We are indebted to Xuefei Yang, Sabine Both, Lin Chen and Kaitian Wang for coordinating the fieldwork and establishing the BEF-China experiment. We are also grateful to the whole BEF-China research group for their general support. BEF-China is mainly funded by the German Research Foundation (DFG FOR 891/1 and 2) and funding for this particular project was provided by the German Research Foundation to H.B. (DFG BR 1698/9-2). We are also thankful for the travel grants and summer schools financed by the Sino-German Centre for Research Promotion in Beijing (GZ 524, 592, 698, 699 and 785). In addition we would like to thank David Eichenberg, Michael Staab, Katja Grotius, Silvana Tornack, Lin Chen, and Shouren Zhang for their support in the field and in the lab.

1. conductance stomatique <ol><li> Les mesures de conductance stomatique REMARQUE: Les auteurs fait usage de un type simple de l&#39;état porometer stable (Decagon SC1). La conception de la porometer a l&#39;avantage de petite taille, opération manuelle intuitive et une grande fiabilité. Lors de la mesure de la conductance stomatique dans le domaine, assurez-vous de minimiser la distance entre les individus mesurées pour un cycle répété de mesure d&#39;être le plus efficace possible. </li><li> Choisissez des feuilles de différentes espèces et d&#39;individus selon un modèle reproductible (même hauteur, même exposition, même position au sein de l&#39;usine, si possible qu&#39;à partir du même noeud, et seulement d&#39;une catégorie; soleil ou l&#39;ombre des feuilles, etc.). <ol><li> Seulement mesure laisse en bonne santé, condition non endommagé et entièrement développé. Marquez les feuilles sur les individus (par exemple, avec des attaches de câbles ou du ruban de couleur), afin d&#39;assurer que les mesures répétées sont effectuées sur la même feuille. REMARQUE: Measurements de la conductance stomatique doivent être effectuées que sur la surface de la feuille tout en évitant la nervure centrale et les nervures des feuilles fortes. </li><li> Lancer des mesures dans les premières heures du matin avant le lever de prendre cinq à dix mesures répétées jusqu&#39;à ce que les valeurs de la conductance stomatique montre un net recul à midi. REMARQUE: Un cours quotidien de mesures livrera bonnes données pour analyser les relations entre VPD et la conductance stomatique. </li></ol></li><li> Mesures VPD <ol><li> Avec chaque mesure de g S, enregistrer la température et l&#39;humidité relative de préférence avec des enregistreurs portables pour mesurer directement les conditions à la position de la même feuille. Pour le calcul du déficit de pression de vapeur, utiliser la formule Août-Roche 15 Magnus. </li></ol></li></ol><img alt="Equation 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52738/52738eq1.jpg" width="300" /> = saturation à la pression de la vapeur d&#39;eau e de [hPa] <ol start="4"><li> Modèle S g - réponse vpj <ol><li> Maintenant en espèces sages terrain toutes les données g de S contre vpj, combinant tous les cours quotidiens de feuilles individuelles en une seule analyse par espèce. Extraire la valeur maximale observée à partir des données de la conductance stomatique par la recherche de la valeur maximale. Pour redimensionner le modèle pour les espèces-sages comparabilité, diviser les valeurs observées par la valeur maximale observée pour cette espèce (g S / g SMAX). </li><li> Pour chaque espèce, régresser les logits de g S (S g / g SMAX) VPD et le terme quadratique de vpj l&#39;aide d&#39;un modèle linéaire généralisé avec une distribution d&#39;erreur binomiale (a, b et c représentent les paramètres de régression): </li></ol></li></ol><img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/52738/52738eq2.jpg" width="300" /><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52738/52738fig1highres.jpg" width = &quot;700&quot; /&gt; Figure 1. Exemple des valeurs tracées et le modèle ajusté pour g S -. Vpj La conductance stomatique tracée en fonction du déficit de pression de vapeur pour les espèces Liquidambar formosana. Points vides représentent les valeurs observées. (A) la conductance stomatique maximale, le SPV à la conductance stomatique maximale et moyenne conductance stomatique ont été extraites de la conductance absolue ainsi non réduite stomatique (g S) de données. (B) les données de conductance stomatique en écailles (S g / g SMAX) ont été tracées pour extraire les paramètres relatifs (représentés par des points noirs) 20. Re-print avec la permission de 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52738/52738fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52738/52738fig2highres.jpg" width = &quot;400&quot; /&gt; Figure 2. Tous les modèles ajustés pour toutes les espèces. Graphiques de modèle pour les données de la conductance stomatique à la régression vpj pour toutes les espèces. Evergreen espèces sont représentées par des lignes noires, espèces à feuilles caduques par des lignes rouges 20. Re-imprimer avec la permission de 20. NOTE: En utilisant les logits lieu de régresser g S directement à vpj, mène au point qui a modelé les valeurs maximales ne dépassent pas g SMAX et que g S se rapproche de 0 à haute vpj. <ol start="5"><li> Extrait paramètre de la régulation stomatique pour chaque espèce <ol><li> On calcule les valeurs de SMAX g modélisée absolus (MaxFit sur ​​la figure 1B). Pour ce faire, calculer la vpj à conductance stomatique maximale de fixer la première dérivée de 1.4.2 à zéro, ce qui donne vpj gsMaxFit = -b / 2a. Insérez vpj gsMaxFit dans la formule de 1.4.2 et élever à la puissance de l&#39;e pour obtenir MaxFit. Calculer la mean de toutes les mesures de conductance par espèces (voir la figure 1A). REMARQUE: Utilisez un logiciel statistique R (http://www.r-project.org). </li><li> Pour calculer des valeurs relatives, du modèle réduit (g S / g SMAX), extraire la conductance stomatique et les valeurs VPD pour les deux points suivants: (1) la conductance stomatique et vpj au maximum du modèle (MaxFit) et (2) vpj au second point d&#39;inflexion de la courbe (voir la figure 1B). Multipliez ces valeurs par g SMAX pour obtenir des valeurs absolues g de S pour ces points. Voir Figure 2 pour une superposition complète des modèles simples de tous les 39 espèces analysées. </li></ol></li></ol> 2. Mesures de stomatiques Traits <ol><li> Prélever des échantillons de préférence de exactement les mêmes feuilles qui ont été utilisées pour les mesures de conductance stomatique. Si cela est impossible, d&#39;appliquer la même procédure de sélection qui a été appliquée pour choisir les feuillespour les mesures de la conductance stomatique, de préférence sur les mêmes individus. </li><li> Appliquer une fine couche de incolores, séchage rapide vernis à ongles (test différentes marques, certains sont plus appropriés que d&#39;autres) à un échantillon frais. Si les échantillons ne peuvent pas être traitées immédiatement, rangez-les dans 70% d&#39;alcool. Après le vernis à ongles a séché, retirez délicatement l&#39;impression de partir de la feuille et de procéder à l&#39;analyse microscopique, comme avec un échantillon de feuille normale. NOTE: Dans le cas de feuilles à haute densité de trichomes une étape précédente de l&#39;application de l&#39;hydroxyde de sodium ou une solution 1: 1 d&#39;acide acétique et de l&#39;oxygène de peroxyde peut conduire à de meilleurs résultats. </li><li> Analyse au microscope optique <ol><li> Connectez un appareil photo à un microscope optique capable de grossissement 40X à 400X entre. Après l&#39;appareil est connecté à un microscope, correspondre les photos prises à l&#39;agrandissement optique et de la résolution de l&#39;image, par exemple, à l&#39;aide d&#39;une échelle. </li><li> Employant open source image logiciel de traitement comme ImageJ 16 analyser ces images. <ol><li> Dessiner une forme avec l&#39;outil de forme de l&#39;outil d&#39;analyse d&#39;image sur l&#39;image dans une zone sans poussière, empreintes de pouce, les zones endommagées, ou de grandes nervures des feuilles. Comptez stomates dans ce domaine et au total d&#39;au moins 50.000 um 2 par échantillon. </li><li> Mesurer la garde stomatique longueur de la cellule et de la longueur des pores. Calculer le nombre de stomates par mm 2. Calculer indice stomatique comme le rapport de la densité des stomates à épidermiques nombre de cellules par mm 2. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Évaluation de la veine de la feuille Traits REMARQUE: Pour l&#39;évaluation des traits feuille de veine, un protocole de Sack un &amp; Scoffoni 17 a été employé modifié. <ol><li> La préparation des échantillons REMARQUE: Pour optimiser la visibilité des nervures des feuilles, les feuilles sont d&#39;abord blanchi puis coloré avec safranine et vert de malachite. <ol><li> Pour blanchir la leaves, les laisser au moins 72 heures dans 50% solution de décolorant (test différentes marques, à nouveau certains pourraient mieux travailler). En variante, utiliser une solution de NaOH à 5% ou une solution de KOH à 10% ou 25% de H 2 O 2 solution. </li><li> Chauffer la solution jusqu&#39;à 30 ° C ou de combiner les différentes solutions de l&#39;étape 3.1.1 pour de meilleurs effets. Rincez plusieurs fois à l&#39;eau par la suite. Adapter le processus de blanchiment pour les espèces spécifiques, en fonction de leurs caractéristiques des feuilles. NOTE: Plus épais feuilles peuvent avoir besoin de périodes de bain de solution et les solutions ou plus agressifs plus longues. Feuilles minces et plus tendres peuvent être blanchies à un degré satisfaisante en moins de 72 heures. </li><li> Pour colorer les feuilles les placer dans 100% d&#39;éthanol. Les colorer pendant 2 - 30 min dans une solution de safranine 1%. Pour améliorer la coloration, ajouter un traitement supplémentaire avec 1% de solution de vert de malachite seulement pour quelques secondes. Adapter le protocole à chaque espèce en termes de calendrier et de l&#39;intensité pour atteindre des résultats optimaux. Rincer soisieurs fois dans l&#39;eau par la suite. Si les feuilles sont profondément teinté, un certain temps dans l&#39;éthanol ou décolorant peut aider. </li></ol></li><li> L&#39;analyse des échantillons <ol><li> Balayez les feuilles avec un scanner de rétroéclairage à une résolution de 1200 dpi ca.. Faites correspondre les scans prises pour la résolution de l&#39;image, par exemple, à l&#39;aide d&#39;une échelle, pour assurer que la longueur de pixel peut être retracée à des mesures de longueur absolue de la feuille numérisée. </li><li> Mesurer zone, la circonférence, la longueur et la largeur des feuilles. Calculer plusieurs indices, par exemple, la longueur / largeur et la circonférence 2 / région. Découpez un rectangle 1 par 1 cm sur le centre de l&#39;image. Mesurer le diamètre des veines de premier et de second ordre (ne pas inclure le principal milieu veine). Mesurer la longueur de toutes les veines de premier ordre dans ce quadrat (densité de veine). </li></ol></li></ol> 4. évaluation d&#39;autres feuilles Traits NOTE: Asses typiques traits foliaires tels que spécifiquesurface foliaire (SLA), la teneur en matière sèche des feuilles (de LDMC), la surface foliaire, contenu de l&#39;élément, feuille habitude, feuille pinnation, feuille type composé, feuille type de marges, etc. suivants établis protocoles 18,19. <ol><li> Traits de feuilles d&#39;observation <ol><li> Évaluer pinnation des feuilles, type de composé, feuille type de marge et la présence de pseudonectaires 18,19 par l&#39;observation sur le terrain. </li></ol></li><li> Des feuilles traits analytiques <ol><li> Recueillir des échantillons de feuilles fraîches, de préférence sur les mêmes individus que ceux utilisés pour les autres mesures, pour la détermination de la surface foliaire spécifique (SLA), la surface foliaire et le contenu de la feuille de matière sèche (LDMC) 18,19. Après 48 h dans l&#39;étuve à 80 ° C, de mesurer le contenu et les ratios élément, de préférence sur les mêmes feuilles. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Les paramètres de régulation stomatique extraites par la méthode présentée dans ce document soulignent l&#39;importance de traits de stomates, tels que la densité des stomates et l&#39;indice de stomates. Ces nouveaux rapports démontrent le potentiel de lier les paramètres de modèles physiologiques pour morphologiques, anatomiques et feuilles chimique traits 20. Comparé à d&#39;autres méthodes, l&#39;approche actuelle porte l&#39;avantage de capturer une valeur unique et non équivoque vpj à laquelle la conductance stomatique est régulée à la baisse à la moitié du maximum du g modélisé. De toutes les étapes décrites dans le protocole les plus critiques sont les mesures de conductance stomatique. En raison de la réglementation multifactorielle des conditions météorologiques conductance stomatique ambiante avoir une forte influence sur la g S. Mesures de conductance stomatique à une humidité relative élevée et à faible intensité de la lumière peuvent être peu fiables 21-23. En ce qui concerne morphologiques et anatomical traits, le protocole doivent toujours être adaptées à l&#39;espèce cible inclus dans l&#39;étude. En particulier dans l&#39;analyse de la densité de la veine, la durée de blanchiment et la coloration des feuilles devrait être modifiée, en fonction de la structure de feuille et la ténacité. Limitations potentielles de la méthode comprennent les espèces pour lesquelles les mesures de la conductance stomatique sont impossibles ou complexe et sujette aux erreurs en raison de formes de feuilles extraordinaires. Cela peut inclure des conifères et des herbes avec des lames de feuilles très étroites. Nos résultats confirment en partie la première hypothèse d&#39;un lien entre les paramètres de conductance stomatique et traits foliaires du spectre feuille de l&#39;économie (LES), qui correspond à plusieurs autres études. Par exemple, Poorter et Bongers (2006) 24 ont signalé un lien étroit entre la g S et les traits représentés par les ERP, par exemple, avec g S diminuant avec l&#39;augmentation de la durée de vie de la feuille. En conséquence, Schulze et al. (1994) 1 demonstdes liens clairs entre notés teneur en azote des feuilles et g SMAX. De même, Juhrbandt et al. (2004) 25 ont trouvé des relations significatives entre g SMAX et la surface foliaire et de l&#39;azote foliaire contenu. Notre deuxième hypothèse de différences claires en ce qui concerne la feuille habitude n&#39;a pu être confirmée. La forte variation dans les paramètres et les caractères mesurés au sein de feuilles persistantes et à feuilles caduques habitude de feuilles indiquent que la feuille habitude est pas un bon descripteur de l&#39;ERP. Brodribb et Holbrook (2005) 26 ont discuté cette habitude des feuilles et des stratégies physiologiques peuvent pas être connectés depuis inévitablement large variation de trait est commun à tous les types de feuilles habitude. L&#39;approche peut être étendue à des traits et des caractéristiques physiologiques des organes végétaux autres que les feuilles, par exemple à des traits liés à l&#39;hydraulique du xylème tels que xylème spécifique conductivité hydraulique et le bois de microscopie traits 27. De même, d&#39;autrestypes de traits foliaires comme dérivée de la microscopie tels que la structure de palissade parenchyme et la structure de couche de cire épicuticulaire 28 pourraient être inclus. En résumé, cette étude confirme le lien étroit entre les ERP et la régulation stomatique. En outre, la méthode présentée ici a révélé facettes de modèles de régulation stomatique qui ne sont pas liées à l&#39;ERP. Surtout traits foliaires spécifiques tels que la taille des stomates, de la densité et de l&#39;indice ainsi que la longueur de la veine méritent une attention future dans les études de plantes fonctionnels.

Pour faire avancer la compréhension fonctionnelle des feuilles de la plante, de nombreuses études récentes ont tenté de relier morphologique, anatomique et traits foliaires chimique à des réponses physiologiques, comme la feuille de conductance stomatique (g S) 1-4. En outre, à des traits de feuilles, la conductance stomatique est fortement influencée par les conditions environnementales, telles que la densité de flux de photons photosynthétiquement actif, la température de l&#39;air et vpj 5. Différents moyens ont été proposés pour modéliser gs - courbes vpj 6-8 qui sont principalement basés sur la régression linéaire de gs sur vpj 6. En revanche, le modèle présenté dans cette étude régresse logits de la conductance stomatique relative (à savoir le rapport de g S au maximum de la conductance stomatique g SMAX) sur VPD et représente la non-linéarité en ajoutant vpj comme un terme de variable explicative quadratique. Comparé à d&#39;autres modèles, le nouveau modèle permet pour dériver des paramètres qui décriventVPD à laquelle g S est régulée à la baisse sous la pénurie d&#39;eau. De même, le SPV est obtenu à laquelle g S est maximale. Comme ces paramètres physiologiques peuvent être devraient être étroitement lié à l&#39;assimilation de carbone 9,10 un lien étroit entre ces paramètres du modèle et les traits principaux de la feuille à la répartition des nutriments et des ressources telles que reflétées dans les ERP devrait être prévu 3,11. En conséquence, il devrait y avoir également une relation étroite entre les stratégies de régulation stomatique avec des traits ERP. Une telle relation est prévu en particulier pour les feuilles habitude (feuillage persistant par rapport à feuilles caduques) comme feuille habitude est à la fois corrélée avec les ERP et avec une utilisation efficace de l&#39;eau 12,13. Evergreen espèces ont tendance à croître plus lentement, mais sont plus efficaces dans des environnements pauvres en éléments nutritifs 14. Ainsi, la feuille habitude devrait se traduire par différents modes de régulation stomatique, avec une stratégie d&#39;utilisation de l&#39;eau plus conservatrice que les espèces à feuilles caduques. Comparation un grand ensemble d&#39;espèces d&#39;arbres à feuilles larges dans une situation de jardin commun, les hypothèses suivantes ont été testées: 1) Modèle paramètres de g S - modèles VPD sont reliées à des traits de feuilles liées au spectre feuille de l&#39;économie. 2) espèces Evergreen ont moyenne inférieure g S et g SMAX valeurs que les espèces à feuilles caduques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SC 1 Porometer</td>
			<td>Decagon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any other porometer is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable ties to mark leaves</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic sample bags</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper sample bags</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>Trotec</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any other is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioskop 2 plus</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any other is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% NaOH</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% KOH</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% H2O2</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malachite green</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranine</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

relating stomatal conductance to leaf functional traits

Traits fonctionnels foliaires sont importantes parce qu&#39;elles reflètent les fonctions physiologiques, tels que la transpiration et l&#39;assimilation de carbone. En particulier, les traits morphologiques des feuilles ont le potentiel pour résumer les stratégies de plantes en termes d&#39;utilisation efficace de l&#39;eau, modèle de croissance et de l&#39;utilisation des nutriments. Le spectre feuille de l&#39;économie (LES) est un cadre reconnu en écologie végétale fonctionnelle et reflète un gradient d&#39;augmentation de la surface foliaire spécifique (SLA), azote foliaire, teneur en phosphore et de cations, et en diminuant le contenu de la feuille de matière sèche (LDMC) et le rapport de l&#39;azote de carbone ( CN). Le LES décrit les différentes stratégies allant de celle des feuilles de courte durée avec la capacité photosynthétique élevé par la masse foliaire sur les feuilles à long terme avec des taux d&#39;assimilation de carbone faibles fondées sur la masse. Cependant, les traits qui ne sont pas inclus dans les ERP pourraient fournir des informations supplémentaires sur la physiologie de l&#39;espèce, tels que ceux liés au contrôle stomatique. Les protocoles sont présentés pour une large gamme de feuilles functiotraits Nal, y compris les traits de la LES, mais aussi des traits qui sont indépendants de la LES. En particulier, une nouvelle méthode est introduit qui concerne le comportement de réglementation des plantes dans la conductance stomatique au déficit de pression de vapeur. Les paramètres résultant de régulation stomatique peuvent ensuite être comparés à l&#39;ERP et d&#39;autres traits fonctionnels de plantes. Les résultats montrent que les traits de feuille fonctionnelle de l&#39;ERP étaient également des prédicteurs valables pour les paramètres de régulation stomatique. Par exemple, la concentration de carbone de la feuille était positivement corrélée au déficit de pression de vapeur (DPV) au point d&#39;inflexion et le maximum de la courbe de conductance MEV. Cependant, les traits qui ne sont pas inclus dans les ERP ajoutés informations pour expliquer les paramètres de contrôle stomatique: le SPV au point d&#39;inflexion de la courbe de conductance-vpj était plus faible pour les espèces dont la densité stomatique plus haut indice de stomates. Dans l&#39;ensemble, les traits de stomates et la veine étaient des prédicteurs plus puissants pour expliquer la régulation stomatique than traits utilisés dans les ERP.

De nombreux paramètres de régulation de la conductance stomatique et stomatique ont été trouvés être lié à morphologique, anatomique et traits foliaires chimiques. Dans ce qui suit, l&#39;accent sera mis sur les liens pour VPD au point d&#39;inflexion, qui a diminué avec la densité des stomates (p = 0,04) et l&#39;indice stomatique (p = 0,03) et augmente avec la teneur en carbone de la feuille (p = 0,02, Voir Figure 3). Les résultats montrent que avec la diminution vpj au point d&#39;inflexion il y avait une diminution de la densité stomatique et l&#39;indice stomatique. En revanche, aucun paramètre de la conductance stomatique a montré une relation claire à la feuille habitude. La forte variation dans les deux groupes de feuilles habitude montre que différents mécanismes de régulation existent à la fois dans le groupe de feuilles persistantes et à feuilles caduques habitudes. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52738/52738fig3highres.jpg" width="700" /> Figure Figure 3. Résultat èmeliens électroniques entre les modèles de traits de régulation et de feuilles conductance stomatique déficit de pression de vapeur (DPV) au point d&#39;inflexion de la g S -. courbe VPD (VpdPoi) en fonction de (A) la densité des stomates, (B) l&#39;indice de stomates, et (C) la feuille teneur en carbone 20. Re-print avec la permission de 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52738/52738fig3highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Relating Stomatal Conductance to Leaf Functional Traits

Démêler comment physiologie et la morphologie sont liés permet une meilleure compréhension du fonctionnement mécanique de feuilles de la plante. Nous présentons à la fois une procédure pour dériver des paramètres de régulation stomatique à partir de mesures de la conductance stomatique et des corrélations avec des traits traditionnels de feuille fonctionnelle.

Concernant la conductance stomatique de feuilles traits fonctionnels

Leaf functional traits are important because they reflect physiological functions, such as transpiration and carbon assimilation. In particular, ...

relating-stomatal-conductance-to-leaf-functional-traits

Research

JoVE Journal

Biology

18.9K vues.  Martin-Luther-University Halle-Wittenberg.  Démêler comment physiologie et la morphologie sont liés permet une meilleure compréhension du fonctionnement mécanique de feuilles de la plante. Nous présentons à la fois une procédure pour dériver des paramètres de régulation stomatique à partir de mesures de la conductance stomatique et des corrélations avec des traits traditionnels de feuille fonctionnelle. 

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Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expression et purification de la protéine transmembranaire de la fibrose kystique conductance Regulator dans Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Recherche

Biologie

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method (EFM)

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to achieve a high stomatal conductance (gs) to capture CO2 for photosynthesis, water is lost by transpiration1,2. Water evaporating from the airspaces is replaced from cell walls, in turn drawing water from the xylem of leaf veins, in turn drawing from xylem in the stems and roots. As water is pulled through the system, it experiences hydraulic resistance, creating tension throughout the system and a low leaf water potential (&Psi;leaf). The leaf itself is a critical bottleneck in the whole plant system, accounting for on average 30% of the plant hydraulic resistance3. Leaf hydraulic conductance (Kleaf = 1/ leaf hydraulic resistance) is the ratio of the water flow rate to the water potential gradient across the leaf, and summarizes the behavior of a complex system: water moves through the petiole and through several orders of veins, exits into the bundle sheath and passes through or around mesophyll cells before evaporating into the airspace and being transpired from the stomata. Kleaf is of strong interest as an important physiological trait to compare species, quantifying the effectiveness of the leaf structure and physiology for water transport, and a key variable to investigate for its relationship to variation in structure (e.g., in leaf venation architecture) and its impacts on photosynthetic gas exchange. Further, Kleaf responds strongly to the internal and external leaf environment3. Kleaf can increase dramatically with irradiance apparently due to changes in the expression and activation of aquaporins, the proteins involved in water transport through membranes4, and Kleaf declines strongly during drought, due to cavitation and/or collapse of xylem conduits, and/or loss of permeability in the extra-xylem tissues due to mesophyll and bundle sheath cell shrinkage or aquaporin deactivation5-10. Because Kleaf can constrain gs and photosynthetic rate across species in well watered conditions and during drought, and thus limit whole-plant performance they may possibly determine species distributions especially as droughts increase in frequency and severity11-14.
We present a simple method for simultaneous determination of Kleaf and gs on excised leaves. A transpiring leaf is connected by its petiole to tubing running to a water source on a balance. The loss of water from the balance is recorded to calculate the flow rate through the leaf. When steady state transpiration (E, mmol &bull; m-2 &bull; s-1) is reached, gs is determined by dividing by vapor pressure deficit, and Kleaf by dividing by the water potential driving force determined using a pressure chamber (Kleaf= E /- &Delta;&psi;leaf, MPa)15.
This method can be used to assess Kleaf responses to different irradiances and the vulnerability of Kleaf to dehydration14,16,17.

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method EFM

We describe a relatively rapid (30 min) and realistic method for simultaneously measurement of leaf hydraulic conductance (Kleaf) and stomatal conductance (gs) for transpiring excised leaves. The method can be modified to measure the light and dehydration responses of Kleaf and gs.

Mesure de la conductance hydraulique foliaire et la conductance stomatique et de leurs réponses à d&#39;irradiance et de déshydratation en utilisant la méthode par évaporation Flux (EFM)

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Purification de la fibrose kystique régulateur de la conductance transmembranaire protéine exprimée dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular systolic and diastolic function. Measures of ventricular contractility and compliance are obtained through examination of cardiac response to changes in afterload and preload. These techniques were originally developed nearly three decades ago to measure cardiac function in large mammals and humans. The application of these analyses to small mammals, such as mice, has been accomplished through the optimization of microsurgical techniques and creation of conductance catheters. Conductance catheters allow for estimation of the blood pool by exploiting the relationship between electrical conductance and volume. When properly performed, these techniques allow for testing of cardiac function in genetic mutant mouse models or in drug treatment studies. The accuracy and precision of these studies are dependent on careful attention to the calibration of instruments, systematic conduct of hemodynamic measurements and data analyses. We will review the methods of conducting pressure-volume loop experiments using a conductance catheter in mice.

Cardiac pressure-volume loop analysis is the most comprehensive way to measure cardiac function in the intact heart. We describe a technique to perform and analyze cardiac pressure volume loops, using conductance catheters.

Cardiac pression-volume Analyse boucle aide de la conductance cathéters chez la souris

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular ...

Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants (Atta) in Laboratory Conditions

Ants are one of the most biodiverse groups of animals on the planet and inhabit different environments. The maintenance of ant colonies in controlled environments enables an enriched comprehension of their biology that can contribute to applied research. This practice is usually employed in population control studies of species that cause economic loss, such as Atta ants. To cultivate their mutualistic fungus, these leaf-cutting ants collect leaves and for this are considered agricultural pests widely distributed throughout the American continent. They are highly socially organized and inhabit elaborated underground nests composed of a variety of chambers. Their maintenance in a controlled environment depends on a daily routine of several procedures and frequent care that are described here. It starts with the collection of queens during the reproductive season (i.e., nuptial flight), which are then individually transferred to plastic containers. Due to the high mortality rate of queens, a second collection can be carried out about 6 months after the nuptial flight, when incipient nests with developed fungus wad are excavated, hand-picked, and placed in plastic containers. In the laboratory, leaves are daily provided to established colonies, and ant-produced waste is weekly removed along with remaining dry plant material. As the fungus garden keeps growing, colonies are transferred to different types of containers according to the experimental purpose. Leaf-cutting ant colonies are placed in interconnected containers, representing the organizational system with functional chambers built by those insects in nature. This setup is ideal to monitor factors such as waste amount, fungus garden health, and the behavior of workers and queen. Facilitated data collection and more detailed observations are considered the greatest advantage of keeping ant colonies in controlled conditions.

Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants Atta in Laboratory Conditions

Here, a protocol is described to successfully collect and maintain healthy Atta (Hymenoptera: Formicidae) ant colonies in laboratory conditions. Additionally, different nest types and configurations are detailed together with possible experimental procedures.

Collecte et entretien à long terme des fourmis coupeuses de feuilles (Atta) dans des conditions de laboratoire

Ants are one of the most biodiverse groups of animals on the planet and inhabit different environments. The maintenance of ant colonies in controlled ...

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant productivity and survival. As such, understanding the mechanisms by which stomata develop and pattern has tremendous agronomic value. This paper describes two phenotypic methods using Arabidopsis cotyledons that can be used to characterize the genes controlling stomatal development and patterning. Presented first are procedures for analyzing the stomatal phenotypes using toluidine blue O-stained cotyledons. This method is fast and reliable and does not require the use of epidermal peels, which are widely used for phenotypic analyses but require specialized training. Due to the presence of multiple cysteine residues, the identification and generation of bioactive EPF peptides that have a role in stomatal development have been challenging. Thus, presented second is a procedure used to identify stomatal ligands and monitor their biological activity by bioassays. The main advantage of this method is that it produces reproducible data relatively easily while reducing the amount of peptide solution and the time required to characterize the role of the peptides in controlling stomatal patterning and development. Overall, these well-designed protocols enhance the efficiency of studying the potential stomatal regulators, including cysteine-rich secretory peptides, which require highly complex structures for their activity.

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

This paper describes two phenotyping methods without the use of epidermal peels to characterize the genes controlling stomatal development. The first method demonstrates how to analyze a stomatal phenotype using a toluidine blue O-stained plant epidermis. The second method describes how to identify stomatal ligands and monitor their biological activities.

Identification des gènes impliqués dans le développement stomatique par notation du phénotype épidermique

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant ...

A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar tolerance to environmental challenges. An experimental protocol is presented for setting up the hydroponic system, plantlet growth, RSA spreading, and imaging. The approach used a magenta box-based hydroponic system containing polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. Experimental settings are exemplified by assessing the RSA of the plantlets under varying nutrient (phosphate [Pi]) supply. The system was established to examine the RSA of Arabidopsis, but it is readily adaptable to study other plants like Medicago sativa (Alfalfa). Arabidopsis thaliana (Col-0) plantlets are used in this investigation as an example to understand the plant RSA. Seeds are surface sterilized by treating ethanol and diluted commercial bleach, and kept at 4 &#176;C for stratification. The seeds are germinated and grown on a liquid half-MS medium on a polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. The plantlets are grown under standard growth conditions for the desired number days, gently picked out from the mesh, and submersed in water-containing agar plates. Each root system of the plantlets is spread gently on the water-filled plate with the help of a round art brush. These Petri plates are photographed or scanned at high resolution to document the RSA traits. The root traits, such as primary root, lateral roots, and branching zone, are measured using the freely available ImageJ software. This study provides techniques for measuring plant root characteristics in controlled environmental settings. We discuss how to (1) grow the plantlets, and collect and spread root samples, (2) obtain pictures of spread RSA samples, (3) capture the images, and (4) use image analysis software to quantify root attributes. The advantage of the present method is the versatile, easy, and efficient measurement of the RSA traits.

We use simple laboratory tools to examine the root system architecture (RSA) of Arabidopsis and Medicago. The plantlets are grown hydroponically over mesh and spread using an art brush to reveal the RSA. Images are taken using scanning or a high-resolution camera, then analyzed with ImageJ to map traits.

Un protocole simple pour cartographier les caractéristiques de l’architecture du système racinaire végétal

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar ...

Etude spatio-temporelle de la dynamique d’ERL1 via l’imagerie confocale

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane system. This includes the secretory transport of newly synthesized proteins to the cell surface or the outside of the cell, the endocytic transport of extracellular cargoes or plasma membrane components into the cell, and the recycling or shuttling transport of cargoes between the subcellular organelles, etc. Membrane trafficking events are crucial to the development, growth, and environmental adaptation of all eukaryotic cells and, thus, are under stringent regulation. Cell-surface receptor kinases, which perceive ligand signals from the extracellular space, undergo both secretory and endocytic transport. Commonly used approaches to study the membrane trafficking events using a plasma membrane-localized leucine-rich-repeat receptor kinase, ERL1, are described here. The approaches include plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup. To monitor the spatiotemporal regulation of ERL1, this study describes the co-localization analysis between ERL1 and a multi-vesicular body marker protein, RFP-Ara7, the time series analysis of these two proteins, and the z-stack analysis of ERL1-YFP treated with the membrane trafficking inhibitors brefeldin A and wortmannin.

Pleins feux sur l’auteur : Méthodes basées sur l’image pour étudier les événements de trafic membranaire dans les cellules de la lignée stomatique  

Several commonly used methods are introduced here to study the membrane trafficking events of a plasma membrane receptor kinase. This manuscript describes detailed protocols including the plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup.

Méthodes basées sur l’image pour étudier les événements de trafic membranaire dans les cellules de la lignée stomatique

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...