The authors would like to acknowledge funding from the Horserace Betting Levy Board U.K. (grant number 721) and VetCell BioScience Ltd, U.K. and by Consejer&#236;a de Innovaci&#242;n, Ciencia y Empresa, Junta de Andaluc&#236;a, Spain.

Los casos descritos en este documento se realizaron siguiente permiso ético otorgado por el Comité de Ética Animal y el Bienestar del Colegio de Veterinarios de Málaga, España, y el Royal Veterinary College, North Mymms, Reino Unido Los procedimientos utilizados en los caballos se basan en los protocolos aprobados que son utilizado en la clínica en caballos que reciben terapias basadas en células madre, que incluye la sedación, la aspiración de médula ósea, la inyección intra-tendinosa, perfusión regional, la inyección intravenosa, la gestión y el tratamiento del dolor post-procedimiento y el seguimiento después de la implantación. 1. Disposiciones clave para hacerse con anticipación <ol><li> Busque ética institucional y la aprobación del bienestar animal y cumplir con los requisitos legales locales antes de comenzar el trabajo. </li><li> Buscar la aprobación institucional para trabajar con radiaciones ionizantes según lo dictado por las regulaciones locales y legales, incluyendo el nivel adecuado de protección del personal y el medio ambiente y la eliminación de contamresiduos inated. </li><li> Utilice los siguientes criterios de inclusión: caballos presentan con una lesión sobreesfuerzo no traumática (tendinopatía o desmopatía) al tendón digitales flexor superficial de la extremidad anterior y las lesiones resultantes de un defecto en el tendón y el defecto está rodeado de tendón y / o paratenon intacta . Nota: El examen y el diagnóstico de este tipo de lesiones y la preparación clínica de los caballos para la implantación de células se ha detallado en otra parte 6,15. Nota: El aislamiento y expansión en cultivo de BMMSC derivado de la médula ósea de los caballos se ha detallado previamente 6,16. El protocolo actual para inyectar BMMSC por lesiones TFDS en el caballo utiliza 10 millones de células por ml 4 de sobrenadante de médula ósea autólogo (BMS) 16. </li><li> Utilice células que han sufrido no más de 4 pasajes para la implantación in vivo para evitar la posible fenotipo celular o alteraciones genéticas asociadas con el número de alto pasaje cells. </li><li> Entregar el número requerido de células en el BMS (a menos de 24 hr en una caja de enfriamiento a las 4 - 8 ° C) a la clínica veterinaria, donde la implantación de células se va a realizar. Nota: El uso clínico de células madre mesenquimales en el sobrenadante de médula ósea es un procedimiento patentado propiedad de ReCellerate Inc (EE.UU.) y su uso puede requerir la autorización. Nota: Tc-99m es un emisor gamma (140 keV) con una vida media relativamente corta (6,0058 hr, por lo tanto, casi el 94% de los que se descompone a su forma estable de 99 Tc en 24 hr). La energía gamma hace que sea adecuado para la detección mediante cámaras gamma (gammagrafía) y los cortos resultados de vida media en el tiempo de exposición de radiación muy limitado tanto para el caballo y el personal de manejo de animales. Este protocolo describe el etiquetado in situ de células utilizando Tc-99m-HMPAO [HMPAO marcado con Tc-99m (como pertecnetato de sodio)]. </li><li> Pide el Tc-99m fresca del proveedor de tal manera que se entrega y se utiliza para etiquetar el ingenio de las célulashin 2 hr de elución del generador de Tc-99m. Asegúrese de que el Tc-99m se suministra como 1 GBq en (tampón estándar del proveedor) a 1 ml de solución. </li><li> Utilice todos los tampones a RT. Realice el procedimiento de etiquetado, la implantación de las células y de imagen (gammagrafía) en un ambiente de contención de isótopos con todo el equipo se limpia con toallitas con alcohol antes del inicio de los trabajos. </li></ol> 2. Preparación del Caballo y La ecografía de la extremidad anterior del tendón <ol><li> Ecografías Registro de primer ingreso por lesiones (cuando es aspirado de médula ósea) y luego en el punto de tiempo en que se inyectan células radiomarcados. </li><li> Realizar la ecografía y la implantación de las células con el caballo la carga de peso de manera uniforme en un puesto de pie y bajo sedación (en vez de la anestesia general). Administrar la sedación usando una mezcla de detomidina HCl y tartrato de butorfanol, cada uno a 0,01 a 0.02 mg / kg IV. Nota: La recuperación es rápida y post-quirúrgica de tratamiento no requiereConsideraciones Especiales. </li><li> Después de la anestesia perineural se aplica (paso 2.6) en el miembro afectado, mantener el caballo en la estación bajo sedación para reducir el movimiento del caballo durante el tratamiento. Compruebe visualmente el nivel adecuado de sedación juzgar por la posición de la cabeza baja y la actitud del caballo y que el caballo es cómodo durante la inyección de células y los movimientos de la cámara gamma durante la adquisición de imágenes gammagráficas. Nota: No es necesario aplicar ungüento veterinario en los ojos (para prevenir la sequedad) porque bajo sedación parpadeo no se ve afectada y el caballo es capaz de mantener la hidratación de los ojos. El seguimiento después de la implantación de las células no es invasivo (ecografía y gammagrafía gamma). </li><li> Clip de cerca el pelo que recubre el tendón (con cortar el pelo de caballo) y luego limpie el área recortada utilizando una combinación de un lavado quirúrgico clorhexidina y finalmente alcohol. </li><li> Aplicar gel de acoplamiento acústico al área yanalizar metódicamente para grabar las exploraciones de la región metacarpiana palmar completa, niveles secuencialmente marcadas 1 - 7 de 17, con un transductor lineal (12 MHz o similar) para obtener serie transversal en la incidencia y las imágenes longitudinales. Almacenar las imágenes digitalmente de modo que el área de sección transversal y la zona de lesión máxima 4 se pueden obtener con la ayuda de software de análisis de imagen. </li><li> Prepare el área que recubre los nervios palmares inmediatamente distal al carpo para inyección aséptica de anestésico local para garantizar la desensibilización completa de la piel que recubre el tendón y el tendón flexor digital superficial. Inyectar 2 ml de mepivicaine tanto por vía subcutánea y adyacente a los nervios palmares (en su localización sub-fascial) entre los tendones flexores y el ligamento suspensorio inmediatamente distal al carpo en ambos lados de la extremidad. </li><li> Una vez que la exploración preliminar se ha realizado preparar el sitio de implantación por la depuración del área con una clorhexidina s quirúrgicoscrub solución durante al menos 5 min y finalmente alcohol con una gasa empapada. Realice todos los pasos posteriores de una manera aséptica. </li></ol> 3. Tc-99m-etiquetado de las células madre mesenquimales Equina Nota: Los pasos de etiquetado de células se pueden realizar durante la ecografía de la extremidad anterior, ya que la decadencia de isótopos minimizará entre el etiquetado celular y la implantación de células marcadas en el tendón. <ol><li> Retire el BMS de las células ya que interfiere con la absorción de isótopo. Para ello, recuperar el vial de BMMSC (10 millones de células en 1 ml de BMS) de la caja de enfriamiento y sedimentar las células en una microcentrífuga a 350 xg durante 5 min a TA. Retire cuidadosamente el sobrenadante con una 18G o 19G aguja (unida a una jeringa 2 ml), dejando una pequeña gota (≤ 0,1 ml) en el tubo para ayudar a la resuspensión celular. Guardar el sobrenadante (BMS) en un tubo de microcentrífuga estéril y mantener en hielo para su reutilización posterior. </li><li> Resuspender las células en la gotita residual del sobrenadante por flIcking el tubo suavemente con los dedos (en lugar de vórtice) y dejar el tubo en una gradilla a TA. Asegúrese de que las células se volvieron a suspender por completo y que no existen grupos de células visibles. </li><li> Preparar el Tc-99m de la siguiente manera. Transferir 1 ml de pertecnetato de tecnecio en un vial de HMPAO usando una jeringa de 1 ml y una aguja. Mezclar suavemente pero a fondo y dejar actuar durante 5 minutos detrás de blindaje de plomo. Nota: Este paso se puede realizar mientras que las células están girando en el paso 2.1. </li><li> Añadir toda la mezcla de Tc-99m-HMPAO usando una jeringa de 1 ml y una aguja a las células y mezclar suavemente. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente detrás de blindaje de plomo. </li><li> Para los pasos siguientes, utilizar un fórceps (o un trozo de papel de seda) para abrir la tapa del tubo de microcentrífuga para minimizar la contaminación del isótopo (enguantada) pulgar y posteriormente otros equipos. Utilice una jeringa de 2 ml y 21 G aguja para añadir o eliminar tampón de lavado. Nota: Se recomienda el uso de un monitor de campo de isótopos para vigilar la contaminación de superficies y equipos. </li&gt; <li> Añadir 1 ml de PBS a la mezcla de células HMPAO Tc 99m, cerrar la tapa, mezclar suavemente y girar para sedimentar las células como en el paso 3.1. </li><li> Retire con cuidado la PBS a un nuevo tubo (guardar esta detrás de blindaje de plomo y la etiqueta como W1). Resuspender el sedimento celular en 1 ml de PBS fresco. Centrifugar el tubo y eliminar el sobrenadante que el anterior (salvo esto y etiqueta como W2). </li><li> Calcular la eficiencia del etiquetado mediante la medición de los recuentos en tubos de W1 y W2 y en el sedimento celular. Haga esto colocando cada tubos en una dosis de isótopos instrumento calibrador del pozo y de la grabación de la radiactividad como cuentas por minuto (CPM). Calcular la eficiencia de etiquetado (radiactividad como CPM de las células) / (La radiactividad de las células + sobrenadante) x 100. </li><li> Resuspender las células a fondo en el PBS residual y luego añadir el BMS salvó de paso 3.1. Las células están listas para la implantación intralesional. </li></ol> 4. implantación de células-99m-HMPAO marcados con Tc <ol><li> Implantación intralesionalen el tendón bajo guía ecográfica <ol><li> Introducir lentamente una pulgada 1,5 o 2 (50 mm) 20 G aguja en la zona de máxima lesión de la lesión en una orientación longitudinal con el transductor de ultrasonidos, cubierto en un campo estéril, en línea con la aguja de modo que la longitud de la aguja puede ser identificado por ecografía y la punta si la aguja está situado con precisión en el centro de la lesión. </li><li> El uso de protección adecuada, recoger las células en un 2 ml jeringa (Luer-lock, para minimizar el riesgo de contaminación externa y en una cubierta de la jeringa plomo blindado) utilizando una aguja de calibre 20. Deseche la aguja con cuidado de no perder el fluido. Ahora coloque la jeringa con las células marcadas en la aguja pre-ubicado en el tendón. </li><li> Coloque la sonda de ultrasonido debajo de la aguja de modo que el trayecto de la aguja en el tejido es claramente visible. Inyectar las células a un ritmo lento pero constante en la lesión. Asegúrese de que no hay resistencia a la inyección. Si esto se encontróreposicionar cuidadosamente la aguja bajo control ecográfico. Compruebe que la expulsión de fluido en la lesión es visible en la imagen de la ecografía como fluido anecoica que contiene burbujas de aire hiperecogénicas. </li><li> Retire la aguja y colocar inmediatamente presión sobre el orificio de la aguja para evitar la pérdida de las células inyectadas y para minimizar la propagación de isótopo sobre la superficie externa de la extremidad. Vestir Inmediatamente la extremidad con una capa de vendaje autoadhesivo. El caballo está ahora listo para gammagrafía. Realizar esto inmediatamente. Nota: Después de la inyección de las células en el tendón, adquirir un recuento de la jeringa vacía y la aguja para evaluar la posible pérdida directa de las células que pueden permanecer en la jeringa. </li></ol></li><li> Perfusión regional de las células-99m-HMPAO marcados con Tc <ol><li> Siga el paso 2.4. </li><li> Aplique una 100 mm vendaje torniquete de goma en el metacarpo proximal con de dos 100 mm rollo de algodón vendaje de gasa colocada medial y lateral. </li><li> Asépticamente preparar ªe la piel sobre la vena digitales palmares lateral a nivel del hueso sesamoideo proximal lateral por la depuración del área con una solución de lavado quirúrgico de clorhexidina durante al menos 5 min y finalmente con una gasa empapada en alcohol. Realice todos los pasos posteriores de una manera aséptica. </li><li> Preparar una extensión de 100 mm engastado con un 21 G x ¾ &quot;(0,8 x 19 mm) aguja de mariposa para la venopunción rellenando con solución salina estéril heparinizada y luego introducir la aguja en la vena digitales palmar lateral. Sangre Una vez introducida la vena se llene parcialmente el juego de extensión. En el conector de cierre Luer adjuntar una tapa de caucho de bloqueo Luer para facilitar la posterior inyección de células marcadas. </li><li> Diluir las MSCs en 19 ml de PBS mediante la recopilación de las células en una jeringa de 20 ml precargada con el PBS. Aplicar las células a través de la copa de goma utilizando un 18 G (1,2 x 40 mm) aguja hipodérmica a una velocidad lenta pero constante (30 - 40 seg). Lave el catéter con 1 ml de PBS precargados en un syringmi. </li><li> Retire la aguja e inmediatamente aplique presión en la piel sobre el agujero de la aguja con una capa de cinco 4 x 4 gasas de algodón. A continuación, coloque un vendaje ligero con adhesivo elástico sobre el área sesamoideo proximal y dejar el torniquete en el lugar durante 30 minutos después de la inyección. </li><li> Suelte el torniquete después de 30 minutos. El caballo está ahora listo para gammagrafía. Nota: Después de la inyección de las células, adquirir un recuento de la jeringa vacía y la aguja para evaluar la posible pérdida directa de las células que pueden permanecer en la jeringa. </li></ol></li></ol> 5. gammagrafía Gamma <ol><li> Imágenes gammagrafía <ol><li> Adquirir imágenes gammagrafía planar con una cámara gamma (fijado en 140 KeV pico fotoeléctrico utilizando una ventana simétrica 20%), equipado con una energía baja, colimador agujero paralelo. <ol><li> Obtener todas las imágenes después de la hora 0 en caballos sedados como en el paso 2.2 de pie. Después del tiempo de 0 gammagrafía, reemplace el vendaje luz sobre la si la implantaciónde TE con un vendaje acolchado. Eliminar este vendaje antes de cada examen de gammagrafía. </li><li> Adquirir imágenes estáticas durante 60 segundos cada uno (256 por 256 de la matriz), utilizando el software de procesamiento con el &quot;adquirir&quot; - &quot;la selección de estudios&quot; - opciones &quot;hueso estáticos&quot;. Es esencial que el caballo no se mueve durante el período de adquisición de la imagen porque la opción de modo estático no tiene un módulo para la corrección de movimiento. </li><li> Para la inyección intralesional, obtener imágenes laterales de la zona de la lesión del carpo de la extremidad distal, el área equivalente de la extremidad contralateral, el campo y el pulmón izquierdo tiroideo izquierdo. Durante la adquisición de imágenes extremidades anteriores, posicionar una pantalla de plomo entre las piernas para evitar la formación de imágenes del contralateral extremidad. Adquirir las imágenes en 5 min después de la inyección (tiempo 0), y después a 1, 3, 6, 12, 24, 36 y 48 hr. </li><li> Para la perfusión regional, obtener imágenes gamma laterales y dorsales que para 5.1.1.3. Obtener imágenes 5 min afliberación del torniquete ter. Este será el tiempo 0. Puede ser útil a la imagen de la extremidad inmediatamente después de la inyección de las células para evaluar los recuentos antes de la liberación del torniquete. Obtener imágenes gamma a 1, 3, 6, 12, 24, 36 y 48 h después de la administración de las células. </li></ol></li><li> Después de que las imágenes han sido adquiridos, procesar las imágenes de forma manual utilizando la opción de &quot;procesamiento&quot; del software con las opciones seleccionadas por el color &quot;Sokoloff&quot; y el color &quot;Invertir&quot;. A continuación, seleccione la &quot;región de interés&quot; (ROI) y &quot;elipse&quot; ya que esto permite la remodelación de la máscara de la selección y el movimiento sobre el área de la lesión. Obtener los recuentos sobre el retorno de la inversión por la elección de la opción &quot;añadir a las estadísticas&quot;. Asegurar que las regiones de tamaño idéntico de interés (ROI) se registran para cada animal en los diferentes puntos de tiempo. </li><li> A continuación, corregir los recuentos de la decadencia predicha del tecnecio en cada punto de tiempo. Utilice la siguiente ecuación para corregir la decadencia:A = A o E - (0.693t / T 1/2), donde A es o la actividad inicial del isótopo, A es la decadencia corrigió la radiactividad en el tiempo cero, t es el tiempo transcurrido y T es la media media -La vida del isótopo. Entonces expresar las cuentas corregidas en cada punto de tiempo como un porcentaje de la ROI en el tiempo 0 para calcular el porcentaje de células restantes, usando la siguiente fórmula: </li></ol></li></ol> % de células restante (T) = 100 - {[(descomposición predicho (t) - desintegración (t)) / decaimiento predijo (t)]} x 100 decaimiento (t) = ROI (t) / retorno de la inversión (0) x 100.

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JD and RKS are Scientific Advisory Board members to ReCellerate Inc.

Además de la médula ósea, las células madre aisladas a partir de fuentes tales como el tejido adiposo son adecuados para el etiquetado con este protocolo. Además, las células de un estado congelado pueden ser revividos y se expandieron en cultivo para los números deseados para los estudios de etiquetado 12. Un factor crítico que determina la eficiencia de marcaje del BMMSC es el tiempo entre la elución de la Tc-99m desde el generador de molibdeno en la radiofarmacia, la p...

Estrategias regenerativas para la reparación de los tejidos enfermos o dañados se basan en células madre multipotentes derivadas de una variedad de tejidos e implantado en la zona afectada. Los recientes avances en la aplicación de autóloga BMMSC para el tratamiento del tendón y lesiones de ligamentos en el caballo han demostrado la mejora de las medidas de resultado, tanto experimental 1-5 y estudios clínicos 6. El caballo es un modelo especialmente atractivo para la evaluación de la eficacia de las células madre tratamientos relacionados, ya que sufre de edad y sobreesfuerzo lesiones relacionadas a los tendones de la extremidad anterior distal, es un animal atlético, y es una recuperación grande, facilitando la médula ósea y implantación precisa. Lesiones del tendón de sanar de forma natural con la fibrosis, pero el tendón sanado es funcionalmente inferior 7 y tiene un alto riesgo de una nueva lesión 8. El tendón flexor digital superficial (TFDS) se ve afectado con mayor frecuencia, ya que ha evolucionado para actuar como una energía elásticatienda y experiencias de alta carga hincapié para lograr la eficiencia energética y la locomoción de alta velocidad. Restaurar la función después de la lesión tanto, es fundamental. Estas lesiones son similares a los que afectan el tendón de Aquiles en los seres humanos, que realiza una función similar 9. No hay buenas opciones de tratamiento para tratar o lograr buenas condiciones para este tipo de lesiones, por lo tanto, las estrategias de regeneración basada en células ofrecen una atractiva oportunidad para mejorar los resultados y reducir una nueva lesión. En la mayoría de estudios de 5 - 20 millones de BMMSC autólogo se inyectan directamente en la lesión que por lo general se produce dentro del núcleo del cuerpo del tendón que por lo tanto actúa como un receptáculo para las células. El destino de las células una vez inyectadas no es métodos claros y distintos etiquetado celular para rastrear las células se han descrito recientemente. Las células marcadas con una etiqueta de fluorescencia, se mostró a sobrevivir sólo en un número relativamente pequeño (&lt;10%) 10,11. Etiquetas de fluorescencia requierenla extracción de tejidos y seccionamiento para el análisis histológico, que es mucho tiempo y no facilita fácilmente análisis temporal en un modelo animal de gran tamaño o en casos clínicos. En un trabajo más reciente se ha utilizado el 99m Tc radioisótopos para etiquetar células y seguir su destino por gamma gammagrafía 1. Este método permite comparaciones rápidas que se hagan entre las diferentes vías de administración de células, incluyendo intralesional, intravenosa a través de la vena yugular 1 o perfusión regional vía intra-arteriales 12 o intravenosos 1,12 inyecciones. La persistencia y la distribución de células pueden obtenerse imágenes por escintigrafía gamma de varios órganos. Esto ha demostrado que sólo el 24% de las células inyectadas intralesional permaneció en la lesión por 24 hr 1 y esto se apoya en otro estudio usando lesiones experimentalmente creados y utilizando el mismo marcador radiactivo 5. Además, las células muestran una capacidad limitada para el hogar en las lesiones del tendón cuando delivered por perfusión regional o por vía intravenosa, pero se dispersan en los pulmones por los últimos 4 rutas. BMMSC marcado con nanopartículas de hierro es un método alternativo para realizar un seguimiento de las células implantadas en los tendones de las extremidades anteriores 13. Aunque las células marcadas de nanopartículas de hierro permiten el seguimiento de células in vivo por resonancia magnética, los estudios temporales en un animal grande están limitadas por el número de veces que la anestesia se pueden administrar en cada punto de tiempo para la realización de las exploraciones de MRI. Además, las nanopartículas de hierro son hipointensa en la RM que limita la información sobre la migración de células marcadas en el cuerpo del tendón. Otros radioisótopos que se pueden utilizar incluyen indio-111, pero esto tiene la desventaja de una semivida más larga que Tc-99m (2,8 días vs 6,0 hr) y mayor energía de emisión de rayos gamma. Además, la viabilidad celular se ha informado de que se reduce cuando marcado con indio-111 14. Tc-99m, por otro lado, se utiliza rutinariamente en tanto nuclear equina y humanamedicina para marcar las células mononucleares de sangre periférica y sigue su distribución in vivo mediante gammagrafía. Puede ser relativamente fácil captado por las células utilizando HMPAO como una molécula de enlazador para unir el tecnecio, como Tc-99m-HMPAO, a las células. Tc-99m-HMPAO etiquetado BMMSC mostrar buena viabilidad y puede proliferar in vitro 4. Este protocolo se detalla el etiquetado y el seguimiento de BMMSC autólogo equina implantado en las lesiones que ocurren naturalmente en el TFDS extremidad anterior. Es importante tener en cuenta que el protocolo está solamente destinado a ser utilizado como una herramienta de investigación. Su uso como una modalidad terapéutica clínica no se recomienda como el efecto de la radiomarcador en el fenotipo celular no ha sido totalmente dilucidado.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Technetium99m&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements.&#160; The isotope must be used within 2 h of elution from the molybdenum-99 generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceretec - Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO)&#160;</td>
			<td>GE HealthCare</td>
			<td></td>
			<td>Please enquire directly with GE HealthCare</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge, Minispin/Minispin Plus</td>
			<td>Ependorf</td>
			<td>22620100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G and 19G Needles</td>
			<td>Terumo Medical</td>
			<td>NN-1838R (18G);&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; NN1938R (19G)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 mL and 2 mL</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd</td>
			<td>SYR6200 (1 mL); SYR6003 (2 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One Ltd</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS - Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Swabs</td>
			<td>Shermond Ltd</td>
			<td>UNG602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoflexVet self adhering bandage</td>
			<td>Andover Healthcare, Inc.</td>
			<td>3540RB-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound imaging software</td>
			<td>Scion Image, Scion Corporation, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicasXplus Scintigram processing software</td>
			<td>Bartec Technologies Ltd</td>
			<td></td>
			<td>http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Field isotope counter for monitoring isotope</td>
			<td>John Caunt U.K.</td>
			<td>GMS1800a</td>
			<td>http://www.johncaunt.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well counter for isotope measurements, dose calibrator</td>
			<td>Capintec Southern Scientific</td>
			<td>CRC-25R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging and tracking of technetium-99m labeled bone marrow mesenchymal stem cells in equine tendinopathy

Los recientes avances en la aplicación de las células madre mesenquimales de la médula ósea (BMMSC) para el tratamiento de las lesiones del tendón y ligamento en el caballo sugieren mejoraron las medidas de resultado en los dos estudios experimentales y clínicos. Aunque el BMMSC se implantan en la lesión del tendón en grandes cantidades (generalmente 10 - 20 millones de células), sólo un número relativamente pequeño sobrevivir (&lt;10%), aunque estos pueden persistir por hasta 5 meses después de la implantación. Esto parece ser una observación común en otras especies donde BMMSC se han implantado en otros tejidos y es importante para entender cuando se produce esta pérdida, cuántos sobreviven el proceso de implantación inicial y si las células se borran en otros órganos. El seguimiento del destino de las células se puede lograr mediante la radiomarcación de BMMSC antes de la implantación que permite no invasiva de imágenes in vivo de la localización celular y cuantificación del número de células. Este protocolo describe un labeli celularng procedimiento que utiliza tecnecio-99m (Tc-99m), y el seguimiento de estas células después de la implantación en tendones flexores heridos en caballos. Tc-99m es un (t 1/2 de 6,01 hr) de isótopos de corta duración que emite rayos gamma y puede ser internalizada por las células en presencia de la oxima hexametilpropilenamina compuesto lipófilo (HMPAO). Estas propiedades lo hacen ideal para su uso en las clínicas de medicina nuclear para el diagnóstico de muchas enfermedades diferentes. El destino de las células marcadas se puede seguir en el corto plazo (hasta 36 hr) por escintigrafía gamma para cuantificar tanto el número de células retenidas en la lesión y la distribución de las células en los pulmones, tiroides y otros órganos. Esta técnica es una adaptación del etiquetado de los leucocitos de la sangre y podría ser utilizado para BMMSC imagen implantado en otros órganos.

Tc-99m-HMPAO incorporación en BMMSs no afecta negativamente a su capacidad de adherirse al plástico de cultivo de tejidos y mientras ellos demuestran la capacidad de proliferación para formar monocapas (Figura 1) que no tienen plenamente determinado si las tasas de proliferación u otros fenotipos celulares se ven afectados. Su morfología es similar a las células no marcadas con una forma típica de husillo. La eficiencia de marcaje celular (es decir., La absorción de la etiqueta) varía ...

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In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

En vivo de imágenes y Seguimiento de tecnecio-99m Etiquetada células madre mesenquimales de médula ósea en Equinos tendinopatía

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

in-vivo-imaging-tracking-technetium-99m-labeled-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

9.7K vistas.  The Royal Veterinary College. This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

Video: In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

Evaluación previa a la clínica de inhibidores de tirosina cinasa para el tratamiento de la leucemia aguda

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Investigación

Medicina

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo MRI de 19F para el seguimiento de la célula

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Secuencial<em&gt; En vivo</em&gt; Imagen de células madre / progenitoras osteogénicas durante la reparación de la fractura

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Femoral Aspiración de médula ósea en ratones vivos

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

El estudio de cáncer de páncreas Tallo Características de las células para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Aislamiento y Celular del fenotipo de células madre mesenquimales derivadas del líquido sinovial y la médula ósea de cerdos enanos

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

El agotamiento de las células de ratón a partir de xenoinjertos de tumores humanos mejora significativamente análisis de aguas abajo de las células diana

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Nerve Stimulator-guided Injection of Autologous Stem Cells Near the Equine Left Recurrent Laryngeal Nerve

Recurrent laryngeal neuropathy (RLN) commonly affects horses and is characterized by abnormal respiratory sounds and exercise intolerance. The recurrent laryngeal nerve shows lesions of demyelination. The benefit of applying stem cells to demyelinated nerves has been demonstrated in various animal models. The aim of the study was to test the feasibility and safety of a peri-neuronal injection of autologous muscle-derived mesenchymal stem cells to the left recurrent laryngeal nerve in healthy horses by using an electrical nerve stimulator.
Muscle-derived stems cell are obtained from five healthy Standardbred horses by sampling 20 mg of muscle tissue with a semi-automatic 14 G biopsy needle from the triceps muscle. Movements of the larynx are monitored via upper-airway video endoscopy. The left recurrent laryngeal nerve is approached with an insulated nerve block needle. Nerve stimulation is applied, starting at 2 mA, and the successful abduction of the left arytenoid is monitored. The stimulation intensity is reduced progressively. When a loss of the motor response is observed at 0.5 mA, 107 autologous muscle-derived stem cells are injected. Two examiners, who are blinded to the time point, score the laryngeal function of the horses prior to the treatment and at day 1, day 7, and day 28 after the injection of the cells. In a sixth horse, 1 mL of 2% lidocaine is injected to further confirm the correct positioning of the needle. This leads to a temporary paralysis of the left arytenoid cartilage.
This study proves that the recurrent laryngeal nerve can be approached with the help of an electrical nerve stimulator and that the electrical stimulation of the nerve is well tolerated by the horses. No modification of the laryngeal function was observed in any of the horses after the injection of the stem cells. Further studies should be conducted to describe the effects of a peri-neuronal injection of autologous muscle-derived mesenchymal stem cells to horses suffering from RLN.

Here, we present a protocol to inject autologous muscle-derived stem cells in the proximity to the recurrent laryngeal nerve with the help of an electrical nerve stimulator. This novel technique may become useful for the treatment of equine recurrent laryngeal neuropathy.

Nervio estimulador guiado por la inyección de células madre autólogas cerca de nervio laríngeo recurrente izquierdo equino

Recurrent laryngeal neuropathy (RLN) commonly affects horses and is characterized by abnormal respiratory sounds and exercise intolerance. The recurrent ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing continuous remodeling with the competing activity of osteoblasts, which produce the new bone matrix, and osteoclasts, whose function is to eliminate mineralized bone. [18F]-NaF is a positron emission tomography (PET) radiotracer that enables visualization of bone metabolism. [18F]-NaF is chemically absorbed into hydroxyapatite in the bone matrix by osteoblasts and can thus noninvasively detect osteoblastic activity, which is occult to conventional imaging techniques. Kinetic modeling of dynamic [18F]-NaF-PET data provides detailed quantitative measures of bone metabolism. Conventional semi-quantitative PET data, which utilizes standardized uptake values (SUVs) as a measure of radiotracer activity, is referred to as a static technique due to its snapshot of tracer uptake in time.&#160; Kinetic modeling, however, utilizes dynamic image data where tracer levels are continuously acquired providing tracer uptake temporal resolution. From the kinetic modeling of dynamic data, quantitative values like blood flow and metabolic rate (i.e., potentially informative metrics of tracer dynamics) can be extracted, all with respect to the measured activity in the image data. When combined with dual modality PET-MRI, region-specific kinetic data can be correlated with anatomically registered high-resolution structural and pathologic information afforded by MRI. The goal of this methodological manuscript is to outline detailed techniques for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data. The lumbar facet joint is a common site of degenerative arthritis disease and a common cause for axial low back pain.&#160; Recent studies suggest [18F]-NaF-PET may serve as a useful biomarker of painful facetogenic disease.&#160; The human lumbar facet joint will, therefore, be used as a prototypical region of interest for dynamic [18F]-NaF-PET-MRI analysis in this manuscript.

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. We present detailed methodologies for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data in a patient with facetogenic low back pain using the lumbar facet joints as a prototypical region of interest.

Cuantitativo [18F]-Naf-PET-MRI Análisis para la evaluación de la rotación ósea dinámica en un paciente con dolor de espalda baja facetogénico

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.