The authors would like to acknowledge funding from the Horserace Betting Levy Board U.K. (grant number 721) and VetCell BioScience Ltd, U.K. and by Consejer&#236;a de Innovaci&#242;n, Ciencia y Empresa, Junta de Andaluc&#236;a, Spain.

Les cas décrits ici ont été effectuées après la permission éthique accordée par le Comité de l&#39;éthique animale et du bien-être du Colegio de Veterinarios de Malaga, en Espagne, et la Royal Veterinary College, North Mymms, Royaume-Uni Les procédures utilisées sur les chevaux sont basées sur les protocoles approuvés qui sont utilisé dans la clinique sur des chevaux recevant des thérapies à base de cellules souches, qui comprend la sédation, l&#39;aspiration de la moelle osseuse, l&#39;injection intra-tendineux, perfusion régionale, l&#39;injection intraveineuse, la gestion du traitement et de la douleur post-opératoire et le suivi après l&#39;implantation. 1. Des dispositions clés à fait à l&#39;avance <ol><li> Cherchez l&#39;éthique institutionnels et l&#39;approbation de bien-être animal et de respecter les exigences légales locales avant de commencer à travailler. </li><li> Obtenir l&#39;approbation institutionnelle de travailler avec les rayonnements ionisants comme dicté par les réglementations locales et juridiques, y compris le niveau approprié de protection du personnel et de l&#39;environnement et l&#39;élimination des CONTAMdéchets inés. </li><li> Utiliser les critères d&#39;inclusion suivants: les chevaux présents avec une blessure de surmenage non-traumatique (tendinopathie ou Desmopathie) au tendon du fléchisseur superficiel du membre antérieur et des lésions résultant en un défaut dans le tendon et le défaut est entouré de tendon et / ou paratendon intacte . Note: L&#39;examen et le diagnostic de ces blessures et la préparation clinique des chevaux pour l&#39;implantation des cellules a été détaillée ailleurs 6,15. Remarque: L&#39;isolement et l&#39;expansion de la culture de BMMSC dérivé de la moelle osseuse des chevaux a été détaillé précédemment 6,16. Le protocole actuel pour injecter BMMSC pour blessures SDFT chez le cheval utilise 10 millions de cellules par ml de surnageant 4 de la moelle osseuse autologue (BMS) 16. </li><li> Utilisation des cellules qui ont subi pas plus de 4 passages pour l&#39;implantation in vivo afin d&#39;éviter phénotype cellulaire potentiel ou des altérations génétiques associées à nombre élevé passage caunes. </li><li> Remettre le nombre requis de cellules dans le BMS (dans les 24 heures dans une boîte de refroidissement à 4-8 ° C) à la clinique vétérinaire où l&#39;implantation des cellules doit être effectuée. Note: L&#39;utilisation clinique des cellules souches mésenchymateuses dans le surnageant de moelle osseuse est une procédure brevetée détenue par ReCellerate Inc (USA) et son utilisation peuvent nécessiter une autorisation. Remarque: Tc-99m est un émetteur gamma (140 keV) avec une demi-vie relativement courte (6,0058 h, donc près de 94% de celui-ci se désintègre à sa forme stable de 99 Tc en 24 h). L&#39;énergie gamma rend approprié pour la détection par des caméras gamma (scintigraphie) et les résultats courte demi-vie dans le temps très limité à la fois le cheval et le personnel de manutention des animaux exposition aux rayonnements. Ce protocole décrit le marquage in situ des cellules en utilisant le Tc-99m-HMPAO [HMPAO marqué avec Tc-99m (sous forme de pertechnétate de sodium)]. </li><li> Commandez le Tc-99m frais du fournisseur tel qu&#39;il est livré et utilisé pour étiqueter les cellules d&#39;esprithin 2 h d&#39;élution du générateur de Tc-99m. Assurez-vous que le Tc-99m est fourni en 1 GBq dans (tampon standard du fournisseur) 1 ml de solution. </li><li> Utilisez tous les tampons à la température ambiante. Effectuez la procédure d&#39;étiquetage, l&#39;implantation des cellules et de l&#39;imagerie (scintigraphie gamma) dans une chambre de confinement d&#39;isotopes avec tout l&#39;équipement nettoyé avec de l&#39;alcool lingettes avant le début des travaux. </li></ol> 2. Préparation du Cheval et de l&#39;échographie forelimb Tendon <ol><li> Échographies d&#39;enregistrement à la première admission pour blessures (lorsque la moelle osseuse est aspiré) puis au point de temps lorsque les cellules sont injectées radiomarqués. </li><li> Effectuer l&#39;échographie et l&#39;implantation des cellules avec le cheval portant le poids uniformément dans une stalle et sous sédation debout (plutôt que l&#39;anesthésie générale). Administrer une sédation à l&#39;aide d&#39;un mélange de chlorhydrate de détomidine et le tartrate de butorphanol, chacun à raison de 0,01 à 0,02 mg / kg IV. Remarque: La récupération est rapide et post-traitement chirurgical ne nécessite pasconsidérations spéciales. </li><li> Après anesthésie périneurale est appliquée (étape 2.6) dans le membre affecté, garder le cheval à la station sous sédation pour réduire le mouvement du cheval pendant le traitement. Contrôler visuellement le niveau approprié de sédation jugé à partir de la position de la tête baissée et le comportement du cheval et que le cheval est à l&#39;aise lors de l&#39;injection des cellules et les mouvements de la caméra gamma lors de l&#39;acquisition des images scintigraphiques. Remarque: Il est pas nécessaire d&#39;appliquer vétérinaire pommade sur les yeux (pour prévenir la sécheresse), car sous sédation clignotant est pas affectée et le cheval est capable de maintenir l&#39;hydratation des yeux. Le suivi après l&#39;implantation des cellules est non-invasive (échographie et scintigraphie gamma). </li><li> Clip de près les cheveux recouvrant le tendon (avec une tondeuse de crin de cheval) puis nettoyer la zone rasée en utilisant une combinaison d&#39;un lavage chirurgical de chlorhexidine et enfin l&#39;alcool. </li><li> Appliquer le gel de couplage acoustique dans la région etbalayer méthodiquement pour enregistrer les scans de la région complète métacarpien palmaire, des niveaux marqués successivement 1 - 7 17, avec un transducteur linéaire (12 MHz ou similaire) pour obtenir série transversale sur-incidence et images longitudinales. Stocker les images numériques de sorte que la surface de section transversale et la zone de lésion maximale 4 peuvent être obtenus à l&#39;aide du logiciel d&#39;analyse d&#39;image. </li><li> Préparer la zone recouvrant les nerfs palmaire immédiatement en aval de la carpe aseptique pour injection d&#39;un anesthésique local pour assurer une désensibilisation complète de la peau recouvrant le tendon et le tendon fléchisseur digital superficiel du. Injecter 2 ml de mepivicaine voie sous-cutanée à la fois et de façon adjacente aux nerfs palmaire (dans leur emplacement de sous-aponévrotique) entre les tendons fléchisseurs et le ligament suspenseur immédiatement en aval de la carpe des deux côtés de la branche. </li><li> Une fois l&#39;analyse préliminaire a été effectuée préparer le site d&#39;implantation en frottant la surface avec un chlorhexidine s chirurgicalesCRUB solution pendant au moins 5 min, et enfin avec de la gaze imbibée d&#39;alcool. Effectuez toutes les étapes ultérieures de façon aseptique. </li></ol> 3. Tc-99m-étiquetage des mésenchymateuses Hippique cellules souches Remarque: Les étapes d&#39;étiquetage de cellules peuvent être effectuées pendant l&#39;échographie de la patte antérieure, ce qui réduira la désintégration des isotopes entre l&#39;étiquetage de la cellule et l&#39;implantation de cellules marquées dans le tendon. <ol><li> Retirer le BMS à partir des cellules car elle interfère avec l&#39;absorption de l&#39;isotope. Pour ce faire, récupérer le flacon de BMMSC (10 millions de cellules dans 1 ml de BMS) dans la zone de refroidissement et de sédimenter les cellules dans une microcentrifugeuse à 350 g pendant 5 min à température ambiante. Retirer délicatement le surnageant avec une aiguille 18G ou 19G (attachée à une seringue de 2 ml), laissant une petite goutte (≤ 0,1 ml) dans le tube pour faciliter la remise en suspension de cellules. Enregistrez le surnageant (BMS) dans un tube à centrifuger stérile et garder sur la glace pour une réutilisation ultérieure. </li><li> Resuspendre les cellules dans le surnageant résiduel de gouttelette par flIcking doucement le tube avec les doigts (plutôt que vortex) et de laisser le tube dans un rack à température ambiante. Assurer que les cellules sont remises en suspension complètement et qu&#39;il n&#39;y a pas visibles amas cellulaires. </li><li> Préparer le Tc-99m comme suit. Transférer 1 ml de pertechnétate de technétium dans un flacon de HMPAO aide d&#39;une seringue de 1 ml et une aiguille. Mélanger doucement mais soigneusement et laisser reposer 5 min derrière le blindage de plomb. Remarque: Cette étape peut être fait alors que les cellules tournent à l&#39;étape 2.1. </li><li> Ajouter la totalité du mélange Tc-99m-HMPAO aide d&#39;une seringue de 1 ml et une aiguille pour les cellules et mélanger doucement. Incuber pendant 30 min à température ambiante derrière le blindage de plomb. </li><li> Pour les prochaines étapes, utilisez une pince (ou un morceau de papier de soie) pour ouvrir le couvercle du tube à centrifuger pour minimiser la contamination des isotopes de l&#39;(gantée) pouce et ultérieurement d&#39;autres équipements. Utiliser une seringue de 2 ml et 21 aiguille G pour ajouter ou supprimer un tampon de lavage. Note: L&#39;utilisation d&#39;un moniteur domaine des isotopes est encouragé à surveiller la contamination des surfaces et des équipements. </li&gt; <li> Ajouter 1 ml de PBS au mélange Tc-99m-HMPAO-cellulaire, fermer le couvercle, mélanger délicatement et de spin pour sédimenter les cellules comme dans l&#39;étape 3.1. </li><li> Retirez délicatement la PBS pour un nouveau tube (enregistrer cette derrière le blindage de plomb et l&#39;étiquette que W1). Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de PBS frais. Centrifuger le tube et retirer le surnageant comme ci-dessus (enregistrer cette étiquette et W2). </li><li> Calculer le rendement de marquage par la mesure des chiffres dans des tubes W1 et W2 et dans le culot cellulaire. Pour ce faire, en plaçant chaque tubes dans une dose d&#39;isotope instrument de calibrateur de puits et l&#39;enregistrement de la radioactivité en coups par minute (CPM). Calculer l&#39;efficacité d&#39;étiquetage (radioactivité des cellules CPM) / (radioactivité des cellules + surnageant) x 100. </li><li> Remettre les cellules à fond dans le PBS résiduelle, puis ajouter le BMS sauvé de l&#39;étape 3.1. Les cellules sont prêtes pour l&#39;implantation intralésionnel. </li></ol> 4. implantation de cellules Tc-99m-HMPAO marquées <ol><li> Implantation intralésionneldans le tendon sous guidage échographique <ol><li> Introduire lentement un pouce 1,5 ou 2 (50 mm) 20 d&#39;aiguille G dans la zone de lésion maximale de la lésion dans une orientation longitudinale avec le transducteur à ultrasons, recouverte d&#39;un drap stérile, en ligne avec l&#39;aiguille de sorte que la longueur de l&#39;aiguille peut être identifiés à l&#39;échographie et la pointe si l&#39;aiguille se trouve précisément dans le centre de la lésion. </li><li> Utilisation de blindage approprié, recueillir les cellules dans une seringue de 2 ml (Luer-lock, afin de minimiser le risque de contamination externe et dans une couverture de la seringue plomb-blindé) à l&#39;aide d&#39;une aiguille 20 G. Jetez l&#39;aiguille en faisant attention de ne pas perdre de fluide. Maintenant, fixer la seringue avec les cellules marquées sur l&#39;aiguille pré-situé dans le tendon. </li><li> Placer la sonde à ultrasons sous l&#39;aiguille de sorte que le tube d&#39;aiguille dans le tissu est clairement visible. Injecter les cellules à un rythme lent mais régulier dans la lésion. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de résistance à l&#39;injection. Si cela est rencontréerepositionner soigneusement l&#39;aiguille sous guidage échographique. Vérifiez que le éjection de fluide dans la lésion est visible sur l&#39;image ultrasonore en tant que fluide anéchoïque contenant des bulles d&#39;air hyperéchogènes. </li><li> Retirer l&#39;aiguille et placer immédiatement la pression sur le trou d&#39;aiguille pour éviter la perte des cellules injectées et pour minimiser la propagation de l&#39;isotope sur la surface externe de la branche. Habiller immédiatement le membre d&#39;une couche de pansement auto-adhésif. Le cheval est maintenant prêt pour la scintigraphie gamma. Effectuez cette immédiatement. Remarque: Après l&#39;injection des cellules dans le tendon, d&#39;acquérir un nombre de la seringue vide et l&#39;aiguille pour évaluer une éventuelle perte directe de cellules qui peuvent rester dans la seringue. </li></ol></li><li> Perfusion régionale des cellules Tc-99m-HMPAO marquées <ol><li> Suivez l&#39;étape 2.4. </li><li> Appliquer un 100 mm garrot en caoutchouc bandage sur le métacarpe proximal avec deux 100 mm rouleau de coton gaze positionné dedans et en dehors. </li><li> Préparer de façon aseptique ee peau sur la veine numérique palmaire latérale au niveau de l&#39;os sésamoïde latéral proximal en frottant la surface avec une solution de lavage chirurgical de chlorhexidine pendant au moins 5 min, et enfin avec de la gaze imbibé d&#39;alcool. Effectuez toutes les étapes ultérieures de façon aseptique. </li><li> Préparer une extension de 100 mm fixé avec un 21 G x ¾ &quot;(0,8 x 19 mm) de l&#39;aiguille de papillon pour ponction veineuse en complétant avec une solution saline stérile héparine, puis d&#39;introduire l&#39;aiguille dans la veine numérique palmaire latérale. Une fois que le sang de la veine est entré remplira partiellement le kit d&#39;extension. Au connecteur luer lock attacher un loquet capuchon en caoutchouc Luer pour faciliter l&#39;injection ultérieure de cellules marquées. </li><li> Diluer les cellules souches mésenchymateuses dans 19 ml de PBS en recueillant les cellules dans une seringue de 20 ml avec du PBS préchargé. Appliquer les cellules par l&#39;intermédiaire de la coupe de caoutchouc à l&#39;aide de 18 g (1,2 x 40 mm) d&#39;aiguille hypodermique à un rythme lent mais régulier (30 - 40 sec). Rincer le cathéter avec 1 ml de PBS dans une seringue préchargéee. </li><li> Retirer l&#39;aiguille et appliquer immédiatement pression à la peau sur le trou de l&#39;aiguille d&#39;une couche de cinq 4 x 4 toiles de coton. Ensuite, placez un bandage léger avec colle élastique sur la zone de sésamoïde proximale et laisser le garrot en place pendant 30 minutes après l&#39;injection. </li><li> Relâchez le garrot après 30 min. Le cheval est maintenant prêt pour la scintigraphie gamma. Remarque: Après l&#39;injection des cellules, d&#39;acquérir un nombre de la seringue vide et l&#39;aiguille pour évaluer une éventuelle perte directe de cellules qui peuvent rester dans la seringue. </li></ol></li></ol> 5. scintigraphie gamma <ol><li> Images scintigraphiques <ol><li> Acquérir les images de scintigraphie planaire avec une caméra gamma (fixé à 140 keV pic photoélectrique utilisant une fenêtre symétrique de 20%) équipé d&#39;une faible énergie, parallèlement trou collimateur. <ol><li> Obtenir toutes les images après l&#39;heure 0 sur des chevaux sous sédation comme dans l&#39;étape 2.2 debout. Après le temps 0 scintigraphie, remplacer le bandage lumière sur le SI d&#39;implantationTE avec un bandage rembourré. Retirer ce bandage avant chaque examen de scintigraphie. </li><li> Acquérir des images statiques pendant 60 secondes chacun (256 256 par matrice) en utilisant le logiciel de traitement avec le «acquérir» - «sélection de l&#39;étude&quot; - &quot;os&quot; statiques options. Il est essentiel que le cheval ne se déplace pas au cours de la période d&#39;acquisition d&#39;image parce que l&#39;option de mode statique ne possède pas un module de correction de mouvement. </li><li> Pour l&#39;injection intralésionnelle, obtenir des images latérales de la zone de lésion de la carpe à l&#39;extrémité distale, la surface équivalente de la branche controlatérale, le champ de poumon gauche et de la gauche de la thyroïde. Lors de l&#39;acquisition des images des membres antérieurs, positionner un écran de plomb entre les jambes pour éviter l&#39;imagerie de la controlatéral du membre. Acquérir les images à 5 min après l&#39;injection (temps 0), puis à 1, 3, 6, 12, 24, 36 et 48 h. </li><li> Pour perfusion régionale, obtenir des images latérales et dorsales gamma que pour les 5.1.1.3. Obtenir des images 5 min after garrot libération. Ce sera le temps 0. Il peut être utile à l&#39;image de la branche immédiatement après l&#39;injection des cellules d&#39;évaluer les chiffres antérieurs à tourniquet de presse. Obtenir des images gamma à 1, 3, 6, 12, 24, 36 et 48 h après l&#39;administration des cellules. </li></ol></li><li> Après les images ont été acquises, traiter les images manuellement en utilisant l&#39;option &quot;traitement&quot; du logiciel avec les options choisies pour la couleur &quot;Sokoloff&quot; et la couleur &quot;Inverser&quot;. Sélectionnez ensuite la &quot;zone d&#39;intérêt&quot; (ROI) et «ellipse» car cela permet refonte du masque de sélection et de mouvement sur la zone de la lésion. Procurez-vous les chiffres plus le retour sur investissement en choisissant l&#39;option &quot;ajouter les statistiques&quot;. Veiller à ce que les régions de taille identique d&#39;intérêt (ROI) sont enregistrés pour chaque animal dans les différents points de temps. </li><li> Ensuite, corriger les chiffres correspondant à la décroissance prévue du technétium à chaque point de temps. Utilisez l&#39;équation suivante pour corriger la décroissance:A = A o e - (0.693t / T 1/2), où A o représente l&#39;activité initiale de l&#39;isotope, A est la désintégration corrigé radioactivité au temps zéro, t est le temps écoulé et T 1/2 est la demi -life de l&#39;isotope. Puis exprimer les chiffres corrigés à chaque point de temps comme un pourcentage de la ROI au temps 0 à travailler sur le pourcentage de cellules restantes, en utilisant la formule suivante: </li></ol></li></ol> % de cellules restant (t) = 100 - {[(décroissance estimée (t) - décroissance (t)) / décroissance prédit (t)]} x 100 décroissance (t) = ROI (t) / ROI (0) x 100.

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Inflammation/Infection Taskgroup of the European Association of Nuclear Medicine.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 37, 842-848 (2010).</li><li>Trela, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scintigraphic+comparison+of+intra-arterial+injection+and+distal+intravenous+regional+limb+perfusion+for+administration+of+mesenchymal+stem+cells+to+the+equine+foot.">Scintigraphic comparison of intra-arterial injection and distal intravenous regional limb perfusion for administration of mesenchymal stem cells to the equine foot.</a> Equine Veterinary Journal. 46, 479-483 (2014).</li><li>Barbash, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+to+the+infarcted+myocardium:+feasibility,+cell+migration,+and+body+distribution.">Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium: feasibility, cell migration, and body distribution.</a> Circulation. 108, 863-868 (2003).</li><li>Heckl, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+contrast+agents+for+molecular+imaging+in+stroke.">Future contrast agents for molecular imaging in stroke.</a> Current Medicinal Chemistry. 14, 1713-1728 (2007).</li></ol>

JD and RKS are Scientific Advisory Board members to ReCellerate Inc.

En plus de la moelle osseuse, les cellules souches isolées à partir de sources telles que le tissu adipeux sont adaptés pour le marquage avec ce protocole. En outre, les cellules de l&#39;état congelé peuvent être repris et développés en culture pour les chiffres désirés pour les études de marquage 12. Un facteur critique qui détermine l&#39;efficacité de marquage de l&#39;BMMSC est le temps entre l&#39;élution de la Tc-99m provenant du générateur de molybdène à ...

Stratégies de régénération pour la réparation des tissus malades ou endommagés sont basées sur des cellules souches multipotentes dérivées d&#39;une variété de tissus et implantés dans la zone touchée. Les récents progrès dans l&#39;application des autologue BMMSC pour le traitement de tendon et les lésions ligamentaires chez le cheval ont montré l&#39;amélioration des mesures de résultats à la fois expérimentale 1-5 et 6 études cliniques. Le cheval est un modèle particulièrement intéressant pour évaluer l&#39;efficacité des cellules souches traitements liés, car il souffre d&#39;âge et surmenage des blessures liées à des tendons de la patte antérieure distale, il est un animal athlétique, et il est un grand faciliter la récupération, de la moelle osseuse et implantation précise. Tendon blessures guérissent naturellement avec la fibrose, mais le tendon guéri est fonctionnellement inférieure 7 et présente un risque élevé d&#39;une nouvelle blessure 8. Le tendon fléchisseur superficiel du doigt (SDFT) est le plus souvent affecté tel qu&#39;il a évolué à agir comme une énergie élastiquemagasin et expériences chargement élevé souligne pour atteindre l&#39;efficacité énergétique et de la locomotion à grande vitesse. Fonction Restauration après une blessure est donc essentiel. Ces blessures sont similaires à ceux touchant le tendon d&#39;Achille chez l&#39;homme qui remplit une fonction similaire 9. Il n&#39;y a pas de bonnes options de traitement pour traiter ou atteindre bon état pour de telles blessures, les stratégies de régénération à base de cellules offrent donc une opportunité intéressante pour améliorer les résultats et de réduire une nouvelle blessure. Dans la plupart des études 5-20000000 BMMSC autologue sont injectés directement dans la lésion qui se produit habituellement dans le noyau du corps de tendon qui agit donc comme un réceptacle pour les cellules. Le sort des cellules une fois injectées ne sont pas des méthodes de marquage des cellules claires et différents pour suivre les cellules ont été récemment décrites. Les cellules marquées avec une étiquette de fluorescence ont été montrés à survivre que dans un nombre relativement faible (&lt;10%) 10,11. Des marqueurs de fluorescence nécessitentextraction de tissu et la coupe pour l&#39;analyse histologique qui prend du temps et ne facilitent aisément analyse temporelle dans un grand modèle animal ou dans des cas cliniques. Dans des travaux plus récents, nous avons utilisé le radio-isotope 99m Tc pour marquer les cellules et suivez leur sort par scintigraphie gamma 1. Cette méthode permet des comparaisons rapides à faire entre les différentes voies d&#39;administration de cellules, y compris intralésionnelle, par voie intraveineuse par la veine jugulaire 1 ou perfusion régionale via intra-artérielle ou intraveineuse 1,12 12 injections. La persistance et la distribution des cellules peuvent ensuite être visualisés par scintigraphie gamma de divers organes. Cela a démontré que seulement 24% des cellules injectées intralesionally resté dans la lésion de 24 h 1, ce qui est pris en charge par une autre étude utilisant des lésions expérimentalement créés et en utilisant le même radioactif 5. En outre, les cellules présentent une capacité limitée à l&#39;accueil dans les lésions tendineuses lors delivereD par perfusion intraveineuse, mais régional ou sont dispersés dans les poumons par les derniers itinéraires 4. BMMSC étiquetés avec nanoparticules de fer est une méthode alternative pour suivre les cellules implantées dans les tendons des membres antérieurs 13. Bien que les cellules marquées de nanoparticules de fer permettent le suivi des cellules in vivo par IRM, des études temporelles dans un animal de grande taille sont limitées par le nombre de fois où l&#39;anesthésie peuvent être administrés à chaque point de temps pour effectuer les IRM. En outre, les nanoparticules de fer sont hypo-intense sur l&#39;IRM qui limite les informations sur la migration des cellules marquées dans le corps du tendon. D&#39;autres radio-isotopes qui peuvent être utilisés comprennent l&#39;indium-111, mais ce souffre de l&#39;inconvénient d&#39;une demi-vie plus longue que Tc-99m (2,8 jours vs 6,0 h) et supérieur énergie d&#39;émission de rayons gamma. En outre, la viabilité des cellules a été rapportée pour être réduite lorsque marqué à l&#39;indium-111 14. Tc-99m, d&#39;autre part, est couramment utilisée dans les deux équine et humaine nucléairemédicament pour marquer les cellules mononucléaires de sang périphérique et de suivre leur distribution in vivo par scintigraphie. Elle peut être relativement facilement absorbé par les cellules à l&#39;aide de HMPAO comme une molécule de liaison pour lier le technétium, comme Tc-99m-HMPAO, à des cellules. Tc-99m-HMPAO étiqueté BMMSC montrer une bonne viabilité et peut proliférer in vitro 4. Ce protocole détaille l&#39;étiquetage et le suivi des BMMSC autologue équine implanté dans les lésions d&#39;origine naturelle dans le SDFT des membres antérieurs. Il est important de noter que le protocole est destiné à être utilisé seulement comme outil de recherche. Son utilisation comme une modalité thérapeutique clinique est déconseillée car l&#39;effet de la radioactivité sur le phénotype cellulaire n&#39;a pas été complètement élucidé.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Technetium99m&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements.&#160; The isotope must be used within 2 h of elution from the molybdenum-99 generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceretec - Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO)&#160;</td>
			<td>GE HealthCare</td>
			<td></td>
			<td>Please enquire directly with GE HealthCare</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge, Minispin/Minispin Plus</td>
			<td>Ependorf</td>
			<td>22620100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G and 19G Needles</td>
			<td>Terumo Medical</td>
			<td>NN-1838R (18G);&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; NN1938R (19G)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 mL and 2 mL</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd</td>
			<td>SYR6200 (1 mL); SYR6003 (2 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One Ltd</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS - Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Swabs</td>
			<td>Shermond Ltd</td>
			<td>UNG602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoflexVet self adhering bandage</td>
			<td>Andover Healthcare, Inc.</td>
			<td>3540RB-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound imaging software</td>
			<td>Scion Image, Scion Corporation, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicasXplus Scintigram processing software</td>
			<td>Bartec Technologies Ltd</td>
			<td></td>
			<td>http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Field isotope counter for monitoring isotope</td>
			<td>John Caunt U.K.</td>
			<td>GMS1800a</td>
			<td>http://www.johncaunt.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well counter for isotope measurements, dose calibrator</td>
			<td>Capintec Southern Scientific</td>
			<td>CRC-25R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging and tracking of technetium-99m labeled bone marrow mesenchymal stem cells in equine tendinopathy

Les récents progrès dans l&#39;application des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMMSC) pour le traitement des tendons et des ligaments blessures chez le cheval suggèrent une amélioration des mesures de résultats dans les deux études expérimentales et cliniques. Bien que le BMMSC sont implantés dans la lésion du tendon en grand nombre (généralement 10 - 20 millions de cellules), seul un nombre relativement faible de survivre (&lt;10%), bien que ceux-ci peuvent persister jusqu&#39;à 5 mois après l&#39;implantation. Cela semble être une observation commune dans d&#39;autres espèces où BMMSC ont été implantés dans d&#39;autres tissus et il est important de comprendre quand cette perte se produit, combien survivre au processus d&#39;implantation initiale et si les cellules sont effacés dans d&#39;autres organes. Le suivi le devenir des cellules peut être réalisée par marquage radioactif de la BMMSC avant l&#39;implantation qui permet non invasive de l&#39;imagerie in vivo d&#39;emplacement de cellule et quantification du nombre de cellules. Ce protocole décrit une labeli cellulaireng procédure qui utilise le technétium 99m (Tc-99m), et le suivi de ces cellules après implantation dans tendons fléchisseurs blessés chez les chevaux. Tc-99m est un (t 1/2 de 6,01 hr) isotope de courte durée qui émet des rayons gamma et peut être internalisé par les cellules en présence du composé d&#39;oxime hexamethylpropyleneamine lipophile (HMPAO). Ces propriétés, il est idéal pour une utilisation dans les cliniques de médecine nucléaire pour le diagnostic de nombreuses maladies différentes. Le sort des cellules marquées peut être suivi à court terme (jusqu&#39;à 36 h) par scintigraphie gamma de quantifier à la fois le nombre de cellules retenues dans la lésion et la distribution des cellules dans les poumons, la thyroïde et d&#39;autres organes. Cette technique est adaptée de l&#39;étiquetage des leucocytes du sang et pourrait être utilisé pour l&#39;image implanté BMMSC dans d&#39;autres organes.

Tc-99m-HMPAO incorporation dans BMMSs ne nuisent pas à leur capacité à adhérer à la culture de tissus en plastique et tandis qu&#39;ils montrent la capacité de prolifération pour former des monocouches (Figure 1), nous avons pas entièrement déterminé si les taux de prolifération ou d&#39;autres phénotypes cellulaires sont affectées. Leur morphologie est similaire à cellules non marquées avec une forme typique de la broche. L&#39;efficacité du marquage cellulaire (par exemple., L...

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In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

Imagerie in vivo et le suivi de technétium 99m Étiqueté moelle osseuse Cellules souches mésenchymateuses dans Tendinopathie Hippique

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

9.7K vues.  The Royal Veterinary College. This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

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Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

Évaluation pré-clinique des inhibiteurs de tyrosine kinase pour le traitement de la leucémie aiguë

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Recherche

Médecine

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F IRM pour le suivi cellulaire

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Séquentiel<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des cellules souches / progénitrices ostéogéniques lors de la réparation de la fracture

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Fémorale aspiration de moelle osseuse chez des souris en direct

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Isolement cellulaire et phénotypage des cellules souches mésenchymateuses dérivées de liquide synovial et de moelle osseuse de Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Appauvrissement des cellules de souris de xénogreffes de tumeurs humaines améliore de manière significative l&#39;analyse en aval des cellules cibles

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Nerve Stimulator-guided Injection of Autologous Stem Cells Near the Equine Left Recurrent Laryngeal Nerve

Recurrent laryngeal neuropathy (RLN) commonly affects horses and is characterized by abnormal respiratory sounds and exercise intolerance. The recurrent laryngeal nerve shows lesions of demyelination. The benefit of applying stem cells to demyelinated nerves has been demonstrated in various animal models. The aim of the study was to test the feasibility and safety of a peri-neuronal injection of autologous muscle-derived mesenchymal stem cells to the left recurrent laryngeal nerve in healthy horses by using an electrical nerve stimulator.
Muscle-derived stems cell are obtained from five healthy Standardbred horses by sampling 20 mg of muscle tissue with a semi-automatic 14 G biopsy needle from the triceps muscle. Movements of the larynx are monitored via upper-airway video endoscopy. The left recurrent laryngeal nerve is approached with an insulated nerve block needle. Nerve stimulation is applied, starting at 2 mA, and the successful abduction of the left arytenoid is monitored. The stimulation intensity is reduced progressively. When a loss of the motor response is observed at 0.5 mA, 107 autologous muscle-derived stem cells are injected. Two examiners, who are blinded to the time point, score the laryngeal function of the horses prior to the treatment and at day 1, day 7, and day 28 after the injection of the cells. In a sixth horse, 1 mL of 2% lidocaine is injected to further confirm the correct positioning of the needle. This leads to a temporary paralysis of the left arytenoid cartilage.
This study proves that the recurrent laryngeal nerve can be approached with the help of an electrical nerve stimulator and that the electrical stimulation of the nerve is well tolerated by the horses. No modification of the laryngeal function was observed in any of the horses after the injection of the stem cells. Further studies should be conducted to describe the effects of a peri-neuronal injection of autologous muscle-derived mesenchymal stem cells to horses suffering from RLN.

Here, we present a protocol to inject autologous muscle-derived stem cells in the proximity to the recurrent laryngeal nerve with the help of an electrical nerve stimulator. This novel technique may become useful for the treatment of equine recurrent laryngeal neuropathy.

Injection guidée par stimulateur de nerf de cellules souches autologues près du nerf laryngé récurrent gauche équin

Recurrent laryngeal neuropathy (RLN) commonly affects horses and is characterized by abnormal respiratory sounds and exercise intolerance. The recurrent ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing continuous remodeling with the competing activity of osteoblasts, which produce the new bone matrix, and osteoclasts, whose function is to eliminate mineralized bone. [18F]-NaF is a positron emission tomography (PET) radiotracer that enables visualization of bone metabolism. [18F]-NaF is chemically absorbed into hydroxyapatite in the bone matrix by osteoblasts and can thus noninvasively detect osteoblastic activity, which is occult to conventional imaging techniques. Kinetic modeling of dynamic [18F]-NaF-PET data provides detailed quantitative measures of bone metabolism. Conventional semi-quantitative PET data, which utilizes standardized uptake values (SUVs) as a measure of radiotracer activity, is referred to as a static technique due to its snapshot of tracer uptake in time.&#160; Kinetic modeling, however, utilizes dynamic image data where tracer levels are continuously acquired providing tracer uptake temporal resolution. From the kinetic modeling of dynamic data, quantitative values like blood flow and metabolic rate (i.e., potentially informative metrics of tracer dynamics) can be extracted, all with respect to the measured activity in the image data. When combined with dual modality PET-MRI, region-specific kinetic data can be correlated with anatomically registered high-resolution structural and pathologic information afforded by MRI. The goal of this methodological manuscript is to outline detailed techniques for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data. The lumbar facet joint is a common site of degenerative arthritis disease and a common cause for axial low back pain.&#160; Recent studies suggest [18F]-NaF-PET may serve as a useful biomarker of painful facetogenic disease.&#160; The human lumbar facet joint will, therefore, be used as a prototypical region of interest for dynamic [18F]-NaF-PET-MRI analysis in this manuscript.

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. We present detailed methodologies for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data in a patient with facetogenic low back pain using the lumbar facet joints as a prototypical region of interest.

Analyse quantitative [18F]-Naf-PET-MRI pour l'évaluation du chiffre d'affaires dynamique d'os dans un patient présentant la douleur lombaire facetogenic

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.