The authors would like to acknowledge funding from the Horserace Betting Levy Board U.K. (grant number 721) and VetCell BioScience Ltd, U.K. and by Consejer&#236;a de Innovaci&#242;n, Ciencia y Empresa, Junta de Andaluc&#236;a, Spain.

本明細書中に記載の例は、馬に使用される手順があり承認されたプロトコルに基づいていますコレヒオ・デ・Veterinariosデマラガ、スペイン、ロイヤル獣医大学、ノースMymms、英国の動物倫理福祉委員会によって付与された倫理的な許可に従って行いました移植後鎮静、骨髄吸引、内腱注射、局所灌流、静脈内注射、術後の治療や痛みの管理と監視が含ま幹細胞ベースの治療を受けた馬にクリニックで使用。 1.キー配列は事前に作られて<ol><li>制度的倫理と動物福祉の承認を求めると作業を開始する前に、現地の法的要件に準拠しています。 </li><li>人員の保護の適切なレベルと環境とcontamの処分など、地元との法的規制によって指示されるように電離放射線で動作するように制度の承認を求めますinated無駄。 </li><li>以下の選択基準を使用してください：前肢と腱と欠陥内の欠陥が生じる病変の浅指屈筋腱デジタルへの非外傷性無理損傷（腱障害またはdesmopathy）を備えた本馬がそのまま腱および/またはparatenonに囲まれて。 注意：このようなけがや細胞移植のための馬の臨床的製造のための検査・診断は他6,15詳述されています。 注意：馬の骨髄由来BMMSCの文化の中での単離および拡大は以前6,16詳述されています。馬にSDFTの怪我のためにBMMSCを注入するための現在のプロトコルは、自己骨髄上清（BMS）16 mlの4当たり10万個の細胞を使用しています。 </li><li>高継代数Cに関連する潜在的な細胞表現型または遺伝的変化を避けるために、in vivoでの移植のためにこれ以上の4以上の通路を受けた細胞を使用してくださいells。 </li><li>細胞移植が行われる獣医クリニックに- （8 O Cを 4でチルボックスに24時間以内）BMSのセルの必要な数を提供します。 注意：骨髄上清中の間葉系幹細胞の臨床使用はReCellerate社（米国）が所有する特許を取得した手続きであり、その使用は、許可が必要な場合があります。 注：のTc-99メートルは、比較的半減期の短いガンマ線放射体（140 keVの）である（6.0058時間、したがってそれのほぼ94％が24時間で99 Tcのの安定した形に減衰します）。ガンマ線エネルギーは、馬や動物の取扱人員の両方に非常に限られた放射線の露光時間でガンマカメラ（シンチグラフィー）および短い半減期の結果による検出に適しています。このプロトコルは[HMPAO（過テクネチウム酸ナトリウムなど）のTc-99メートルで標識された]のTc-99メートル-HMPAOを用いて細胞の現場ラベルについて説明します。 </li><li>それは、細胞のウィットを標識するために提供され、使用されるように、供給者から新鮮なのTc-99メートルの注文Tc-99メートルジェネレータから溶出の2時間をホアヒン。 Tc-99メートルは、1ミリリットル溶液（供給者の標準緩衝液）で1 GBQとして提供されていることを確認してください。 </li><li> RTですべてのバッファを使用してください。標識操作を実行し、アルコールで洗浄、すべての機器との同位体封じ込め室で細胞およびイメージング（ガンマシンチグラフィー）の注入は、従来の研究の開始に拭きます。 </li></ol>前肢腱の馬と超音波検査の作製<ol><li>時点で、最初の（骨髄を吸引する）負傷のため入院とで録音超音波スキャンは、放射性標識された細胞が注入されます。 </li><li>馬が失速に均等に体重を保有するとし、（むしろ全身麻酔より）鎮静を立ち下超音波検査と細胞移植を行います。 0.01〜0.02ミリグラム/ kg静脈でデトミジンHClおよび酒石酸ブトルファノールの混合物、それぞれを使用して鎮静を管理します。 注：回復は迅速であり、手術後の治療はありませんが必要です特別な考慮事項。 </li><li>神経周囲麻酔が患肢に（ステップ2.6）に適用された後、治療中の馬の動きを減らすために鎮静下駅で馬を保ちます。視覚的に低下し、ヘッド位置と馬の態度からと馬が細胞注入及びシンチグラフィー画像の取得時のガンマカメラの動きの間に快適であると判断鎮静の適切なレベルを確認してください。 注：鎮静点滅下影響を受け、馬目の水和を維持することができるされていないので（乾燥を防ぐために）目に獣医軟膏を適用する必要はありません。細胞の移植後の監視は、非侵襲的（超音波及びガンマシンチグラフィー）です。 </li><li> （馬の毛をバリカンで）腱を覆う髪が、最終的にアルコールクロルヘキシジン手術用スクラブの組み合わせを使用して、クリップされた領域をきれいにし、密接にクリップ。 </li><li>領域に音響結合ゲルを適用し、シリアルの入射横と縦の画像を得るために線形変換器（12 MHzまたは類似の）で、7 17 -完全な掌中手骨部位のスキャン、順次ラベルのレベル1を記録するために系統的にスキャンします。断面積と最大の損傷ゾーン4は、画像解析ソフトウェアを用いて得られるように、デジタル画像を保存します。 </li><li>腱や浅指屈筋腱を覆う皮膚の完全な脱感作を確実にするために、局所麻酔薬の無菌注射用手首のすぐ遠位手掌神経を覆う面積を準備します。 mepivicaine皮下および屈筋腱や四肢の両側に手根のすぐ遠位提靱帯の間（そのサブ筋膜の場所に）掌神経に隣接する両方の2ミリリットルを注入。 </li><li>予備スキャンはクロルヘキシジン外科手術のエリアをスクラブすることにより、移植部位の準備が行われた後は浸したガーゼで少なくとも5分間、最終的にはアルコールのためcrubソリューション。無菌の方法で後続のすべての手順を実行します。 </li></ol>馬間葉系幹細胞の3のTc-99メートル標識注意：これは腱に標識された細胞の細胞標識と注入の間の同位体の減衰を最小限に抑えることができますように細胞標識のステップは前肢の超音波検査中に実行することができます。 <ol><li>それは同位体の取り込みを妨害するように、細胞からBMSを削除します。これを行うには、冷却ボックスからBMMSCのバイアル（BMSの1ミリリットル中に10万個の細胞）を取得し、室温で5分間、350×gでマイクロ遠心で細胞をペレット化。慎重に細胞の再懸濁を支援するために、チューブに小滴（≤0.1ml）を残して、（2 mlシリンジに取り付けられている）18Gまたは19G針を用いて上清を除去します。滅菌マイクロチューブに上清（BMS）を保存し、後で再利用するために氷の上に保管してください。 </li><li> FLによって上清の残留液滴で細胞を再懸濁（むしろ渦より）指で軽くチューブをIckingの、室温でラックにチューブを残します。細胞が完全に再懸濁され、目に見える細胞塊がないことを確認します。 </li><li>次のようにのTc-99メートルを準備します。 1ミリリットルの注射器と針を使用してHMPAOのバイアルに転送テクネチウム過テクネチウムの1ミリリットルを。穏やかに、しかし完全に混合し、鉛シールドの背後に5分間おきます。注：細胞がステップ2.1で回転している間は、この手順を行うことができます。 </li><li>細胞に1mlシリンジと針を使用したTc-99メートル-HMPAO混合物のすべてを加え、穏やかに混合。鉛シールドの後ろにRTで30分間インキュベートします。 </li><li>次のステップは、（手袋をはめた）親指とその後に他の機器の同位体の汚染を最小限にするためにマイクロチューブの蓋を開くために鉗子（または組織紙）を使用しています。洗浄バッファーを追加または削除するには、2 mlシリンジと21 Gの針を使用してください。 注：フィールドの同位体モニタの使用は、表面および機器の汚染を監視することが推奨されます。 </lI&gt; <li> 、蓋を閉じて穏やかに混合し、スピン、ステップ3.1のように、細胞をペレット化するために、のTc-99メートル-HMPAO-細胞混合物に1mlのPBSを追加します。 </li><li>慎重に（W1とリードシールドおよびラベルの後ろにこれを保存する）新しいチューブにPBSを除去します。新鮮なPBS 1mlに細胞ペレットを再懸濁します。チューブを遠心し、（W2として、このラベルを保存）上記のように、上清を除去します。 </li><li> W1とW2チューブに、細胞ペレットにカウントを測定することにより、標識効率を算出します。まあ同位体投与量キャリブレータ器の各チューブを配置し、分当たりのカウント（cpm）として放射能を記録することによって、これを行います。 （セルのCPMとして放射能）/（細胞+上清の放射能が）×100として標識効率を計算します。 </li><li>残留PBS中で徹底的に細胞を再懸濁して、BMSは、ステップ3.1から保存を追加します。細胞は病巣内注入の準備ができています。 </li></ol> Tc-99メートル-HMPAO標識細胞の移植4. <ol><li>病巣内注入超音波ガイド下腱へ<ol><li>ゆっくりと針の長さができるように、針に沿って、滅菌ドレープで覆われた超音波トランスデューサと縦方向、病変の最大傷害ゾーンに1.5または2インチ（50ミリメートル）20 G針を導入針が正確に病変の中心部に位置されている場合は超音波検査とチップ識別されます。 </li><li>適切な遮蔽を使​​用して、（外部の汚染の危険性および鉛遮蔽シリンジカバー内を最小限にするためにルアーロック）2 mlのシリンジに細胞を収集し、20G針を使用して。任意の流体を失わないように注意しながら針を捨てます。今腱に予め位置針上に標識された細胞を注射器を取り付けます。 </li><li>組織内の針管がはっきり見えるように針の下に超音波プローブを配置します。病巣にゆっくりだが着実なペースで細胞を注入します。注入に対する抵抗がないことを確認してください。これが発生した場合慎重に、超音波ガイド下で針の位置を変更。病変部への流体噴射がhyperechogenic気泡を含む無響流体として、超音波画像上に表示されていることを確認してください。 </li><li>針を引き抜くとすぐに注入された細胞の損失を防止し、四肢の外表面上の同位体の広がりを最小限にするために、針の穴の上に圧力をかけます。すぐに自己接着包帯の一つの層で手足をドレス。馬は今、ガンマシンチグラフィーのための準備ができています。すぐにこれを実行します。 注意：腱に細胞を注入した後、シリンジに残ることがあり、細胞の可能性の直接的損失を評価するために、空の注射器と針のカウントを取得します。 </li></ol></li><li> Tc-99メートル-HMPAO標識細胞の局所灌流<ol><li>ステップ2.4​​に従ってください。 </li><li>内側と横方向に配置された2つの100ミリメートルコットンロールガーゼ包帯で近位中手骨の100ミリメートルゴム止血包帯を適用します。 </li><li>無菌番目の準備少なくとも5分間、クロルヘキシジンの外科スクラブソリューションと面積をスクラブすることにより、最終的にアルコールに浸したガーゼで横方向近位種子骨の骨のレベルで横の掌側指静脈の上に電子スキンです。無菌の方法で後続のすべての手順を実行します。 </li><li>ヘパリン処理した滅菌生理食塩水を充填することにより、静脈穿刺のための21のGのx¾ &quot;（0.8×19ミリメートル）翼状針で設定さ100ミリメートル延長を準備して、横方向の掌側指静脈に針を導入します。静脈を入力すると、血液の一部が拡張セットを記入します。ルアーロックコネクタで標識された細胞のその後の注入を容易にするためのルアーロックのゴムキャップを取り付けてください。 </li><li> PBSでプリロード20ミリリットル注射器で細胞を収集することにより、PBSの19ミリリットルでMSCを希釈します。 （ - 40秒30）ゆっくりではあるが一定の速度で18 G（1.2×40 mm）の皮下注射針を用いたゴムカップを介して細胞に適用します。 syringにプリロード1mlのPBSでカテーテルをフラッシュE。 </li><li>針を外し、すぐに5 4×4の綿のガーゼの層で針穴の上の皮膚に圧力をかけます。そして、近位種子骨領域の上に弾性接着剤で光包帯を配置し、注射後30分の場所に止血帯を残します。 </li><li> 30分後に止血帯を離します。馬は今、ガンマシンチグラフィーのための準備ができています。 注：細胞を注入した後、シリンジに残ることがあり、細胞の可能性の直接的損失を評価するために、空の注射器と針のカウントを取得します。 </li></ol></li></ol> 5.ガンマシンチグラフィー<ol><li>シンチグラフィー画像<ol><li>低エネルギー、パラレルホールコリメータを装備した（20％対称ウィンドウを使用して、140keVで光電ピークに設定）ガンマカメラと平面シンチグラフィ画像を取得。 <ol><li>ステップ2.2のように鎮静し、馬を放置すると、時間0の後にすべての画像を取得します。時間0シンチグラムの後、注入SIの上に光包帯を交換パッド入りの包帯でTE。各シンチグラフィー試験の前に、この包帯を外します。 </li><li> 「研究の選択」 - - 「骨静的 &quot;オプション&quot;獲得 &quot;して処理ソフトウェアを使用して、60秒ずつ（256行列で256）のための静止画像を取得します。静的モードオプションは、運動を補正するためのモジュールを持っていないので、馬は、画像取得期間中に移動しないことが不可欠です。 </li><li>病巣内注射のために、遠位端、対側肢、左肺野と左甲状腺の等価な領域に手根から病変領域から横方向の画像を取得します。前肢画像の取得時には、手足の反対の撮像を避けるために、脚の間鉛スクリーンを設置。注射後5分（時間0）で画像を取得し、その後、1、3、6、12、24、36及び48時間で。 </li><li>地域の灌流のために、5.1.1.3と同様に、横方向と背ガンマ画像を得ます。画像を5分のAFを取得ター止血帯リリース。これは、直前に止血帯リリースにカウントを評価するために、細胞を注入した後、手足の画像に役立ちます時間は0になります。細胞の投与後1、3、6、12、24、36及び48時間でのガンマ画像を得ます。 </li></ol></li><li>画像が取得された後、プロセスを手動「ソコロフ」色と「反転」の色のために選択したオプションを使用してソフトウェアの「処理」オプションを使用して画像。これは病変領域の上に選択マスクや動きの整形を可能にするように、次の「関心領域」（ROI）と「楕円」を選択します。 「統計に追加」オプションを選択することで、ROI以上の数を取得します。関心領域（ROI）の同じサイズの領域が異なる時点で各動物について記録されていることを確認します。 </li><li>次に、各時点でのテクネチウムの予想減衰のカウントを修正します。減衰を補正するために、以下の式を使用します。E O A = - （0.693トン/ T 1/2）、o は同位体の初期活性である、Aは減衰が時間ゼロで放射能を補正して、tは経過時間であり、T 1/2が半分であります同位体の-Life。そして、次の式を使用して、残りの細胞の割合を仕事に時間0でのROIの割合として各時点で補正カウントを表現します： </li></ol></li></ol> （T）= 100％、残りの細胞 - {[（予測減衰（t）を - ディケイ（t））は/ディケイ（t）を予測]}×100 崩壊（T）= ROI（T）は、/ ROI（0）×100。

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骨髄に加えて、脂肪組織のような供給源から単離された幹細胞は、このプロトコルで標識化するのに適しています。また、凍結状態からの細胞を復活し、標識試験12のための所望の数に培養で増殖することができます。 BMMSCを標識の効率を決める重要な要因は、放射性薬局でのモリブデン発生器からのTc-99メートルの溶出の間の時間、のTc-99メートル-HMPAOの準備や...

病的または損傷組織の修復のための再生戦略は、組織のさまざまな由来の多能性幹細胞に基づいており、患部に注入されます。馬での腱や靭帯損傷の治療のための自家BMMSCの応用における最近の進歩は、両方の実験1-5で改善されたアウトカム指標および臨床研究6を示しています 。馬は、幹細胞に関連する治療の有効性を評価するための特に魅力的なモデルである、それは年齢に苦しんでいると遠位前肢の腱に関連した傷害を無理ので、それはアスレチック動物であり、それは大規模な、容易に骨髄の回復であり、正確な注入。腱損傷は、線維症に自然に治癒するが、癒さ腱7機能的に劣っていると再傷害8のリスクが高いです。それは弾性エネルギーとして機能するように進化してきたように浅指屈筋腱（SDFT）が最も一般的に影響を受けています店舗や経験の高負荷は、エネルギー効率、高速移動を達成するために強調しています。損傷後の機能を回復することは、非常に重要です。これらの損傷は、同様の機能9を行い 、ヒトにおけるアキレス腱に影響を与えるものと同様です。したがって、細胞ベースの再生戦略が成果を改善するために、再損傷を低減するために魅力的な機会を提供し、治療や、怪我のために良い修復を達成するためには良い治療法の選択肢はありません。 ほとんどの研究では5から20000000自家BMMSCは通常、したがって、細胞のための容器として機能する腱体のコア内に発生した病変に直接注入されています。一度注入された細胞の運命は、細胞を追跡するための、明確で異なる細胞標識法は、最近記載されているではありません。蛍光タグで標識された細胞は、比較的少数（&lt;10％）10,11の中で生き残ることが示されました。蛍光ラベルが必要組織抽出と時間がかかり、容易に大規模な動物モデルまたは臨床例では、時間的分析を容易にしない組織学的分析のために切片。より最近の研究では、細胞を標識し、ガンマシンチグラフィー1によって彼らの運命を追跡するために放射性同位体99m Tcでを使用しています。この方法は、12動脈内または静脈内注射1,12経由頚静脈1または地域の灌流を介した静脈内、迅速な比較は病巣内などの細胞送達の異なる経路間で行うことを可能にします。細胞の持続性及び分布は、その後、種々の器官のガンマシンチグラフィーにより画像化することができます。これは、病巣内に注射された細胞のわずか24％が24時間で1病変に残り、これは他の研究実験を使用して作成された病変と同一の放射性標識5を使用してサポートされていることを実証しました。さらに、細胞はdelivere腱病変に家に限られた能力を示し、局所灌流によってDまたは静脈内投与が、後者の経路4によって肺に分散されます。 鉄ナノ粒子で標識されたBMMSCは前肢の腱13内に移植された細胞を追跡するための別の方法です。鉄ナノ粒子標識された細胞は、MRIによるインビボでの細胞の追跡を可能にするが、大型動物の経時研究は麻酔がMRIスキャンを実行するためのそれぞれの時点で投与することができる回数によって制限されます。また、鉄ナノ粒子は、腱の体内への標識細胞の移行に関する情報を制限し、MRI上の低強度です。使用できる他の放射性同位体は、インジウム-111を含むが、これはのTc-99メートル（2.8日対6.0時間）以上のガンマ線放射エネルギーよりも長い半減期の不利益を被ります。加えて、細胞生存率は、インジウム-111 14で標識されたときに減少することが報告されています。 TC-99メートルは、一方で、日常的にウマおよびヒトの両方の核に使用され薬は、末梢血単核細胞を標識し、シンチグラフィーにより生体内でそれらの分布に従うこと。これは、比較的容易に細胞へのTC-99メートル-HMPAOとして、テクネチウムを結合するためのリンカー分子としてHMPAOを用いて細胞に取り込ませることができます。 Tc-99メートル-HMPAOはBMMSCが良いの生存率を示し、 試験管 4 で増殖することができるラベルされました。このプロトコルは、前肢SDFTで天然に存在する病巣に移植ラベリングおよびウマ自家BMMSCの追跡を詳細に説明します。 これは、プロトコルが唯一の研究ツールとして使用することを意図していることに注意することが重要です。細胞表現型の放射性標識の効果が十分に解明されていないような臨床治療法としてのその使用は推奨されません。

<table><tbody><tr><td>Technetium&lt;sup&gt;99m&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements.&amp;nbsp; The isotope must be used within 2 hr of elution from the molybdenum-99 generator</td></tr><tr><td>Ceretec - Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO)&amp;nbsp;</td><td>GE HealthCare</td><td></td><td>Please enquire directly with GE HealthCare</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfuge, Minispin/Minispin Plus</td><td>Ependorf</td><td>22620100</td><td></td></tr><tr><td>18 G and 19 G Needles</td><td>Terumo Medical</td><td>NN-1838R (18 G);&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; NN1938R (19 G)</td><td></td></tr><tr><td>Syringes 1 ml and 2 ml</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd</td><td>SYR6200 (1 ml); SYR6003 (2 ml)</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes 1.5 ml</td><td>Greiner Bio-One Ltd</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>PBS - Phosphate-Buffered Saline</td><td>LifeTechnologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Gauze Swabs</td><td>Shermond Ltd</td><td>UNG602</td><td></td></tr><tr><td>CoflexVet self adhering bandage</td><td>Andover Healthcare, Inc.</td><td>3540RB-018</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasound imaging software</td><td>Scion Image, Scion Corporation, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicasXplus Scintigram processing software</td><td>Bartec Technologies Ltd</td><td></td><td>http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html</td></tr><tr><td>Field isotope counter for monitoring isotope</td><td>John Caunt U.K.</td><td>GMS1800a</td><td>http://www.johncaunt.com/</td></tr><tr><td>Well counter for isotope measurements, dose calibrator</td><td>Capintec Southern Scientific</td><td>CRC-25R</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imaging and tracking of technetium-99m labeled bone marrow mesenchymal stem cells in equine tendinopathy

馬での腱や靭帯損傷の治療のための骨髄間葉系幹細胞（BMMSC）の適用における最近の進歩は、実験的および臨床研究の両方でアウトカム指標が改善することをお勧めします。 BMMSCが大量に腱損傷に移植されていますが（通常は10から20000000細胞）、比較的少数が生き残る（&lt;10％）、これらは、移植後までの5ヶ月間持続することができますが。これはBMMSCは、他の組織に移植されており、それは多くの人が最初の注入プロセスを生き残るためには、細胞が他の臓器にクリアされているかどうかをどのように、この損失が発生したときに理解することが重要である他の種における共通の観察であるように思われます。細胞の運命を追跡する前に細胞数のセルの位置と定量化のin vivoイメージングで非侵襲的に移植可能BMMSCを放射標識することによって達成することができます。 このプロトコルは、電池が記載さlabeli馬で負傷した屈筋腱にテクネチウム-99m（Tc-99m）、および移植後のこれらの細胞の追跡を使用していますngの手順。 Tc-99メートルは、ガンマ線を放射し、親油性化合物のhexamethylpropyleneamineオキシム（HMPAO）の存在下で細胞によって内在化することができ短命（6.01時間のT 1/2）同位体です。これらの特性は、多くの異なる疾患の診断のための核医学診療所での使用に最適です。標識された細胞の運命は、肺、甲状腺および他の器官への細胞の病巣と流通に保持された細胞の数の両方を定量化するためにガンマシンチグラフィーによって（36時間まで）短期的に続くことができます。この技術は、血液白血球の標識から適合され、他の臓器に移植BMMSC画像に利用することができます。

BMMSsへのTc-99メートル-HMPAOの取り込みは悪の組織培養プラスチックに付着する能力には影響しません、彼らは（ 図1）単分子膜を形成するために増殖能を示しているが、我々は、増殖速度または他の細胞の表現型に影響を与えているかどうかを完全に決定されていません。その形態は、典型的な紡錘状の非標識細胞と同様です。細胞の標識効率（すなわち、ラベルの、取り?...

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In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

馬腱でテクネチウム-99m標識骨髄間葉系幹細胞のin vivoイメージングと追跡中

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

9.7K ビュー.  The Royal Veterinary College. This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

ビデオ: In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

MRイメージングと生体内追跡非侵襲のための酸化鉄ナノ粒子で標識ヒトES細胞とhMSCs

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

生物学

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

磁気共鳴イメージング、体積CT画像と超音波を用いた乳がんの骨転移のヌードラットモデルにおける血管新生のマルチモーダルイメージング

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

医学

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the efficacy of cell persistence and biodistribution of haMSCs in animal models. We demonstrated a method to label the cell membrane of haMSCs with lipophilic fluorescent dye. Subsequently, intra-articular injection of the labeled cells in rats with surgically induced KOA was monitored dynamically by an in vivo imaging system. We employed the lipophilic carbocyanines DiD (DilC18 (5)), a far-red fluorescent Dil (dialkylcarbocyanines) analog, which utilized a red laser to avoid excitation of the natural green autofluorescence from surrounding tissues. Furthermore, the red-shifted emission spectra of DiD allowed deep-tissue imaging in live animals and the labeling procedure caused no cytotoxic effects or functional damage to haMSCs. This approach has been shown to be an efficient tracking method for haMSCs in a rat KOA model. The application of this method could also be used to determine the optimal administration route and dosage of MSCs from other sources in pre-clinical studies.

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

This protocol describes an efficient way to monitor the cell persistence and biodistribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells (haMSCs) by far-red fluorescence labeling in a rat knee osteoarthritis (KOA) model via intra-articular (IA) injection.

生体内でひと脂肪由来間葉系幹細胞が脂溶性膜の蛍光色素をラット膝関節変形性関節症モデルでの追跡

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

発生生物学

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

で小動物の筋肉の生着のダイナミクスの追跡インビボでの蛍光イメージング

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

シーケンシャル<em&gt;インビボ</em&gt;骨折修復中に、骨形成幹細胞/前駆細胞のイメージング

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

マウス骨髄単球の追跡<em&gt;インビボ</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

免疫・感染学

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of therapies to enhance fracture healing.&#160; Periosteal cells rapidly migrate to an injury to supply new chondrocytes and osteoblasts for fracture healing. Traditionally, the efficacy of a cytokine to induce cell migration has only been conducted in vitro by performing a transwell or scratch assay. With advancements in intravital microscopy using multiphoton excitation, it was recently discovered that 1) P-SSCs express the migratory gene CCR5 and 2) treatment with the CCR5 ligand known as CCL5 improves fracture healing and the migration of P-SSCs in response to CCL5. These results have been captured in real-time. Described here is a protocol to visualize P-SSC migration from the calvarial suture skeletal stem cell (SSC) niche towards an injury after treatment with CCL5. The protocol details the construction of a mouse restraint and imaging mount, surgical preparation of the mouse calvaria, induction of a calvaria defect, and acquisition of time-lapse imaging.

This protocol describes the detection of CCL5-mediated periosteal skeletal stem cell migration in real-time using live animal intravital microscopy.

マウスにおけるペリオスチール骨格幹細胞のCCL5誘導性移行のリアルタイムイメージング

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

Ultrasound-guided Intracardiac Injection of Human Mesenchymal Stem Cells to Increase Homing to the Intestine for Use in Murine Models of Experimental Inflammatory Bowel Diseases

Crohn&#39;s disease (CD) is a common chronic inflammatory disease of the small and large intestines. Murine and human mesenchymal stem cells (MSCs) have immunosuppressive potential and have been shown to suppress inflammation in mouse models of intestinal inflammation, even though the route of administration can limit their homing and effectiveness 1,3,4,5. Local application of MSCs to colonic injury models has shown greater efficacy at ameliorating inflammation in the colon. However, there is paucity of data on techniques to enhance the localization of human bone marrow-derived MSCs (hMSCs) to the small intestine, the site of inflammation in the SAMP-1/YitFc (SAMP) model of experimental Crohn&#39;s disease. This work describes a novel technique for the ultrasound-guided intracardiac injection of hMSCs in SAMP mice, a well-characterized spontaneous model of chronic intestinal inflammation. Sex- and age-matched, inflammation-free AKR/J (AKR) mice were used as controls. To analyze the biodistribution and the localization, hMSCs were transduced with a lentivirus containing a triple reporter. The triple reporter consisted of firefly luciferase (fl), for bioluminescent imaging; monomeric red fluorescent protein (mrfp), for cell sorting; and truncated herpes simplex virus thymidine kinase (ttk), for positron emission tomography (PET) imaging. The results of this study show that 24 h after the intracardiac administration, hMSCs localize in the small intestine of SAMP mice as opposed to inflammation-free AKR mice. This novel, ultrasound-guided injection of hMSCs in the left ventricle of SAMP mice ensures a high success rate of cell delivery, allowing for the rapid recovery of mice with minimal morbidity and mortality. This technique could be a useful method for the enhanced localization of MSCs in other models of small-intestinal inflammation, such as TNF&#916;RE6. Future studies will determine if the increased localization of hMSCs by intra-arterial delivery can lead to increased therapeutic efficacy.

Murine studies in models of colonic inflammation have demonstrated that a small percentage (1 - 5%) of mesenchymal stem cells (MSC) injected intravenously or intraperitoneally home to the inflamed colon1,2. This study shows that ultrasound-guided intracardiac injections of MSCs result in increased localization to the intestine.

実験的炎症性腸病気のマウスモデルで使用するため、腸管へのホーミングを増加するヒト間葉系幹細胞の超音波ガイド下心臓内注射

Crohn&#39;s disease (CD) is a common chronic inflammatory disease of the small and large intestines. Murine and human mesenchymal stem cells (MSCs) have ...

Tracking Superparamagnetic Iron Oxide-labeled Mesenchymal Stem Cells using MRI after Intranasal Delivery in a Traumatic Brain Injury Murine Model

Stem cell-based therapies for brain injuries, such as traumatic brain injury (TBI), are a promising approach for clinical trials. However, technical hurdles such as invasive cell delivery and tracking with low transplantation efficiency remain challenges in translational stem-based therapy. This article describes an emerging technique for stem cell labeling and tracking based on the labeling of the mesenchymal stem cells (MSCs) with superparamagnetic iron oxide (SPIO)&#160;nanoparticles, as well as intranasal delivery of the labeled MSCs. These nanoparticles are fluorescein isothiocyanate (FITC)-embedded and safe to label the MSCs, which are subsequently delivered to the brains of TBI-induced mice by the intranasal route. They are then tracked non-invasively in vivo by real-time magnetic resonance imaging (MRI). Important advantages of this technique that combines SPIO for cell labeling and intranasal delivery include (1) non-invasive, in vivo MSC tracking after delivery for long tracking periods, (2) the possibility of multiple dosing regimens due to the non-invasive route of MSC delivery, and (3) possible applications to humans, owing to the safety of SPIO, non-invasive nature of the cell-tracking method by MRI, and route of administration.

Presented here is a protocol for non-invasive mesenchymal stem cell (MSC) delivery and tracking in a mouse model of traumatic brain injury. Superparamagnetic iron oxide&#160;nanoparticles are employed as a magnetic resonance imaging (MRI) probe for MSC labeling and non-invasive in vivo tracking following intranasal delivery using real-time MRI.

外傷性脳損傷マウスモデルにおける鼻腔内送達後のMRIを用いた超常磁性酸化鉄標識間葉系幹細胞の追跡

Stem cell-based therapies for brain injuries, such as traumatic brain injury (TBI), are a promising approach for clinical trials. However, technical ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

馬腱でテクネチウム-99m標識骨髄間葉系幹細胞のin vivoイメージングと追跡中

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