The authors would like to acknowledge funding from the Horserace Betting Levy Board U.K. (grant number 721) and VetCell BioScience Ltd, U.K. and by Consejer&#236;a de Innovaci&#242;n, Ciencia y Empresa, Junta de Andaluc&#236;a, Spain.

I casi descritti nel presente documento sono stati eseguiti seguente autorizzazione etico concessa dal Etica e il benessere Comitato degli animali del Colegio de VETERINARIOS de Malaga, in Spagna, e il Royal Veterinary College, North Mymms, Regno Unito Le procedure utilizzate sui cavalli si basano su protocolli approvati che sono usato in clinica per i cavalli che ricevono terapie basate sulle cellule staminali, che comprende la sedazione, l&#39;aspirazione del midollo osseo, iniezione intra-tendinee, perfusione regionale, iniezione endovenosa, il trattamento e la gestione del dolore post-procedurale e il monitoraggio dopo l&#39;impianto. 1. Disposizioni chiave per essere fatte in anticipo <ol><li> Cercate etica istituzionali e l&#39;approvazione del benessere degli animali e di aderire ai requisiti di legge locali prima di iniziare il lavoro. </li><li> Chiedere l&#39;approvazione istituzionale di lavorare con radiazioni ionizzanti come dettato dalle normative locali e legali, tra cui il livello di protezione del personale e dell&#39;ambiente e lo smaltimento di contamrifiuti inato. </li><li> Utilizzare i seguenti criteri di inclusione: i cavalli presenti con un infortunio strapazzo non traumatica (tendinopatia o desmopathy) al flessore superficiale tendine digitale dell&#39;arto anteriore e lesioni con conseguente difetto entro il tendine e il difetto è circondato da tendine e / o paratenonio intatto . Nota: L&#39;esame e la diagnosi di tali infortuni e la preparazione clinica dei cavalli per l&#39;impianto delle cellule è stato dettagliato altrove 6,15. Nota: L&#39;isolamento e l&#39;espansione in coltura di BMMSC derivate dal midollo osseo dei cavalli è stato dettagliato in precedenza 6,16. L&#39;attuale protocollo per l&#39;iniezione di BMMSC per lesioni SDFT nel cavallo utilizza 10 milioni di cellule per ml 4 di midollo surnatante osso autologo (BMS) 16. </li><li> Utilizzare le cellule che hanno subito non più di 4 passaggi per l&#39;impianto in vivo di evitare potenziali fenotipo cellulare o alterazioni genetiche associate con il numero elevato passaggio cells. </li><li> Fornire il numero di celle nella BMS richiesta (entro 24 ore in una scatola a freddo 4 - 8 ° C) alla clinica veterinaria dove l&#39;impianto di cellule deve essere eseguita. Nota: L&#39;uso clinico delle cellule staminali mesenchimali nel midollo osseo surnatante è una procedura brevettata di proprietà di ReCellerate Inc (USA) e il suo uso può richiedere l&#39;autorizzazione. Nota: Tc-99m è un emettitore gamma (140 keV) con un relativamente breve emivita (6,0058 ore, quindi il 94% decade alla sua forma stabile di 99 Tc in 24 ore). L&#39;energia di gamma lo rende adatto per il rilevamento da telecamere gamma (scintigrafia) ed i risultati a breve emivita nel tempo l&#39;esposizione alle radiazioni molto limitato sia per il cavallo e il personale di gestione degli animali. Questo protocollo descrive l&#39;etichettatura in loco di cellule utilizzando Tc-99m-HMPAO [HMPAO marcato con Tc-99m (come pertecnetato di sodio)]. </li><li> Ordinare il Tc-99m fresco direttamente presso tale che essa è stata utilizzata per l&#39;etichettatura e la cellule ingegnohin 2 ore di eluizione del generatore Tc-99m. Assicurarsi che il Tc-99m è fornita come 1 GBq a (tampone standard del fornitore) un 1 ml di soluzione. </li><li> Utilizzare tutti i tamponi a temperatura ambiente. Eseguire la procedura di etichettatura, l&#39;impianto delle cellule e di imaging (gamma scintigrafia) in una camera di contenimento isotopo con tutte le attrezzature puliti con alcool asciuga prima dell&#39;inizio dei lavori. </li></ol> 2. Preparazione del Cavallo e Ecografia dell&#39;arto anteriore tendine <ol><li> Registra scansioni a ultrasuoni in un primo ricovero per infortunio (quando il midollo osseo viene aspirato) e poi al punto di tempo quando le cellule vengono iniettate radioattivi. </li><li> Eseguire l&#39;ecografia e l&#39;impianto delle cellule con il cavallo che porta peso uniformemente in una stalla e sotto sedazione in piedi (piuttosto che l&#39;anestesia generale). Somministrare sedazione usando una miscela di detomidina HCl e butorfanolo tartrato, ciascuna a 0.01 al 0.02 mg / kg IV. Nota: Il recupero è rapido e post-chirurgica di trattamento non richiedeconsiderazioni particolari. </li><li> Dopo l&#39;anestesia perineurale è applicato (passo 2,6) nella dell&#39;arto interessato, tenere il cavallo alla stazione sotto sedazione per ridurre il movimento del cavallo durante il trattamento. Controllare visivamente il livello appropriato di sedazione giudicati dalla posizione di testa abbassata e il comportamento del cavallo e che il cavallo è comodo durante l&#39;iniezione di cellule e i movimenti della gamma camera durante l&#39;acquisizione delle immagini scintigrafiche. Nota: Non è necessario applicare veterinario pomata sugli occhi (per prevenire la secchezza) perché sotto sedazione lampeggiante non viene modificata e il cavallo è in grado di mantenere l&#39;idratazione degli occhi. Il monitoraggio dopo l&#39;impianto delle cellule non è invasivo (ultrasuoni e gamma scintigrafia). </li><li> Fermaglio da vicino i capelli sovrastante il tendine (con tosatrici cavallo) quindi pulire l&#39;area ritagliata utilizzando una combinazione di uno scrub chirurgico clorexidina e, infine, l&#39;alcool. </li><li> Applicare gel di accoppiamento acustico per la zona eeseguire la scansione metodicamente per registrare scansioni della regione completo palmare metacarpo, i livelli in sequenza etichettati 1 - 7 17, con un trasduttore lineare (12 MHz o simile) per ottenere seriale coincidenza trasversali e longitudinali immagini. Conservare le immagini digitalmente in modo che l&#39;area della sezione trasversale e la zona lesioni massimo 4 possono essere ottenuti con l&#39;ausilio di software di analisi di immagine. </li><li> Preparare zona sovrastante le nervi palmari immediatamente distale del carpo per iniezione asettiche di anestetico locale per garantire la completa desensibilizzazione della pelle sovrastante il tendine e il tendine flessore superficiale. Iniettare 2 ml di mepivicaine sia per via sottocutanea e adiacente ai nervi palmari (nella loro posizione sub-fasciale) tra i tendini flessori e il legamento sospensorio immediatamente distale del carpo su entrambi i lati dell&#39;arto. </li><li> Una volta che la scansione preliminare è stata eseguita la preparazione del sito di impianto lavando la zona con clorexidina s chirurgicheSoluzione crub per almeno 5 minuti e, infine, con una garza imbevuta di alcool. Eseguire tutti i passaggi successivi in ​​modo asettico. </li></ol> 3. Tc-99m-etichettatura di cellule staminali mesenchimali Equine Nota: I passaggi di etichettatura delle cellule possono essere eseguite durante l&#39;ecografia dell&#39;arto anteriore come questo decadimento isotopo minimizzerà tra l&#39;etichettatura delle cellule e l&#39;impianto di cellule marcate nel tendine. <ol><li> Rimuovere il BMS dalle cellule poiché interferisce con l&#39;assorbimento di isotopo. Per fare questo, recuperare il flaconcino di BMMSC (10 milioni di cellule in 1 ml di BMS) dalla scatola freddo e agglomerare le cellule in una microcentrifuga a 350 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con attenzione il surnatante con un 18G o 19G ago (attaccato ad una siringa da 2 ml), lasciando una piccola goccia (≤ 0,1 ml) nel tubo per aiutare la risospensione delle cellule. Salvare il surnatante (BMS) in una provetta sterile e tenere in ghiaccio per dopo il riutilizzo. </li><li> Risospendere le cellule in gocciolina residua di surnatante da flIcking il tubo delicatamente con le dita (piuttosto che vortex) e lasciare la provetta in un rack a temperatura ambiente. Assicurarsi che le cellule sono risospese completamente e che non ci siano grumi di cellule visibili. </li><li> Preparare il Tc-99m come segue. Trasferire 1 ml di tecnezio pertecnetato in una fiala di HMPAO utilizzando una siringa da 1 ml e l&#39;ago. Mescolare delicatamente ma accuratamente e lasciar riposare per 5 minuti dietro piombo schermatura. Nota: Questo passaggio può essere fatto mentre le cellule girano al punto 2.1. </li><li> Aggiungere tutta la miscela Tc-99m-HMPAO utilizzando una siringa da 1 ml e l&#39;ago per le cellule e mescolare delicatamente. Incubare per 30 minuti a RT dietro piombo schermatura. </li><li> Per i passi successivi, utilizzare una pinza (o un foglio di carta velina) per aprire il coperchio della provetta per minimizzare la contaminazione isotopo del pollice (guanto) e successivamente altre attrezzature. Usare una siringa da 2 ml e 21 ago G per aggiungere o rimuovere il tampone di lavaggio. Nota: L&#39;uso di un monitor campo isotopo viene incoraggiato a monitorare la contaminazione delle superfici e attrezzature. </li&gt; <li> Aggiungere 1 ml di PBS alla miscela Tc-99m-HMPAO-cellule, chiudere il coperchio, mescolare delicatamente e girare per far sedimentare le cellule come al punto 3.1. </li><li> Rimuovere con attenzione il PBS in una nuova provetta (salvare questo dietro il piombo schermatura ed etichetta come W1). Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di PBS fresco. Centrifugare il tubo e rimuovere il surnatante come sopra (salvare questo ed etichetta come W2). </li><li> Calcolare l&#39;efficienza di etichettatura misurando i conteggi in tubi W1 e W2 e il pellet di cellule. A tale scopo, mettendo ciascuno tubi in uno strumento calibratore di dose isotopo Bene e registrare la radioattività come colpi per minuto (CPM). Calcolare l&#39;efficienza etichettatura (Radioattività come CPM di celle) / (Radioattività delle cellule + surnatante) x 100. </li><li> Risospendere le cellule a fondo nel residuo PBS e quindi aggiungere il BMS salvato dal punto 3.1. Le cellule sono pronte per l&#39;impianto intralesionale. </li></ol> 4. L&#39;impianto di celle Tc-99m-HMPAO marcati <ol><li> L&#39;impianto intralesionalenel tendine sotto guida ecografica <ol><li> Lentamente introdurre un pollice 1.5 o 2 (50 mm) 20 ago G nella zona massima pregiudizio della lesione in un orientamento longitudinale con il trasduttore ad ultrasuoni, coperto da un telo sterile, in linea con l&#39;ago in modo che la lunghezza dell&#39;ago può essere identificati ecograficamente e la punta se l&#39;ago si trova esattamente al centro della lesione. </li><li> Utilizzando appropriata schermatura, raccogliere le cellule in una siringa da 2 ml (Luer-lock, per ridurre al minimo il rischio di contaminazione esterna e in un coprisiringa piombo schermatura) utilizzando un ago G 20. Gettare l&#39;ago facendo attenzione a non perdere alcun fluido. Ora collegare la siringa con le cellule marcate l&#39;ago pre-situato nel tendine. </li><li> Posizionare la sonda ecografica sotto l&#39;ago in modo che il tratto dell&#39;ago nel tessuto è chiaramente visibile. Iniettare le cellule ad un ritmo lento ma costante nella lesione. Assicurarsi che non c&#39;è resistenza a iniezione. Se questo si verificariposizionare accuratamente l&#39;ago sotto guida ecografica. Controllare che l&#39;espulsione del fluido nella lesione è visibile l&#39;immagine ecografica come fluido contenente bolle d&#39;aria anecoica iperecogeni on. </li><li> Togliere l&#39;ago e collocare immediatamente la pressione sul foro dell&#39;ago per evitare la perdita di cellule iniettate e minimizzare la diffusione isotopo sulla superficie esterna del lembo. Vestire Immediatamente l&#39;arto con uno strato di fasciatura autoadesivo. Il cavallo è pronto per la scintigrafia gamma. Eseguire questo immediatamente. Nota: Dopo aver iniettato le cellule nel tendine, acquisire un conteggio del siringa vuota e l&#39;ago per valutare la possibile perdita diretta di cellule che possono rimanere nella siringa. </li></ol></li><li> Perfusione regionale di cellule Tc-99m-HMPAO marcati <ol><li> Seguire passo 2.4. </li><li> Applicare un 100 millimetri laccio emostatico di gomma benda sul metacarpo prossimale con due 100 millimetri rotolo di garza di cotone fasciatura posizionato mediale e laterale. </li><li> Asetticamente preparare °e pelle sopra la vena digitale palmare laterale a livello della laterale prossimale osso sesamoide lavando la zona con una soluzione di clorexidina scrub chirurgico per almeno 5 minuti e infine con garza imbevuta di alcool. Eseguire tutti i passaggi successivi in ​​modo asettico. </li><li> Preparare una estensione 100 millimetri set con un 21 G x ¾ &quot;(0,8 x 19 mm) ago a farfalla per venipuntura riempiendo con soluzione salina sterile eparinizzata e quindi introdurre l&#39;ago nella vena laterale digitale palmare. Sangue Una volta inserita la vena sarà parzialmente riempire il set di estensione. Al connettore a bloccaggio Luer allegare un tappo di gomma blocco Luer per facilitare la successiva iniezione di cellule marcate. </li><li> Diluire le cellule staminali mesenchimali in 19 ml di PBS raccogliendo le cellule in una siringa da 20 ml precaricato con il PBS. Applicare le cellule attraverso la coppa di gomma con un 18 G (1,2 x 40 mm) ago ipodermico ad un tasso lento ma costante (30 - 40 sec). Lavare il catetere con 1 ml di PBS precaricati in una Syringe. </li><li> Rimuovere l&#39;ago e immediatamente applicare pressione alla pelle sopra il foro dell&#39;ago con uno strato di cinque 4 x 4 garze di cotone. Poi posto un bendaggio adesivo elastico leggero con sopra la zona sesamoide prossimale e lasciare il laccio emostatico in posizione per 30 minuti dopo l&#39;iniezione. </li><li> Rilasciare il laccio emostatico dopo 30 min. Il cavallo è pronto per la scintigrafia gamma. Nota: Dopo aver iniettato le cellule, acquisire un conteggio del siringa vuota e l&#39;ago per valutare la possibile perdita diretta di cellule che possono rimanere nella siringa. </li></ol></li></ol> 5. Gamma Scintigrafia <ol><li> Immagini scintigrafia <ol><li> Acquisire immagini planare scintigrafia con gamma camera (fissato a 140 KeV picco fotoelettrico utilizzando una finestra simmetrica 20%) dotato di una bassa energia, foro collimatore parallelo. <ol><li> Ottenere tutte le immagini dopo tempo 0 su cavalli sedati come al punto 2.2 in piedi. Dopo il tempo 0 scintigrafia, sostituire la benda luce sopra la si dell&#39;impiantoTé con una benda imbottita. Rimuovi questa benda prima di ogni esame la scintigrafia. </li><li> Acquisire immagini statiche per 60 secondi ciascuno (256 da 256 matrice) utilizzando il software di elaborazione con la &quot;acquisizione&quot; - &quot;Selezione di studio&quot; - opzioni &quot;osso statiche&quot;. È essenziale che il cavallo non si muove durante il periodo di acquisizione dell&#39;immagine perché l&#39;opzione modalità statica non ha un modulo per la correzione di movimento. </li><li> Per l&#39;iniezione intralesionale, ottenere immagini laterali dalla zona della lesione da carpo all&#39;estremità distale, l&#39;area equivalente dell&#39;arto controlaterale, il campo polmone sinistro e la tiroide sinistra. Durante l&#39;acquisizione di immagini arti anteriori, posizionare uno schermo di piombo tra le gambe per evitare l&#39;imaging del controlaterale dell&#39;arto. Acquisire le immagini a 5 min dopo l&#39;iniezione (tempo 0), e poi a 1, 3, 6, 12, 24, 36 e 48 ore. </li><li> Per perfusione regionale, ottenere immagini laterali e dorsale gamma come ad 5.1.1.3. Ottenere immagini 5 min after rilascio laccio emostatico. Questo sarà tempo 0. Può essere utile l&#39;arto immagine immediatamente dopo l&#39;iniezione delle cellule di valutare conteggi precedenti del laccio rilascio. Ottenere immagini gamma a 1, 3, 6, 12, 24, 36 e 48 ore dopo la somministrazione delle cellule. </li></ol></li><li> Dopo che le immagini sono state acquisite, processo le immagini utilizzando manualmente l&#39;opzione &quot;trasformazione&quot; del software con le opzioni selezionate per il colore &quot;Sokoloff&quot; e colore &quot;Inverti&quot;. Quindi seleziona la &quot;regione di interesse&quot; (ROI) e &quot;ellisse&quot; come questo permette rimodellamento della maschera di selezione e circolazione sull&#39;area lesione. Ottenere i conteggi sul ROI scegliendo l&#39;opzione &quot;aggiungi le statistiche&quot;. Garantire che le regioni in modo identico di dimensioni di interesse (ROI) sono registrate per ogni animale ai diversi punti temporali. </li><li> Successivamente, correggere i conteggi per il decadimento prevista del tecnezio in ogni punto. Utilizzare la seguente equazione per correggere decadimento:A = A o e - (0.693t / T 1/2), dove A o l&#39;attività iniziale dell&#39;isotopo, A è il decadimento corretto radioattività al tempo zero, t è il tempo trascorso e T 1/2 è la metà -life dell&#39;isotopo. Poi esprimere i conteggi corretti in ogni punto temporale come percentuale della ROI al tempo 0 per elaborare la percentuale di cellule rimanenti, utilizzando la seguente formula: </li></ol></li></ol> % di cellule rimanenti (t) = 100 - {[(decadimento predetto (t) - decadimento (t)) / decadimento predetto (t)]} x 100 decadimento (t) = ROI (t) / ROI (0) x 100.

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+to+the+infarcted+myocardium:+feasibility,+cell+migration,+and+body+distribution.">Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium: feasibility, cell migration, and body distribution.</a> Circulation. 108, 863-868 (2003).</li><li>Heckl, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+contrast+agents+for+molecular+imaging+in+stroke.">Future contrast agents for molecular imaging in stroke.</a> Current Medicinal Chemistry. 14, 1713-1728 (2007).</li></ol>

JD and RKS are Scientific Advisory Board members to ReCellerate Inc.

Oltre al midollo osseo, cellule staminali isolate da fonti come il tessuto adiposo sono adatti per l&#39;etichettatura con questo protocollo. Inoltre, le cellule da uno stato congelato può essere ripreso e ampliato in coltura per i numeri desiderati per gli studi di etichettatura 12. Un fattore critico che determina l&#39;efficienza di etichettatura del BMMSC è il tempo tra eluizione del Tc-99m dal generatore di molibdeno al radiofarmacia, preparazione di Tc-99m-HMPAO e l&#39;us...

Strategie rigenerativa per la riparazione di tessuti malati o danneggiati sono basate su cellule staminali multipotenti derivate da una varietà di tessuti e impiantati nella zona colpita. I recenti progressi nell&#39;applicazione delle autologo BMMSC per il trattamento di tendini e lesioni legamentose nel cavallo hanno dimostrato di migliorare le misure di outcome sia sperimentale 1-5 e studi clinici 6. Il cavallo è un modello particolarmente interessante per valutare l&#39;efficacia delle cellule staminali trattamenti correlati perché soffre di età e affaticare le lesioni riportate ai tendini dell&#39;arto anteriore distale, è un animale atletico, ed è un grande, facilitare il recupero del midollo osseo e dell&#39;impianto corretto. Lesioni tendinee guarire naturalmente con fibrosi ma il tendine è guarito funzionalmente inferiore 7 e ha un elevato rischio di re-infortunio 8. Il superficiale tendine flessore (SDFT) è più comunemente influenzato come si è evoluto per agire come una energia elasticanegozio ed esperienze ad alto carico insiste per ottenere efficienza energetica e locomozione ad alta velocità. Ripristinare la funzione dopo la lesione è quindi fondamentale. Queste lesioni sono simili a quelle che interessano il tendine di Achille nell&#39;uomo che svolge una funzione simile 9. Non ci sono buone opzioni di trattamento per curare o raggiungere un buono di riparazione per tali lesioni, strategie rigenerative quindi basati su cellulari offrono un&#39;opportunità interessante per migliorare i risultati e ridurre re-infortunio. Nella maggior parte degli studi 5 - 20 milioni BMMSC autologhe vengono iniettati direttamente nella lesione che solitamente si verificano nel nucleo del corpo tendine che agisce quindi come un ricettacolo per le cellule. Il destino delle cellule, una volta iniettate non è chiaro e metodi diversi di etichettatura delle cellule per monitorare le cellule sono state descritte recentemente. Cellule marcate con un cartellino di fluorescenza hanno dimostrato di sopravvivere solo in un numero relativamente piccolo (&lt;10%) 10,11. Etichette fluorescenza richiedonotessuto extraction e sezionamento per l&#39;analisi istologica, che richiede molto tempo e non facilmente facilitare l&#39;analisi temporale in un grande modello animale o in casi clinici. Nel più recente lavoro abbiamo usato il 99m Tc radioisotopi per etichettare le cellule e seguire il loro destino da Gamma scintigrafia 1. Questo metodo consente raffronti rapidi da effettuare tra le diverse vie di consegna delle cellule, tra cui intralesionale, per via endovenosa attraverso la vena giugulare 1 o perfusione regionale via intra-arteriosa di 12 o per via endovenosa 1,12 iniezioni. La persistenza e la distribuzione di cellule possono poi essere ripreso dalla gamma scintigrafia dei vari organi. Questo ha dimostrato che solo il 24% delle cellule iniettate intralesionally rimasto nella lesione da 24 ore 1 e questo è supportato da un altro studio utilizzando lesioni sperimentalmente creati e utilizzando lo stesso radiomarcato 5. Inoltre, le cellule mostrano una limitata capacità di casa in lesioni tendinee quando consegnato neld per perfusione regionale o per via endovenosa, ma sono dispersi nei polmoni di questi ultimi percorsi 4. BMMSC etichettato con nanoparticelle di ferro è un metodo alternativo per monitorare le cellule impiantate in tendini delle zampe anteriori 13. Sebbene cellule marcate nanoparticelle ferro consentono inseguimento cellule in vivo tramite MRI, studi temporali in un grande animale sono limitati dal numero di volte in anestesia possono essere somministrati ad ogni tempo per effettuare le scansioni MRI. Inoltre, le nanoparticelle di ferro sono ipointensa in MRI che limita le informazioni sulla migrazione di cellule marcate nel corpo tendine. Altri radioisotopi che possono essere utilizzati comprendono indio-111 ma soffre lo svantaggio di un tempo di dimezzamento più lungo di Tc-99m (2,8 giorni vs 6,0 ore) e più alta energia di emissione di raggi gamma. Inoltre, la vitalità cellulare è stata riportata una riduzione quando marcato con Indio-111 14. Tc-99m, d&#39;altra parte, viene normalmente utilizzato sia nucleare equina e umanamedicina di etichettare cellule mononucleate del sangue periferico e seguire la loro distribuzione in vivo mediante scintigrafia. Esso può essere relativamente facilmente assimilato dalle cellule utilizzando HMPAO come una molecola linker di impegnare la tecnezio, come Tc-99m-HMPAO, alle cellule. Tc-99m-HMPAO etichettato BMMSC mostrano buona vitalità e può proliferare in vitro 4. Dettagli Questo protocollo l&#39;etichettatura e la tracciabilità dei equino BMMSC autologo impiantato in lesioni viventi naturalmente allo SDFT zampa anteriore. È importante notare che il protocollo è destinato esclusivamente per essere utilizzato come strumento di ricerca. Il suo uso come modalità terapeutica clinica non è raccomandata come l&#39;effetto del radiomarcato sul fenotipo cellulare non è stato completamente chiarito.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Technetium99m&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements.&#160; The isotope must be used within 2 h of elution from the molybdenum-99 generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceretec - Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO)&#160;</td>
			<td>GE HealthCare</td>
			<td></td>
			<td>Please enquire directly with GE HealthCare</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge, Minispin/Minispin Plus</td>
			<td>Ependorf</td>
			<td>22620100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G and 19G Needles</td>
			<td>Terumo Medical</td>
			<td>NN-1838R (18G);&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; NN1938R (19G)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 mL and 2 mL</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd</td>
			<td>SYR6200 (1 mL); SYR6003 (2 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One Ltd</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS - Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Swabs</td>
			<td>Shermond Ltd</td>
			<td>UNG602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoflexVet self adhering bandage</td>
			<td>Andover Healthcare, Inc.</td>
			<td>3540RB-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound imaging software</td>
			<td>Scion Image, Scion Corporation, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicasXplus Scintigram processing software</td>
			<td>Bartec Technologies Ltd</td>
			<td></td>
			<td>http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Field isotope counter for monitoring isotope</td>
			<td>John Caunt U.K.</td>
			<td>GMS1800a</td>
			<td>http://www.johncaunt.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well counter for isotope measurements, dose calibrator</td>
			<td>Capintec Southern Scientific</td>
			<td>CRC-25R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging and tracking of technetium-99m labeled bone marrow mesenchymal stem cells in equine tendinopathy

I recenti progressi nell&#39;applicazione delle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMMSC) per il trattamento di lesioni legamentose e tendinee nel cavallo suggeriscono una migliore misure di esito in entrambi gli studi sperimentali e clinici. Sebbene la BMMSC vengono impiantati nella lesione tendinea in gran numero (di solito 10 - 20 milioni cellule), solo un numero relativamente piccolo sopravvivere (&lt;10%) anche se questi possono persistere per 5 mesi dopo l&#39;impianto. Questo sembra essere un comune osservazione in altre specie dove BMMSC sono stati impiantati in altri tessuti ed è importante capire quando si verifica questa perdita, quanti sopravvivono il processo di impianto iniziale e se le cellule vengono cancellati in altri organi. Il monitoraggio del destino delle cellule può essere ottenuto mediante radiomarcatura il BMMSC prima dell&#39;impianto che permette non invasivo imaging in vivo di posizione di cella e la quantificazione dei numeri di cellulare. Questo protocollo descrive un labeli cellulareProcedura ng che usa tecnezio-99m (Tc-99m), e il monitoraggio di queste cellule dopo l&#39;impianto in tendini flessori feriti nei cavalli. Tc-99m è un (t 1/2 del 6,01 hr) isotopo breve durata che emette raggi gamma e può essere internalizzati dalle cellule in presenza del hexamethylpropyleneamine ossima composto lipofilo (HMPAO). Queste proprietà lo rendono ideale per l&#39;uso in cliniche di medicina nucleare per la diagnosi di molte malattie differenti. Il destino delle cellule marcate può essere seguita a breve termine (fino a 36 ore) per la scintigrafia gamma di quantificare sia il numero di cellule conservate nella lesione e distribuzione delle cellule nei polmoni, tiroide e altri organi. Questa tecnica è adattato dall&#39;etichettatura di leucociti del sangue e può essere utilizzato per l&#39;immagine impiantato BMMSC in altri organi.

Tc-99m-HMPAO incorporazione in BMMSs non compromettere la loro capacità di aderire alla cultura del tessuto plastico e mentre mostrano capacità proliferazione di formare monostrati (figura 1), non abbiamo pienamente determinato se i tassi di proliferazione o altri fenotipi cellulari sono interessati. La loro morfologia è simile alle cellule non marcate con una tipica forma a fuso. L&#39;efficienza etichettatura cellulare (es., L&#39;assorbimento di etichetta) varia tipicamente da circa 1,5% ...

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In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

In Vivo Imaging e tracciamento di tecnezio-99m etichetta cellule staminali mesenchimali del midollo osseo in Equine Tendinopatia

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

9.7K Views.  The Royal Veterinary College. This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

Video: In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

Valutazione pre-clinica della tirosina chinasi inibitori per il trattamento di leucemia acuta

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

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Medicina

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F MRI per il tracciamento cellulare

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Sequenziale<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di osteogeniche cellule staminali / progenitrici durante la frattura di riparazione

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Femorale aspirazione del midollo osseo in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studiare cancro del pancreas staminali caratteristiche cellulari per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Isolamento e Cellular Fenotipizzazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal liquido sinoviale e del midollo osseo di mini-pig

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

L&#39;esaurimento delle cellule di topo da xenotrapianti tumorali umani migliora in modo significativo Analisi A valle delle cellule bersaglio

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Nerve Stimulator-guided Injection of Autologous Stem Cells Near the Equine Left Recurrent Laryngeal Nerve

Recurrent laryngeal neuropathy (RLN) commonly affects horses and is characterized by abnormal respiratory sounds and exercise intolerance. The recurrent laryngeal nerve shows lesions of demyelination. The benefit of applying stem cells to demyelinated nerves has been demonstrated in various animal models. The aim of the study was to test the feasibility and safety of a peri-neuronal injection of autologous muscle-derived mesenchymal stem cells to the left recurrent laryngeal nerve in healthy horses by using an electrical nerve stimulator.
Muscle-derived stems cell are obtained from five healthy Standardbred horses by sampling 20 mg of muscle tissue with a semi-automatic 14 G biopsy needle from the triceps muscle. Movements of the larynx are monitored via upper-airway video endoscopy. The left recurrent laryngeal nerve is approached with an insulated nerve block needle. Nerve stimulation is applied, starting at 2 mA, and the successful abduction of the left arytenoid is monitored. The stimulation intensity is reduced progressively. When a loss of the motor response is observed at 0.5 mA, 107 autologous muscle-derived stem cells are injected. Two examiners, who are blinded to the time point, score the laryngeal function of the horses prior to the treatment and at day 1, day 7, and day 28 after the injection of the cells. In a sixth horse, 1 mL of 2% lidocaine is injected to further confirm the correct positioning of the needle. This leads to a temporary paralysis of the left arytenoid cartilage.
This study proves that the recurrent laryngeal nerve can be approached with the help of an electrical nerve stimulator and that the electrical stimulation of the nerve is well tolerated by the horses. No modification of the laryngeal function was observed in any of the horses after the injection of the stem cells. Further studies should be conducted to describe the effects of a peri-neuronal injection of autologous muscle-derived mesenchymal stem cells to horses suffering from RLN.

Here, we present a protocol to inject autologous muscle-derived stem cells in the proximity to the recurrent laryngeal nerve with the help of an electrical nerve stimulator. This novel technique may become useful for the treatment of equine recurrent laryngeal neuropathy.

Nervo stimolatore-guida iniezione di cellule staminali autologhe vicino il nervo laringeo ricorrente di sinistra equina

Recurrent laryngeal neuropathy (RLN) commonly affects horses and is characterized by abnormal respiratory sounds and exercise intolerance. The recurrent ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing continuous remodeling with the competing activity of osteoblasts, which produce the new bone matrix, and osteoclasts, whose function is to eliminate mineralized bone. [18F]-NaF is a positron emission tomography (PET) radiotracer that enables visualization of bone metabolism. [18F]-NaF is chemically absorbed into hydroxyapatite in the bone matrix by osteoblasts and can thus noninvasively detect osteoblastic activity, which is occult to conventional imaging techniques. Kinetic modeling of dynamic [18F]-NaF-PET data provides detailed quantitative measures of bone metabolism. Conventional semi-quantitative PET data, which utilizes standardized uptake values (SUVs) as a measure of radiotracer activity, is referred to as a static technique due to its snapshot of tracer uptake in time.&#160; Kinetic modeling, however, utilizes dynamic image data where tracer levels are continuously acquired providing tracer uptake temporal resolution. From the kinetic modeling of dynamic data, quantitative values like blood flow and metabolic rate (i.e., potentially informative metrics of tracer dynamics) can be extracted, all with respect to the measured activity in the image data. When combined with dual modality PET-MRI, region-specific kinetic data can be correlated with anatomically registered high-resolution structural and pathologic information afforded by MRI. The goal of this methodological manuscript is to outline detailed techniques for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data. The lumbar facet joint is a common site of degenerative arthritis disease and a common cause for axial low back pain.&#160; Recent studies suggest [18F]-NaF-PET may serve as a useful biomarker of painful facetogenic disease.&#160; The human lumbar facet joint will, therefore, be used as a prototypical region of interest for dynamic [18F]-NaF-PET-MRI analysis in this manuscript.

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. We present detailed methodologies for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data in a patient with facetogenic low back pain using the lumbar facet joints as a prototypical region of interest.

Quantitativo [18F]-Naf-PET-MRI Analisi per la valutazione del fatturato osseo dinamico in un paziente con mal di schiena facetogenico

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.