The authors would like to acknowledge funding from the Horserace Betting Levy Board U.K. (grant number 721) and VetCell BioScience Ltd, U.K. and by Consejer&#236;a de Innovaci&#242;n, Ciencia y Empresa, Junta de Andaluc&#236;a, Spain.

Os casos aqui descritos foram realizados seguinte permissão de Ética concedidas pelo Comité de animal Ética e Bem-Estar da Colegio de Veterinarios de Málaga, em Espanha, e do Royal Veterinary College, North Mymms, Reino Unido Os procedimentos utilizados nos cavalos são baseados em protocolos aprovados que são utilizado na clínica em cavalos que recebem terapias baseadas células-tronco que inclui sedação, aspiração de medula óssea, a injeção intra-tendinosa, perfusão regional, injecção intravenosa, pós-tratamento processual e dor gestão e monitorização após a implantação. 1. As modalidades-chave a ser feitas com antecedência <ol><li> Procure ética institucionais e bem-estar dos animais aprovação e aderir aos requisitos legais locais antes de iniciar o trabalho. </li><li> Buscar a aprovação institucional para trabalhar com radiação ionizante, como ditado pelos regulamentos locais e legais, incluindo o nível adequado de protecção do pessoal e do ambiente e à eliminação dos CONTAMnados resíduos. </li><li> Utilize os seguintes critérios de inclusão: cavalos presentes com uma lesão overstrain não traumática (tendinopatia ou desmopathy) para o tendão flexor digital superficial do membro torácico e lesões resultantes de um defeito dentro do tendão eo defeito é cercado por tendão e / ou paratenon intacta . Nota: O exame e diagnóstico para tais lesões ea preparação clínica dos cavalos para implante de células foi detalhado em outros lugares 6,15. Nota: O isolamento e expansão em cultura de BMMSC derivada da medula óssea de cavalos tem sido descrito anteriormente 6,16. O protocolo atual para injetar BMMSC para lesões TFDS no cavalo usa 10 milhões de células por ml de sobrenadante 4 autólogo de medula óssea (BMS) 16. </li><li> Use células que sofreram não mais de 4 passagens para implantação in vivo, para evitar potenciais fenótipo celular ou alterações genéticas associadas com o número elevado passagem cells. </li><li> Entregar o número necessário de células do BMS (dentro de 24 horas numa caixa fria a 4 - 8 ° C) para a clínica veterinária, onde o implante de células é para ser realizado. Nota: O uso clínico de células-tronco mesenquimais em sobrenadante de medula óssea é um processo patenteado de propriedade de ReCellerate Inc (EUA) e sua utilização pode exigir autorização. Nota: Tc-99m é um emissor gama (140 KeV), com uma meia-vida relativamente curta (6,0058 h, por conseguinte, cerca de 94% de ele decai para a sua forma estável de 99 Tc em 24 horas). A energia gamma o torna adequado para a detecção através de câmaras gama (cintilografia) e os resultados a curto meia-vida em tempo muito limitado exposição à radiação para o cavalo eo pessoal de manipulação animal. Este protocolo descreve a rotulagem no local de células usando Tc-99m-HMPAO [HMPAO marcado com Tc-99m (como pertecnetato de sódio)]. </li><li> Ordenar a Tc-99m fresco do fornecedor de tal forma que é entregue e usado para rotular a sagacidade célulashin 2 horas de eluição a partir do gerador de Tc-99m. Assegurar que o Tc-99m é fornecido como 1 GBq em (tampão padrão do fornecedor) a 1 ml de solução. </li><li> Use todos os buffers em RT. Realizar o processo de rotulagem, a implantação das células e imagiologia (cintigrafia gama) em um quarto de contenção isótopo com todo o equipamento limpa com álcool limpa antes do início do trabalho. </li></ol> 2. Preparação do Cavalo e ultra-sonografia do membro anterior Tendão <ol><li> Varreduras ficha de ultra-som na primeira admissão de lesão (quando é aspirado de medula óssea) e, em seguida, no ponto de tempo quando as células marcadas radioactivamente são injectados. </li><li> Execute ultra-sonografia e implante de células com o cavalo carrega o peso uniformemente em uma tenda e sob sedação pé (ao invés de anestesia geral). Administrar sedação utilizando uma mistura de HCl a detomidina e tartarato de butorfanol, cada um na concentração de 0,01 para 0,02 mg / kg IV. Nota: A recuperação é rápida e pós-cirúrgico não requer nenhum tratamentoconsiderações especiais. </li><li> Após anestesia perineural é aplicada (passo 2.6) no membro afectado, manter o cavalo na estação sob sedação para reduzir o movimento do cavalo durante o tratamento. Verifique visualmente o nível adequado de sedação julgados a partir da posição de cabeça baixa eo comportamento do cavalo e que o cavalo é confortável durante a injeção de células e os movimentos da câmara gama durante a aquisição das imagens cintilográficas. Nota: Não é necessário aplicar a pomada veterinário em olhos (para evitar a secura) porque sob sedação piscar não é afectado e o cavalo é capaz de manter a hidratação dos olhos. O acompanhamento após a implantação das células é não-invasiva (ultra-som e cintigrafia gama). </li><li> Clipe de perto o cabelo que cobre o tendão (com cortar cabelo cavalo), em seguida, limpar a área cortada usando uma combinação de um matagal cirúrgica clorexidina e finalmente álcool. </li><li> Aplique o gel de acoplamento acústico para a área emetodicamente varredura para gravar scans da região palmar metacarpo completo, níveis rotulados sequencialmente 1 - 7 17, com um transdutor linear (12 MHz ou similar) para obter série transversal on-incidência e imagens longitudinais. Armazenar as imagens digitalmente de modo a que a área de secção transversal e a zona de lesão máxima 4 pode ser obtida com o auxílio do software de análise de imagem. </li><li> Preparar a área que se sobrepõe à nervos palmares imediatamente distal ao carpo por injecção asséptica de anestésico local para assegurar a dessensibilização completa da pele que recobre o tendão e o tendão flexor digital superficial. Injectar 2 ml de mepivicaine tanto por via subcutânea e adjacentes aos nervos palmares (na sua localização sub-fascial) entre os tendões flexores e o ligamento suspensor imediatamente distai ao carpo em ambos os lados do membro. </li><li> Quando a verificação preliminar foi realizada preparar o local de implantação por esfregar a área com clorexidina s cirúrgicossolução crub por pelo menos 5 minutos e finalmente álcool com gaze embebida. Execute todas as etapas subsequentes de forma asséptica. </li></ol> 3. Tc-99m-rotulagem de Equine Células-Tronco Mesenquimais Nota: As etapas de rotulagem de células pode ser realizada durante a ultrassonografia do membro anterior como isso vai minimizar o decaimento do isótopo entre marcação celular e implantação de células marcadas no tendão. <ol><li> Remova a BMS a partir das células, uma vez que interfere com a absorção de isótopos. Para fazer isso, recuperar o frasco de BMMSC (10 milhões de células em 1 ml de BMS) da caixa de frio e sedimentar as células numa microcentrífuga a 350 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante cuidadosamente com uma agulha de 18G ou 19G (ligada a uma seringa de 2 ml), deixando uma pequena gota (≤0.1 ml) no tubo para ajudar a ressuspensão célula. Guardar o sobrenadante (BMS) num tubo de microcentrífuga estéril e manter em gelo para reutilização posterior. </li><li> Ressuspender as células em a gota residual do sobrenadante por FLIcking o tubo suavemente com os dedos (ao invés de vórtice) e deixar o tubo num suporte à temperatura ambiente. Assegurar que as células são completamente ressuspenso e que não existem aglomerados de células visíveis. </li><li> Prepara-se o Tc-99m como se segue. Transferir 1 ml de pertecnetato de tecnécio para um frasco de HMPAO utilizando uma seringa de 1 ml e agulha. Misture delicadamente mas completamente e deixe por 5 minutos atrás chumbo blindagem. Nota: Esta etapa pode ser feito enquanto as células estão girando no passo 2.1. </li><li> Adicionar toda a mistura Tc-99m-HMPAO utilizando uma seringa de 1 ml e agulha para as células e misturar suavemente. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente por trás protecção de chumbo. </li><li> Para os passos seguintes, utilizar uma pinça (ou um pedaço de papel de tecido) para abrir a tampa do tubo de microcentrífuga para minimizar a contaminação isotópica do polegar (enluvada) e subsequentemente outro equipamento. Use uma seringa de 2 ml e 21 G agulha para adicionar ou remover o tampão de lavagem. Nota: O uso de um monitor de campo isótopo é estimulado para monitorar a contaminação das superfícies e equipamentos. </li&gt; <li> Adicionar 1 mL de PBS à mistura-99m-HMPAO-célula Tc, fechar a tampa, agitar suavemente e centrifugação para sedimentar as células como no passo 3.1. </li><li> Retire cuidadosamente o PBS para um novo tubo (salvar esta atrás de blindagem de chumbo e etiqueta como W1). Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de PBS fresco. Centrifugar o tubo e remover o sobrenadante como acima (e salvar este rótulo como W2). </li><li> Calcula-se a eficiência de marcação medindo as contagens em tubos de W1 e W2 e no sedimento celular. Fazer isso colocando cada tubos em uma dose isótopo instrumento calibrador Bem e gravar a radioactividade em contagens por minuto (CPM). Calcula-se a eficiência de marcação como (A radioactividade como CPM de células) / (A radioactividade das células sobrenadante +) x 100. </li><li> Volte a suspender as células completamente na PBS residual e, em seguida, adicione o BMS salvos a partir do passo 3.1. As células estão prontas para implantação intralesional. </li></ol> 4. Implantação de células Tc-99m-HMPAO-rotulados <ol><li> Implantação Intralesionalno tendão sob a orientação de ultra-som <ol><li> Lentamente introduzir uma polegada de 1,5 ou 2 (50 mm) de agulha de 20 G para a zona de máxima lesão da lesão numa orientação longitudinal, com o transdutor de ultra-sons, coberto de um campo estéril, em linha com a agulha de modo a que o comprimento da agulha pode ser identificados ultrassonografia e a ponta se a agulha está localizada com precisão no centro da lesão. </li><li> Usando blindagem apropriado, recolher as células em uma seringa de 2 ml (de bloqueio Luer, para minimizar o risco de contaminação externa e uma tampa na seringa de blindagem de chumbo), utilizando uma agulha de 20 G. Deite fora a agulha com cuidado para não perder nenhum fluido. Agora fixar a seringa com as células marcadas para a agulha pré-localizado no tendão. </li><li> Coloque a sonda de ultra-sons sob a agulha de modo que a agulha do aparelho no tecido é claramente visível. Injetar as células em um ritmo lento mas constante na lesão. Assegure-se que não há resistência à injecção. Se este for encontradocuidadosamente reposicionar a agulha sob a orientação de ultra-som. Verifique se o ejetando fluido na lesão é visível a imagem de ultra-som como fluido anecóica contendo bolhas de ar no hiperecogênicas. </li><li> Retirar a agulha e colocar imediatamente a pressão por cima do buraco da agulha para evitar perda de células injectadas e para minimizar a propagação de isótopo através da superfície externa do membro. Vestir imediatamente o membro com uma camada de atadura autoadhesive. O cavalo está pronto para cintigrafia gama. Execute este imediatamente. Nota: Após a injecção das células no tendão, adquirir uma contagem da seringa vazia e agulha para avaliar a possível perda directa de células que podem permanecer na seringa. </li></ol></li><li> Perfusão de células Tc-99m-HMPAO-rotulados Regional <ol><li> Siga o passo 2.4. </li><li> Aplique uma 100 milímetros torniquete de borracha bandagem no metacarpo proximal com dois 100 milímetros rolo de algodão gaze posicionada medial e lateralmente. </li><li> Assepticamente preparar the a pele sobre a veia digitais palmar lateral ao nível da sesamóides proximais laterais esfregando a área com uma solução de limpeza cirúrgica clorexidina durante pelo menos 5 minutos e, finalmente, com gaze embebida em álcool. Execute todas as etapas subsequentes de forma asséptica. </li><li> Prepara-se uma extensão de 100 mm ajustada com uma 21 G x ¾ &quot;(0,8 x 19 mm) para a agulha de borboleta punção venosa de enchimento com soro fisiológico estéril heparinizado e, em seguida, introduzir a agulha na veia digitais palmar lateral. Uma vez que o sangue da veia é inserido irá preencher parcialmente o conjunto de extensão. Ao conector de bloqueio Luer anexar uma tampa de borracha de bloqueio Luer para facilitar subsequente injecção de células marcadas. </li><li> Diluir as MSCs em 19 ml de PBS, recolhendo as células em uma seringa de 20 ml pré-carregado com o PBS. Aplicar as células através da taça de borracha utilizando um 18 g (1,2 x 40 mm) agulha hipodérmica a um ritmo lento mas constante (30 - 40 segundos). Limpar o cateter com 1 ml de PBS, pré-carregado num syringe. </li><li> Remover a agulha e imediatamente aplicar pressão na pele sobre o orifio de agulha com uma camada de cinco 4 x 4 gazes de algodão. Em seguida, colocar uma ligadura elástica da luz com adesivo sobre a área sesamoid proximal e deixar o torniquete no lugar durante 30 minutos após a injecção. </li><li> Solte o torniquete após 30 min. O cavalo está pronto para cintigrafia gama. Nota: Depois de injetar as células, adquirir uma contagem da seringa vazia e agulha para avaliar possível perda direta de células que podem permanecer na seringa. </li></ol></li></ol> 5. Gamma Cintilografia <ol><li> Imagens cintilografia <ol><li> Adquirir imagens planar cintilografia com uma câmara gama (fixado em 140 KeV pico fotoelétrico usando uma janela simétrica 20%), equipado com uma baixa energia, colimador buraco paralelo. <ol><li> Obter todas as imagens após o tempo 0 em cavalos sedados como no passo 2.2 em pé. Após o tempo de 0 scintigram, substituir a bandagem luz sobre a implantação site com uma bandagem acolchoada. Remover esta bandagem antes de cada exame de cintilografia. </li><li> Adquirir imagens estáticas durante 60 segundos cada (matriz de 256 por 256), utilizando o software de processamento com a &quot;adquirir&quot; - &quot;seleção do estudo&quot; - opções &quot;ósseos estáticos&quot;. É essencial que o cavalo não se mover durante o período de aquisição de imagem, porque a opção de modo estático não tem um módulo para a correcção de movimento. </li><li> Para injecção intralesional, obter imagens laterais da área de lesão do carpo até a extremidade distal, a área equivalente do membro contralateral, o campo pulmão esquerdo eo esquerdo da tireóide. Durante a aquisição de membros dianteiros imagens, posicione a tela de liderança entre as pernas para evitar a formação de imagens do contralateral membro. Adquirir as imagens em 5 min após a injecção (tempo 0), e, em seguida, com 1, 3, 6, 12, 24, 36 e 48 h. </li><li> Para perfusão regional, obter imagens gama laterais e dorsal como por 5.1.1.3. Obter imagens 5 min afliberação do torniquete ter. Este será o tempo 0. Pode ser útil para a imagem do membro imediatamente após a injecção das células para avaliar as contagens de libertação antes de torniquete. Obtenção de imagens gama com 1, 3, 6, 12, 24, 36 e 48 horas após a administração das células. </li></ol></li><li> Depois que as imagens tenham sido adquiridos, processar as imagens manualmente usando a opção &quot;transformação&quot; do software com opções selecionadas para cor &quot;Sokoloff&quot; e &quot;Inverter&quot; cor. Em seguida, selecione a &quot;região de interesse&quot; (ROI) e &quot;elipse&quot;, pois isso permite reformulação da máscara de seleção e movimento sobre a área da lesão. Obter as contagens sobre o ROI, escolhendo a opção &quot;adicionar as estatísticas&quot;. Certifique-se de que as regiões de tamanho idêntico de interesse (ROI) são gravadas para cada animal nos diferentes pontos de tempo. </li><li> Em seguida, as contagens para corrigir o decaimento prevista do tecnécio em cada ponto de tempo. Use a seguinte equação para corrigir a decadência:A = O e - (0.693t / T 1/2), em que A é O a actividade inicial do isótopo, A é ​​o decaimento da radioactividade corrigida no tempo zero, t é o tempo decorrido e o t 1/2 representa a metade -life do isótopo. Em seguida, expressar as contagens corrigidas em cada ponto de tempo como uma percentagem do ROI no tempo 0 para trabalhar a percentagem de células restantes, utilizando a seguinte fórmula: </li></ol></li></ol> % restantes células (t) = 100 - {[(decaimento previsto (T) - de decaimento (t)) / previu decaimento (t)]} x 100 decaimento (t) = ROI (t) / ROI (0) x 100.

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JD and RKS are Scientific Advisory Board members to ReCellerate Inc.

Além de medula óssea, as células estaminais isoladas a partir de fontes tais como o tecido adiposo são adequados para marcação com este protocolo. Além disso, as células de um estado congelado pode ser revivido e expandidas em cultura para os números desejados para estudos de rotulagem 12. Um factor crítico que determina a eficiência de marcação do BMMSC é o tempo entre a eluição do Tc-99m a partir do gerador de molibdénio no radiopharmacy, Preparação de Tc-99m-...

Estratégias regenerativos para a reparação dos tecidos doentes ou danificados são baseados em células estaminais multipotentes derivadas de uma variedade de tecidos e implantados na área afectada. Os recentes avanços na aplicação das autólogo BMMSC para o tratamento do tendão e lesões ligamentares no cavalo têm mostrado melhorar as medidas de resultado, tanto experimental 1-5 e estudos clínicos 6. O cavalo é um modelo particularmente atraente para avaliar a eficácia de células-tronco tratamentos relacionados porque ele sofre de idade e overstrain lesões relacionadas com os tendões do membro anterior distal, é um animal atlético, e é uma facilitando a recuperação grande, medula óssea e implantação precisa. Lesões do tendão de curar naturalmente com fibrose mas o tendão curado é funcionalmente inferior 7 e tem um alto risco de nova lesão 8. O tendão flexor digital superficial (TFDS) é mais comumente afetados como tem evoluído a agir como uma energia elásticaloja e experiências de alta carga salienta a alcançar eficiência energética e locomoção de alta velocidade. Restaurar a função após a lesão é, portanto, fundamental. Estas lesões são semelhantes às que ocorrem no tendão de Aquiles em seres humanos, que desempenha uma função semelhante 9. Não existem opções boas de tratamento para tratar ou alcançar bom estado de conservação para essas lesões, as estratégias regenerativas, portanto, com base nas células oferecem uma oportunidade atraente para melhorar os resultados e reduzir a re-ferimento. Na maioria dos estudos de 5 - 20 milhões de BMMSC autólogo são injectados directamente na lesão, que normalmente ocorrem no interior do núcleo do corpo que, por conseguinte, tendão actua como um receptáculo para as células. O destino das células injetadas uma vez não é métodos claros e diferentes de rotulagem celular para rastrear as células foram descritos recentemente. As células marcadas com um marcador de fluorescência foram mostrados para sobreviver apenas em quantidades relativamente pequenas (&lt;10%) 10,11. Etiquetas de fluorescência exigirextracção de tecidos e para análise histológica de corte, que é moroso e não prontamente facilitar a análise temporal em um modelo animal grande ou nos casos clínicos. Em trabalhos mais recentes que temos usado o radioisótopo 99m Tc para rotular células e seguir seu destino por cintigrafia gama 1. Este método permite comparações rápidas para ser feita entre diferentes vias de administração de células, incluindo por via intravenosa, intralesional através da veia jugular 1 ou perfusão regional via intra-arterial ou intravenosa, 12 1,12 injecções. A persistência e distribuição de células podem então ser trabalhada por cintigrafia gama de vários órgãos. Isto demonstrou que apenas 24% das células injectadas intralesionalmente permaneceu na lesão por 1 h 24 e este é suportado por um outro estudo usando lesões criados experimentalmente e usando o mesmo marcador radioactivo 5. Além disso, as células apresentam capacidade limitada para casa em lesões tendíneas quando delivered por perfusão regional ou por via intravenosa, mas são dispersos nos pulmões pelas últimas vias 4. BMMSC marcadas com nanopartículas de ferro é um método alternativo para controlar células implantadas em tendões 13 membros anteriores. Embora as células marcadas de nanopartículas de ferro permitir o rastreamento de células in vivo por ressonância magnética, os estudos temporais em um animal de grande porte são limitados pelo número de vezes que a anestesia pode ser administrada em cada ponto de tempo para realizar as imagens de ressonância magnética. Além disso, as nanopartículas de ferro são hipointensa em MRI que limita a informação sobre a migração de células marcadas no corpo do tendão. Outros isótopos radioactivos que podem ser utilizados incluem Índio-111, mas esta tem a desvantagem de uma meia-vida mais longa do que o Tc-99m (2,8 dias vs 6,0 h) e uma energia mais elevada de emissão de raios gama. Além disso, a viabilidade celular foi relatado para ser reduzida quando marcados com índio-111 14. Tc-99m, por outro lado, é rotineiramente utilizada em ambos nuclear equina e humanamedicina para rotular células mononucleares do sangue periférico e siga sua distribuição in vivo pela cintilografia. Ele pode ser relativamente facilmente absorvidos pelas células utilizando HMPAO como uma molécula de ligação para ligar o tecnécio, como Tc-99m-HMPAO, às células. Tc-99m-HMPAO marcado BMMSC mostrar boa viabilidade e podem proliferar in vitro 4. Este protocolo detalha a rotulagem e rastreamento de BMMSC autólogo eqüino implantados em lesões que ocorrem naturalmente no TFDS membro anterior. É importante notar que o protocolo destina-se apenas a ser utilizado como uma ferramenta de pesquisa. A sua utilização como uma modalidade terapêutica clínica não é recomendada como o efeito do marcador radioactivo no fenótipo celular não foi totalmente elucidado.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Technetium99m&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements.&#160; The isotope must be used within 2 h of elution from the molybdenum-99 generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceretec - Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO)&#160;</td>
			<td>GE HealthCare</td>
			<td></td>
			<td>Please enquire directly with GE HealthCare</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge, Minispin/Minispin Plus</td>
			<td>Ependorf</td>
			<td>22620100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G and 19G Needles</td>
			<td>Terumo Medical</td>
			<td>NN-1838R (18G);&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; NN1938R (19G)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 mL and 2 mL</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd</td>
			<td>SYR6200 (1 mL); SYR6003 (2 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One Ltd</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS - Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Swabs</td>
			<td>Shermond Ltd</td>
			<td>UNG602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoflexVet self adhering bandage</td>
			<td>Andover Healthcare, Inc.</td>
			<td>3540RB-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound imaging software</td>
			<td>Scion Image, Scion Corporation, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicasXplus Scintigram processing software</td>
			<td>Bartec Technologies Ltd</td>
			<td></td>
			<td>http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Field isotope counter for monitoring isotope</td>
			<td>John Caunt U.K.</td>
			<td>GMS1800a</td>
			<td>http://www.johncaunt.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well counter for isotope measurements, dose calibrator</td>
			<td>Capintec Southern Scientific</td>
			<td>CRC-25R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging and tracking of technetium-99m labeled bone marrow mesenchymal stem cells in equine tendinopathy

Recentes avanços na aplicação de células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMMSC) para o tratamento de lesões de tendões e ligamentos no cavalo sugerem melhorou medidas de resultados em ambos os estudos experimentais e clínicos. Embora o BMMSC está implantado no interior da lesão do tendão em grandes números (geralmente 10 - 20 milhões de células), apenas um número relativamente pequeno sobrevivência (&lt;10%), embora estes podem persistir por até 5 meses após a implantação. Esta parece ser uma observação comum em outras espécies onde BMMSC foram implantados em outros tecidos e é importante para entender quando ocorre esta perda, quantas sobreviver ao processo de implantação inicial e se as células são apagadas em outros órgãos. Acompanhando o destino das células pode ser conseguida por radiomarcação do BMMSC antes da implantação que permite não invasiva in vivo de imagens de localização da célula e a quantificação do número de células. Este protocolo descreve uma célula labeling procedimento que usa Tecnécio-99m (Tc-99m), e acompanhamento destas células após a implantação em tendões flexores de feridos em cavalos. Tc-99m é uma (t 1/2 de 6,01 h) do isótopo de vida curta que emite raios gama e podem ser internalizados pelas células na presença do composto lipofílico hexametilpropilenoamina oxima (HMPAO). Essas propriedades tornam ideal para uso em clínicas de medicina nuclear para o diagnóstico de muitas doenças diferentes. O destino das células marcadas podem ser seguidas no curto prazo (até 36 horas) por cintigrafia gama para quantificar tanto o número de células retidos na lesão e distribuição das células nos pulmões, tireóide e outros órgãos. Esta técnica é uma adaptação da rotulagem dos leucócitos do sangue e pode ser utilizado para imagem BMMSC implantado em outros órgãos.

Tc-99m-HMPAO incorporação BMMSs não afeta negativamente a sua capacidade de aderir à cultura de tecidos de plástico e enquanto eles mostram capacidade de proliferação para formar monocamadas (Figura 1) que não tem completamente determinado se as taxas de proliferação ou outros fenótipos celulares são afetados. A sua morfologia é semelhante às células não marcadas com uma forma típica de fuso. A eficiência de marcação celular (isto é., A captação do marcador) tipicamente v...

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In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

In Vivo Imaging and Rastreamento de Tecnécio-99m Rotulado de Medula Óssea Células-Tronco Mesenquimais em Equine Tendinopatia

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

9.7K visualizações.  The Royal Veterinary College. This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

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Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

A avaliação pré-clínica da tirosina quinase inibidores para o tratamento de leucemia aguda

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Medicina

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F MRI para Rastreamento celular

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Seqüente<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de osteogênicas células-tronco / progenitoras durante o reparo de fratura

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Femoral Medula Óssea aspiração Live Ratos

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Estudar o cancro do pâncreas Stem características celulares para desenvolver estratégias Novo tratamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Isolation and Cellular fenotipagem de células-tronco mesenquimais derivadas do líquido sinovial e Medula Óssea de miniporcos

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depleção de células do rato de xenoenxertos de tumor humano Melhora Significativamente Análise Downstream de células alvo

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Nerve Stimulator-guided Injection of Autologous Stem Cells Near the Equine Left Recurrent Laryngeal Nerve

Recurrent laryngeal neuropathy (RLN) commonly affects horses and is characterized by abnormal respiratory sounds and exercise intolerance. The recurrent laryngeal nerve shows lesions of demyelination. The benefit of applying stem cells to demyelinated nerves has been demonstrated in various animal models. The aim of the study was to test the feasibility and safety of a peri-neuronal injection of autologous muscle-derived mesenchymal stem cells to the left recurrent laryngeal nerve in healthy horses by using an electrical nerve stimulator.
Muscle-derived stems cell are obtained from five healthy Standardbred horses by sampling 20 mg of muscle tissue with a semi-automatic 14 G biopsy needle from the triceps muscle. Movements of the larynx are monitored via upper-airway video endoscopy. The left recurrent laryngeal nerve is approached with an insulated nerve block needle. Nerve stimulation is applied, starting at 2 mA, and the successful abduction of the left arytenoid is monitored. The stimulation intensity is reduced progressively. When a loss of the motor response is observed at 0.5 mA, 107 autologous muscle-derived stem cells are injected. Two examiners, who are blinded to the time point, score the laryngeal function of the horses prior to the treatment and at day 1, day 7, and day 28 after the injection of the cells. In a sixth horse, 1 mL of 2% lidocaine is injected to further confirm the correct positioning of the needle. This leads to a temporary paralysis of the left arytenoid cartilage.
This study proves that the recurrent laryngeal nerve can be approached with the help of an electrical nerve stimulator and that the electrical stimulation of the nerve is well tolerated by the horses. No modification of the laryngeal function was observed in any of the horses after the injection of the stem cells. Further studies should be conducted to describe the effects of a peri-neuronal injection of autologous muscle-derived mesenchymal stem cells to horses suffering from RLN.

Here, we present a protocol to inject autologous muscle-derived stem cells in the proximity to the recurrent laryngeal nerve with the help of an electrical nerve stimulator. This novel technique may become useful for the treatment of equine recurrent laryngeal neuropathy.

Nervo guiadas estimulador injeção de células-tronco autólogas perto do nervo laríngeo recorrente esquerdo equina

Recurrent laryngeal neuropathy (RLN) commonly affects horses and is characterized by abnormal respiratory sounds and exercise intolerance. The recurrent ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing continuous remodeling with the competing activity of osteoblasts, which produce the new bone matrix, and osteoclasts, whose function is to eliminate mineralized bone. [18F]-NaF is a positron emission tomography (PET) radiotracer that enables visualization of bone metabolism. [18F]-NaF is chemically absorbed into hydroxyapatite in the bone matrix by osteoblasts and can thus noninvasively detect osteoblastic activity, which is occult to conventional imaging techniques. Kinetic modeling of dynamic [18F]-NaF-PET data provides detailed quantitative measures of bone metabolism. Conventional semi-quantitative PET data, which utilizes standardized uptake values (SUVs) as a measure of radiotracer activity, is referred to as a static technique due to its snapshot of tracer uptake in time.&#160; Kinetic modeling, however, utilizes dynamic image data where tracer levels are continuously acquired providing tracer uptake temporal resolution. From the kinetic modeling of dynamic data, quantitative values like blood flow and metabolic rate (i.e., potentially informative metrics of tracer dynamics) can be extracted, all with respect to the measured activity in the image data. When combined with dual modality PET-MRI, region-specific kinetic data can be correlated with anatomically registered high-resolution structural and pathologic information afforded by MRI. The goal of this methodological manuscript is to outline detailed techniques for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data. The lumbar facet joint is a common site of degenerative arthritis disease and a common cause for axial low back pain.&#160; Recent studies suggest [18F]-NaF-PET may serve as a useful biomarker of painful facetogenic disease.&#160; The human lumbar facet joint will, therefore, be used as a prototypical region of interest for dynamic [18F]-NaF-PET-MRI analysis in this manuscript.

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. We present detailed methodologies for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data in a patient with facetogenic low back pain using the lumbar facet joints as a prototypical region of interest.

Análise quantitativa [18F]-NAF-PET-RM para avaliação da rotatividade óssea dinâmica em paciente com dor nas costas Facetogênica

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.