo (MaxFit) e (2) VPD no segundo ponto de inflexão da curva (ver Figura 1B). Multiplicar esses valores por g SMAX obter valores absolutos g S para estes pontos. Ver Figura 2 para uma sobreposição completa dos modelos individuais de todas as 39 espécies analisadas. </li></ol></li></ol> 2. Medidas de estomática Traits <ol><li> Retirar amostras de preferência a partir de folhas exactamente as mesmas que foram utilizadas para as medições de condutância estomática. Se isso não for possível, aplicar o mesmo procedimento de selecção que foi aplicada para escolher as folhaspara as medições de condutância estomática, de preferência nos mesmos indivíduos. </li><li> Aplique uma fina camada de incolores, secagem rápida esmaltes (teste de diferentes marcas, alguns são mais adequados do que outros) para uma amostra fresca. Se as amostras não podem ser processados ​​imediatamente, armazená-los em álcool 70%. Após a unha polonês secou, ​​descascar delicadamente a impressão de a partir da folha e prossiga para a análise microscópica, como acontece com uma amostra de folha normal. NOTA: Para o caso de folhas com uma alta densidade de tricomas passo anterior, por aplicação de hidróxido de sódio ou de uma solução 1: 1 de ácido acético e peróxido de oxigénio pode levar a melhores resultados. </li><li> Analytics microscópio óptico <ol><li> Conecte uma câmera para um microscópio óptico capaz de ampliações entre 40X a 400X. Depois que a câmera é conectada ao microscópio, coincidir com as fotos tiradas com a ampliação ótica e resolução da imagem, por exemplo, com a ajuda de uma escala. </li><li> Empregando i open sourcesoftware de processamento de mago como ImageJ 16 analisar estas imagens. <ol><li> Desenhar uma forma com a ferramenta de forma a partir da ferramenta de análise de imagem na imagem em uma área sem sujeira, impressões do polegar, áreas danificadas, ou grandes veias da folha. Contagem estômatos nesta área e no total de pelo menos 50.000 mm 2 por amostra. </li><li> Meça guarda dos estômatos comprimento celular e comprimento dos poros. Calcule o número de estômatos por mm 2. Calcular o índice de estomática como a razão entre a densidade estomática epidérmica número de células por mm2. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Avaliação da veia da folha Traits NOTA: Para a avaliação de traços veia de folha, um protocolo de Sack &amp; Scoffoni 17 foi empregado modificado. <ol><li> Preparação de amostra NOTA: Para otimizar a visibilidade das veias da folha, as folhas são primeiro branqueada e, em seguida, coradas com safranina e verde malaquita. <ol><li> Para branquear o leaves, deixá-los em menos de 72 horas em 50% solução de descolorante (teste de diferentes marcas, novamente algum poderia funcionar melhor). Em alternativa, utilizar 5% de solução ou solução de KOH a 10% ou 25% de solução de NaOH 2 H2O. </li><li> Aquece-se a solução até 30 ° C ou combinar as diferentes soluções a partir do passo 3.1.1 para melhores efeitos. Lavar várias vezes em água depois. Adaptar o processo de branqueamento para as espécies específicas, dependendo das suas características de folha. NOTA: Thicker folhas podem precisar de períodos mais longos de banho e solução ou as soluções mais agressivas. Folhas tenras mais fino e pode ser branqueada a um grau satisfatório em menos de 72 horas. </li><li> Para colorir as folhas colocá-los em 100% de etanol. Colori-los, durante 2 - 30 min em solução de safranina 1%. Para melhorar a coloração, adicione um tratamento adicional com 1% de solução de verde malaquita apenas para alguns segundos. Adaptar o protocolo para todas as espécies em termos de tempo e intensidade para atingir os melhores resultados. Enxágüe several vezes na água depois. Se as folhas são profundamente manchada, algum tempo em etanol ou descolorante pode ajudar. </li></ol></li><li> Análise da Amostra <ol><li> Digitalizar as folhas com um scanner de luz de fundo em uma resolução de cerca de 1.200 dpi. Combine as varreduras tomadas para a resolução da imagem, por exemplo, com a ajuda de uma escala, para garantir que o comprimento do pixel pode ser rastreada até medidas absolutas da folha digitalizada comprimento. </li><li> Medir a área, perímetro, comprimento e largura das folhas. Calcular vários índices, por exemplo, comprimento / largura e circunferência 2 / área. 1 Corte um retângulo por um centímetro fora do centro da imagem. Medir o diâmetro das veias de primeira e segunda ordem (não incluem a veia principal meio). Medir o comprimento de todos os veios de primeira ordem nesta quadrícula (densidade veia). </li></ol></li></ol> 4. Avaliação dos Outros Folha Traits NOTA: Asses traços típicos da folha, como específicade área foliar (SLA), teor de matéria seca foliar (LDMC), área foliar, conteúdo do elemento, hábito folha, folha pinnation, folha tipo composto, folha tipo de margem etc. seguindo protocolos estabelecidos 18,19. <ol><li> Características foliares observacionais <ol><li> Avaliar pinnation folha, folha tipo composto, folha tipo de margem ea presença de nectários extraflorais 18,19 por meio da observação no campo. </li></ol></li><li> Características foliares analíticos <ol><li> Coletar amostras de folhas frescas, de preferência sobre os mesmos indivíduos que foi utilizado nas outras medições, para a determinação da área específica foliar (SLA), área foliar e conteúdo da folha de matéria seca (LDMC) 18,19. Depois de 48 horas na estufa de secagem a 80 ° C, medir o conteúdo do elemento e proporções, de preferência, sobre as mesmas folhas. </li></ol></li></ol>

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	<li>Schulze, E. -. D., Kelliher, F., K&#246;rner, C., Lloyd, J., Leuning, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+among+maximum+stomatal+conductance,+ecosystem+surface+conductance,+carbon+assimilation+rate,+and+plant+nitrogen+nutrition:+a+global+ecology+scaling+exercise.">Relationships among maximum stomatal conductance, ecosystem surface conductance, carbon assimilation rate, and plant nitrogen nutrition: a global ecology scaling exercise.</a> Annual Review of Ecology and Systematics. 25 (1), 629-662 (1994).</li><li>Chaturvedi, R. K., Raghubanshi, A. S., Singh, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+tree+seedlings+in+a+tropical+dry+forest+in+relation+to+soil+moisture+and+leaf+traits.">Growth of tree seedlings in a tropical dry forest in relation to soil moisture and leaf traits.</a> Journal of Plant Ecology. 6 (2), 158-170 (2013).</li><li>Santiago, L. S., Kim, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+evolution+of+leaf+shape+and+physiology+in+the+woody+Sonchus.+alliance+(Asteraceae:+Sonchinae)+in+Macaronesia.">Correlated evolution of leaf shape and physiology in the woody Sonchus. alliance (Asteraceae: Sonchinae) in Macaronesia.</a> International Journal of Plant Sciences. 170 (1), 83-92 (2009).</li><li>Aasamaa, K., Sober, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydraulic+conductance+and+stomatal+sensitivity+in+six+deciduous+tree+species.">Hydraulic conductance and stomatal sensitivity in six deciduous tree species.</a> Biologia Plantarum. 44 (1), 65-73 (2001).</li><li>Waring, R. H., Chen, J., Gao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-water+relations+at+multiple+scales:+integration+from+observations,+modeling+and+remote+sensing.">Plant-water relations at multiple scales: integration from observations, modeling and remote sensing.</a> Journal of Plant Ecology-UK. 4, 1-2 (2011).</li><li>Oren, R., Sperry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+and+synthesis+of+intra-+and+interspecific+variation+in+stomatal+sensitivity+to+vapour+pressure+deficit.">Survey and synthesis of intra- and interspecific variation in stomatal sensitivity to vapour pressure deficit.</a> Plant, Cell and Environment. 22 (12), 1515-1526 (1999).</li><li>Leuning, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+appraisal+of+a+combined+stomatal-photosynthesis+model+for+C3+plants.">A critical appraisal of a combined stomatal-photosynthesis model for C3 plants.</a> Plant, Cell and Environment. 18 (4), 339-355 (1995).</li><li>Patan&#232;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf+area+index,+leaf+transpiration+and+stomatal+conductance+as+affected+by+soil+water+deficit+and+vpd+in+processing+tomato+in+semi+arid+mediterranean+climate.">Leaf area index, leaf transpiration and stomatal conductance as affected by soil water deficit and vpd in processing tomato in semi arid mediterranean climate.</a> Journal of Agronomy and Crop Science. 197 (3), 165-176 (2011).</li><li>Jarvis, A. J., Davies, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coupled+response+of+stomatal+conductance+to+photosynthesis+and+transpiration.">The coupled response of stomatal conductance to photosynthesis and transpiration.</a> Journal of Experimental Botany. 49 (Special Issue), 399-406 (1998).</li><li>Roelfsema, M. R. G., Hedrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+the+light+of+stomatal+opening:+new+insights+into+&#8220;the+Watergate.&#8221;.">In the light of stomatal opening: new insights into &#8220;the Watergate.&#8221;.</a> New Phytologist. 167 (3), 665-691 (2005).</li><li>Wong, S. C., Cowan, I. R., Farquhar, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+conductance+correlates+with+photosynthetic+capacity.">Stomatal conductance correlates with photosynthetic capacity.</a> Nature. 282 (5737), 424-426 (1979).</li><li>Sobrado, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydraulic+conductance+and+water+potential+differences+inside+leaves+of+tropical+evergreen+and+deciduous+species.">Hydraulic conductance and water potential differences inside leaves of tropical evergreen and deciduous species.</a> Biologia Plantarum. 40 (4), 633-637 (1998).</li><li>Zhang, Y. -. J., Meinzer, F. C., Qi, J. -. H., Goldstein, G., Cao, K. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midday+stomatal+conductance+is+more+related+to+stem+rather+than+leaf+water+status+in+subtropical+deciduous+and+evergreen+broadleaf+trees.">Midday stomatal conductance is more related to stem rather than leaf water status in subtropical deciduous and evergreen broadleaf trees.</a> Plant, Cell and Environment. 36 (1), 149-158 (2013).</li><li>Aerts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+being+evergreen.">The advantages of being evergreen.</a> Trends in Ecology, &amp; Evolution. 10 (10), 402-407 (1995).</li><li>Murray, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+computation+of+saturation+vapor+pressure.">On the computation of saturation vapor pressure.</a> Journal of Applied Meteorology. 6 (1), 203-204 (1967).</li><li>Scoffoni, C., Sack, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+leaf+vein+traits.">Quantifying leaf vein traits.</a> PrometheusWiki. , (2011).</li><li>Cornelissen, J. H. C., Lavorel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+handbook+of+protocols+for+standardised+and+easy+measurement+of+plant+functional+traits+worldwide.">A handbook of protocols for standardised and easy measurement of plant functional traits worldwide.</a> Australian Journal of Botany. 51 (4), 335-380 (2003).</li><li>Perez-Harguindeguy, N., D&#237;az, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+handbook+for+standardised+measurement+of+plant+functional+traits+worldwide.">New handbook for standardised measurement of plant functional traits worldwide.</a> Australian Journal of Botany. 61 (3), 167-234 (2013).</li><li>Kr&#246;ber, W., Bruelheide, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transpiration+and+stomatal+control:+A+cross-species+study+of+leaf+traits+in+39+evergreen+and+deciduous+broadleaved+subtropical+tree+species.">Transpiration and stomatal control: A cross-species study of leaf traits in 39 evergreen and deciduous broadleaved subtropical tree species.</a> Trees. 28 (3), 901-914 (2014).</li><li>Larcher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physiological plant ecology. , 514 (2003).</li><li>Bunce, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+transpiration+control+stomatal+responses+to+water+vapour+pressure+deficit.">Does transpiration control stomatal responses to water vapour pressure deficit.</a> Plant, Cell and Environment. 20 (1), 131-135 (1997).</li><li>Bunce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+leaf+hydraulics+limit+stomatal+conductance+at+high+water+vapour+pressure+deficits.">How do leaf hydraulics limit stomatal conductance at high water vapour pressure deficits.</a> Plant, Cell and Environment. 29 (8), 1644-1650 (2006).</li><li>Poorter, L., Bongers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf+traits+are+good+predictors+of+plant+performance+across+53+rain+forest+species.">Leaf traits are good predictors of plant performance across 53 rain forest species.</a> Ecological Sciences of America. 87 (7), 1733-1743 (2006).</li><li>Juhrbandt, J., Leuschner, C., H&#246;lscher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+maximal+stomatal+conductance+and+leaf+traits+in+eight+Southeast+Asian+early+successional+tree+species.">The relationship between maximal stomatal conductance and leaf traits in eight Southeast Asian early successional tree species.</a> Forest Ecology and Management. 202 (1-3), 245-256 (2004).</li><li>Brodribb, T. J., Holbrook, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf+physiology+does+not+predict+leaf+habit;+examples+from+tropical+dry+forest.">Leaf physiology does not predict leaf habit; examples from tropical dry forest.</a> Trees. 19 (3), 290-295 (2005).</li><li>Kr&#246;ber, W., Zhang, S., Ehmig, M., Bruelheide, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xylem+hydraulic+structure+and+the+Leaf+Economics+Spectrum+-+A+cross-species+study+of+39+evergreen+and+deciduous+broadleaved+subtropical+tree+species.">Xylem hydraulic structure and the Leaf Economics Spectrum - A cross-species study of 39 evergreen and deciduous broadleaved subtropical tree species.</a> PLOS ONE. 9 (11), e109211 (2014).</li><li>Kr&#246;ber, W., Heklau, H., Bruelheide, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf+morphology+of+40+evergreen+and+deciduous+broadleaved+subtropical+tree+species+and+relationships+to+functional+ecophysiological+traits.">Leaf morphology of 40 evergreen and deciduous broadleaved subtropical tree species and relationships to functional ecophysiological traits.</a> Plant Biology. 17 (2), 373-383 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Os parâmetros de regulação dos estômatos extraídas pelo método apresentado neste artigo sublinham a importância de traços estômatos, como a densidade de estômatos eo índice de estômatos. Estes novos relacionamentos demonstrar o potencial de ligar os parâmetros de modelos fisiológicos para morfológicos, anatômicos e folha química traços 20. Em comparação com outros métodos, a presente abordagem tem a vantagem de capturar um valor vpd única e inequívoca em que condutância estomática é regulada para baixo a metade do máximo do g modelado s. De todas as etapas descritas no protocolo os mais críticos são as medições de condutância estomática. Devido à regulamentação multifatorial das condições meteorológicas condutância estomática ambiente tem uma forte influência sobre g S. Medições de condutância estomática na humidade relativa elevada e baixa intensidade de luz pode não ser confiável 21-23. Com relação à morfológicas e Anattraços efec- tuada, o protocolo deve ser sempre adaptados às espécies-alvo incluídas no estudo. Em particular para a análise da densidade óptica, a duração da coloração e clareamento das folhas deve ser variada, dependendo da estrutura da folha e tenacidade. Potenciais limitações do método incluem espécies, para o qual as medições de condutância estomática são impossíveis ou complicado e propenso a erros devido a formas de folha extraordinárias. Isso pode incluir coníferas e gramíneas com lâminas foliares muito estreitas. Nossos resultados confirmam, em parte, a primeira hipótese de uma ligação entre os parâmetros da condutância estomática e características foliares do espectro folha economia (LES), o que corresponde a vários outros estudos. Por exemplo, Poorter e Bongers (2006) 24 relataram uma ligação estreita entre g S e traços representados pelo LES, por exemplo, com g S diminuindo com o aumento da expectativa de vida da folha. Por conseguinte, Schulze et ai. (1994) 1 demonstligações claras avaliado entre teor de nitrogênio foliar e g SMAX. Da mesma forma, Juhrbandt et al. (2004) 25 encontraram relações significativas entre g SMAX e área foliar e de nitrogênio na folha conteúdo. A segunda hipótese de diferenças claras no que diz respeito ao hábito folha não pôde ser confirmada. A alta variação dos parâmetros e características de medição dentro evergreen e hábito folha decídua indicam que o hábito folha não é uma boa descritor do LES. Brodribb e Holbrook (2005) 26 que discutiu estratégias fisiológicas hábito folha e da folha não pode ser inevitavelmente ligados desde ampla variação característica é comum em todos os tipos de hábito folha. A abordagem pode ser alargada a traços e características fisiológicas de outros do que as folhas, por exemplo, para caracteres relacionados à hidráulica xilema órgãos da planta, tais como condutividade hidráulica xilema específico e madeira microscopia traços 27. Da mesma forma, outrostipos de características foliares como derivados de microscopia como a estrutura do parênquima paliçádico e estrutura da camada de cera epicuticular poderiam ser incluídos 28. Em resumo, este estudo confirmou a estreita ligação entre o LES ea regulação dos estômatos. Além disso, o método aqui apresentado revelou facetas de padrões de regulação estomática que não estão relacionados com o LES. Especialmente características foliares específicas, tais como o tamanho dos estômatos, densidade e índice, bem como comprimento veia merecem futura atenção em estudos de plantas funcionais.

Para avançar a compreensão funcional de folhas de plantas, muitos estudos recentes têm tentado relacionar morfológica, anatômica e características foliares química para respostas fisiológicas, como a condutância estomática (g S) 1-4. Além disso, para características foliares, condutância estomática é fortemente afetada por condições ambientais, tais como fotossinteticamente ativa densidade de fluxo de fótons, temperatura do ar e vpd 5. Várias maneiras têm sido propostos para modelar gs - curvas VPD 6-8 que se baseiam principalmente em regressão linear de gs em vpd 6. Em contraste, o modelo apresentado neste estudo regride logits de condutância estomática relativa (isto é, a relação de G S a condutância estomática máxima SMAX g) em VPD e contribui para a não linearidade através da adição de VPD como um termo quadrático regressor. Comparado a outros modelos, o novo modelo permite a derivação de parâmetros que descrevemo vpd em que g S é regulada para baixo sob a escassez de água. Da mesma forma, o VPD é obtido em que G S é máxima. Como tais parâmetros fisiológicos pode ser esperado para ser firmemente ligado a assimilação de carbono 9,10 uma estreita ligação entre esses parâmetros do modelo e as características foliares chave para alocação de nutrientes e de recursos, tal como reflectidas no LES deve ser esperado 3,11. Em consequência, deve haver também uma estreita relação entre as estratégias de regulação dos estômatos com traços LES. Essa relação é esperado em especial para as hábito folha (evergreen contra decídua) como hábito folha é tanto correlacionado com o LES e com eficiência de uso da água 12,13. Espécies perenes tendem a crescer mais lentamente, mas são mais eficientes em ambientes pobres em nutrientes 14. Assim, hábito folha deve traduzir-se em diferentes padrões de regulação dos estômatos, com uma estratégia de uso da água mais conservadoras do que as espécies caducifólias. Comparing um grande conjunto de espécies de árvores de folhas largas em uma situação Jardim comum, as seguintes hipóteses foram testadas: 1) Os parâmetros do modelo de g S - modelos VPD estão ligados a características foliares relacionados com o espectro folha economia. 2) espécies perenes apresentam menor média g S e g SMAX valores que espécies decíduas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SC 1 Porometer</td>
			<td>Decagon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any other porometer is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable ties to mark leaves</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic sample bags</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper sample bags</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>Trotec</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any other is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioskop 2 plus</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any other is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% NaOH</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% KOH</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% H2O2</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malachite green</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranine</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

relating stomatal conductance to leaf functional traits

Características funcionais folha são importantes porque refletem as funções fisiológicas, como a transpiração e assimilação de carbono. Em particular, as características morfológicas de folhas têm o potencial para resumir estratégias de plantas em termos de eficiência do uso da água, padrão de crescimento e utilização de nutrientes. O espectro folha economia (LES) é uma estrutura reconhecida no funcional ecologia vegetal e reflete um gradiente de aumento da área foliar específica (SLA), de nitrogênio nas folhas, fósforo e teor de cátions, e diminuindo o conteúdo foliar de matéria seca (LDMC) e razão de nitrogênio de carbono ( NC). O LES descreve as diferentes estratégias que vão desde a de folhas de curta duração com elevada capacidade fotossintética por massa de folha de folhas de longa duração com baixas taxas de assimilação de carbono à base de massa. No entanto, traços que não estão incluídos no LES pode fornecer informações adicionais sobre a fisiologia da espécie, tais como aqueles relacionados ao controle dos estômatos. Protocolos são apresentados por uma vasta gama de folha functiotraços Nal, incluindo características do LES, mas também características que são independentes do LES. Em particular, um novo método que é apresentado refere comportamento regulamentar das plantas na condutância estomática ao défice de pressão de vapor. Os parâmetros de regulação estomática resultantes pode então ser comparado com o LES e outras características funcionais de plantas. Os resultados mostram que as características funcionais da folha LES também foram preditores válidos para os parâmetros de regulação estomática. Por exemplo, a concentração de carbono foliar foi positivamente relacionado com o déficit de pressão de vapor (DPV) no ponto de inflexão e pelo máximo da curva de condutância-vpd. No entanto, traços que não estão incluídos no LES informação adicionada para explicar os parâmetros de controle estomático: o vpd no ponto de inflexão da curva de condutância-vpd foi menor para as espécies com maior densidade estomática e maior índice estomático. No geral, traços estômatos e veia foram preditores mais poderosos para explicar a regulação dos estômatos than traços utilizados no LES.

Muitos parâmetros de condutância estomática e regulação dos estômatos foram encontrados para ser relacionado para morfológica, anatômica e características foliares químicos. Em seguida, o foco será nos links para VPD no ponto de inflexão, que diminuiu com densidade estomática (p = 0,04) e índice estomático (p = 0,03) e aumentou com o conteúdo da folha de carbono (p = 0,02, Veja a Figura 3). Os resultados mostram que com a redução VPD no ponto de inflexão, houve uma diminuição na densidade estomática e índice estomática. Em contraste, nenhum parâmetro de condutância estomática mostraram uma clara relação ao hábito folha. A alta variação dentro dos dois grupos de hábito folha mostra que diferentes mecanismos de regulação existem tanto dentro do grupo de evergreen e hábitos de folhas decíduas. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52738/52738fig3highres.jpg" width="700" /> Figura Figura 3. Resultado de the ligações entre padrões de traços de regulação da condutância e estomática déficit de pressão de vapor (DPV) no ponto de inflexão da S g -. curva vpd (VpdPoi) como uma função de (A) densidade de estômatos, (B) índice de estômatos, e (C) folha teor de carbono 20. Re-print com a permissão de 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52738/52738fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Relating Stomatal Conductance to Leaf Functional Traits

Desvendando como a fisiologia e morfologia estão ligados permite uma compreensão mais profunda do funcionamento mecanicista das folhas da planta. Nós apresentamos tanto um procedimento para obtenção de parâmetros de regulação dos estômatos a partir de medições de condutância estomática e correlações com características foliares funcionais tradicionais.

Relacionando condutância estomática a Folha atributos funcionais

Leaf functional traits are important because they reflect physiological functions, such as transpiration and carbon assimilation. In particular, ...

relating-stomatal-conductance-to-leaf-functional-traits

Research

JoVE Journal

Biology

19.0K visualizações.  Martin-Luther-University Halle-Wittenberg.  Desvendando como a fisiologia e morfologia estão ligados permite uma compreensão mais profunda do funcionamento mecanicista das folhas da planta. Nós apresentamos tanto um procedimento para obtenção de parâmetros de regulação dos estômatos a partir de medições de condutância estomática e correlações com características foliares funcionais tradicionais. 

Vídeo: Relating Stomatal Conductance to Leaf Functional Traits

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

Claro / escuro Teste de transição para Ratos

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Biologia

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristalizando Proteínas de Membrana para determinação da estrutura usando mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

A abordagem inversa Genética para Teste de Redundância funcional durante a embriogênese

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expressão e purificação do Fibrose Cística proteína transmembranar regulador da condutância na Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method (EFM)

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to achieve a high stomatal conductance (gs) to capture CO2 for photosynthesis, water is lost by transpiration1,2. Water evaporating from the airspaces is replaced from cell walls, in turn drawing water from the xylem of leaf veins, in turn drawing from xylem in the stems and roots. As water is pulled through the system, it experiences hydraulic resistance, creating tension throughout the system and a low leaf water potential (&Psi;leaf). The leaf itself is a critical bottleneck in the whole plant system, accounting for on average 30% of the plant hydraulic resistance3. Leaf hydraulic conductance (Kleaf = 1/ leaf hydraulic resistance) is the ratio of the water flow rate to the water potential gradient across the leaf, and summarizes the behavior of a complex system: water moves through the petiole and through several orders of veins, exits into the bundle sheath and passes through or around mesophyll cells before evaporating into the airspace and being transpired from the stomata. Kleaf is of strong interest as an important physiological trait to compare species, quantifying the effectiveness of the leaf structure and physiology for water transport, and a key variable to investigate for its relationship to variation in structure (e.g., in leaf venation architecture) and its impacts on photosynthetic gas exchange. Further, Kleaf responds strongly to the internal and external leaf environment3. Kleaf can increase dramatically with irradiance apparently due to changes in the expression and activation of aquaporins, the proteins involved in water transport through membranes4, and Kleaf declines strongly during drought, due to cavitation and/or collapse of xylem conduits, and/or loss of permeability in the extra-xylem tissues due to mesophyll and bundle sheath cell shrinkage or aquaporin deactivation5-10. Because Kleaf can constrain gs and photosynthetic rate across species in well watered conditions and during drought, and thus limit whole-plant performance they may possibly determine species distributions especially as droughts increase in frequency and severity11-14.
We present a simple method for simultaneous determination of Kleaf and gs on excised leaves. A transpiring leaf is connected by its petiole to tubing running to a water source on a balance. The loss of water from the balance is recorded to calculate the flow rate through the leaf. When steady state transpiration (E, mmol &bull; m-2 &bull; s-1) is reached, gs is determined by dividing by vapor pressure deficit, and Kleaf by dividing by the water potential driving force determined using a pressure chamber (Kleaf= E /- &Delta;&psi;leaf, MPa)15.
This method can be used to assess Kleaf responses to different irradiances and the vulnerability of Kleaf to dehydration14,16,17.

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method EFM

We describe a relatively rapid (30 min) and realistic method for simultaneously measurement of leaf hydraulic conductance (Kleaf) and stomatal conductance (gs) for transpiring excised leaves. The method can be modified to measure the light and dehydration responses of Kleaf and gs.

Medição de condutividade hidráulica da folha e da condutância estomática e as respostas a irradiância e Desidratação Usando a evaporação Método Flux (EFM)

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ: um plugin ImageJ para semi-automatizado de medição forma de folha

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Purificação da fibrose cística condutância transmembrana Regulador proteína expressa em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular systolic and diastolic function. Measures of ventricular contractility and compliance are obtained through examination of cardiac response to changes in afterload and preload. These techniques were originally developed nearly three decades ago to measure cardiac function in large mammals and humans. The application of these analyses to small mammals, such as mice, has been accomplished through the optimization of microsurgical techniques and creation of conductance catheters. Conductance catheters allow for estimation of the blood pool by exploiting the relationship between electrical conductance and volume. When properly performed, these techniques allow for testing of cardiac function in genetic mutant mouse models or in drug treatment studies. The accuracy and precision of these studies are dependent on careful attention to the calibration of instruments, systematic conduct of hemodynamic measurements and data analyses. We will review the methods of conducting pressure-volume loop experiments using a conductance catheter in mice.

Cardiac pressure-volume loop analysis is the most comprehensive way to measure cardiac function in the intact heart. We describe a technique to perform and analyze cardiac pressure volume loops, using conductance catheters.

Cardiac Pressão-Volume Análise loop usando Conductance Cateteres em Ratos

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems for sperm analysis were developed to measure several parameters and one of the most commonly measured is the sperm motility.
Initially, this computer technology was designed for mammalian species, although it can also be used for fish sperm analysis. Fish have specific features that can affect sperm assessment such as a short motility time after activation and, in some cases, adaptation to lower temperatures. Thus, it is necessary to modify both software and hardware components to make motility analysis more efficient for fish sperm analysis. For mammalian sperm, the heating plate is used to maintain optimal temperatures of spermatozoa. However, for some fish species, it is advantageous to use a lower temperature to prolong the duration of motility, since the sperm remain active for less than 2 min. Therefore, cooling devices are necessary to refrigerate samples at constant temperature over the time of analysis, including on the optical microscope. This protocol describes the analysis of fish sperm motility using software for sperm analysis and new cooling devices to optimize the results.

The present protocol describes a procedure of fish sperm assessment using computer-assisted sperm analysis and cooling devices. The software gives a rapid, accurate and quantitative analysis of fish sperm quality based on spermatozoa motility, which can be a useful tool in aquaculture to improve reproduction success.

Avaliação do esperma de peixe utilizando Software e dispositivos de refrigeração

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...