This work is supported by a grant awarded to MNH by Children's Healthcare of Atlanta, the APS 2014 Short-Term Research Education Program to Increase Diversity in Health-Related Research (STRIDE) fellowship awarded to PT, and the University of Notre Dame Integrated Imaging Facility.

Todas las técnicas experimentales deben llevarse a cabo de conformidad con las directrices de Cuidado institucional y el empleo. 1. X-ray Imaging Acquisition <ol><li> Descripción general del software (Ver Figura 1 para una descripción de Configuración de software). <ol><li> Seleccione el botón de captura directamente debajo de la pestaña Archivo. </li><li> En el menú desplegable Configuración, seleccione la sesión actual. </li><li> Seleccione Estándar de exposición en el cuadro desplegable situado bajo tiempo de exposición. </li><li> Ajuste el tiempo de exposición a 2,00 min, y No. Las exposiciones a 1. Establecer la Agrupación X e Y Intervalos de 2 píxeles. Ver Figura 1. </li><li> Seleccionar Acumulación final en el menú desplegable Opciones de exportación. </li><li> En los ajustes de iluminación, seleCT de rayos X en el menú desplegable Fuente de iluminación. El valor por defecto KVP se ha fijado en 35. </li><li> Seleccione Selección automática en el menú Aplicar archivo de referencia desplegable para aplicar el archivo de referencia de rayos X correspondiente. (Consulte la sección 2). </li><li> En la cámara en su configuración, configurar el f-stop a 2,51. </li><li> Ajuste el FOV (campo de visión) a 125.64 para los ratones PN10. </li><li> Establecer el plano focal a 13, y en el menú desplegable junto al control deslizante de plano focal, seleccione X-Ray. </li><li> Para los rayos X, establezca el filtro de excitación y el filtro de emisión a 0 en el menú desplegable. </li><li> Almacenar la sesión actual haciendo clic en Nuevo en la parte superior junto a Configuración. Introduce el nombre de Nueva Adquirir Archivo de ajustes, por ejemplo, &quot;Jove único evento de exposición para la fabricación de un protocolo.&quot; Vea la Figura 2. </li></ol&gt; </li><li> La creación de un protocolo de imágenes de rayos X <ol><li> Haga clic en el botón Crear / Modificar protocolos en el lado derecho de la ventana abierta. </li><li> A medida que aparece la ventana emergente nuevo Protocolo, haga clic en el botón Nuevo en la esquina superior derecha </li><li> Introduzca el nombre que el protocolo guardará bajo, por ejemplo, &quot;Protocolo de demostración Jove&quot;, y haga clic en OK. (Ver Figura 3). </li><li> En la parte inferior de la ventana emergente Protocolo de Protocolo de pasos, asegúrese de que el paso 1 se pone de relieve en el texto de color rojo, la captura de imágenes nuevas se selecciona, y no hacer nada se selecciona en el menú desplegable de captura de imagen Antes. </li><li> En Capture Setting, seleccione el evento exposición única recientemente generada desde el paso 1.1.12. </li><li> Seleccione de espera (seg) en el menú desplegable Después de Captura de Imagen. </li><li> Haga clic en el botón Editar, típe 180 en el cuadro desplegable, y haga clic en Aceptar para agregar un tiempo de espera de 3 minutos después de cada adquisición de 2 min. </li><li> Duplicar Paso 1 haciendo clic derecho en la pestaña Paso 1 Paso y seleccionando Duplicar. Crear 23 duplicados para un periodo de observación de 2 horas. (Ver Figura 4). </li><li> En el último paso (paso 24), cambiar la Después del ajuste a No hacer nada en espera (seg) Captura de Imagen. </li><li> Haga clic en el botón Guardar y salir del Editor Protocolo. </li></ol></li></ol> 2. Archivos de referencia de iluminación Nota: Aplicar archivos de referencia de la iluminación de rayos X para una imagen de rayos X con el fin de corregir automáticamente las variaciones en la uniformidad del detector de las imágenes de rayos X obtenidos a lo largo experimento. Los procedimientos descritos a continuación son específicas del Bruker animales in vivo Imaging Systems; otros sistemas de formación de imágenes in vivo puedeser usado. <ol><li> Generar un archivo de referencia de la iluminación abriendo el software de imagen molecular y hacer clic en el botón de captura. </li><li> Mediante el menú emergente, establecer los ajustes de captura de rayos X en Fuente de iluminación (ver ajustes sugeridos en el apartado 1 anterior) y luego seleccione Referencia de iluminación en el tipo de exposición. Esto se puede encontrar en las exposiciones estándar cuadro desplegable. (Ver Figura 5). </li><li> Retire todas las muestras de la estación de imagen. Ajuste el binning X e Y de 4 x 4 hurgar en la basura. Consulte la Tabla 1: tiempos de exposición archivo de referencia de iluminación para determinar el momento exacto de la exposición. </li><li> La exposicion de prensa. </li><li> Aplicar el archivo de referencia mediante la selección de la selección automática desde el menú desplegable bajo Aplicar archivo de referencia. (Ver Figura 6). El archivo de referencia de la iluminación ahora se aplicará automáticamente a todos los im-rayos Xedades capturados con los mismos ajustes de la cámara. Los pasos 2.1 a 2.4 no tendrá que repetirse si los ajustes de la cámara mismos son utilizados en experimentos posteriores. Nota: Un archivo de referencia de la iluminación se puede aplicar después de la adquisición de imágenes, o si se produce un mensaje de error después de auto-selección de los archivos de referencia. Aplicar la iluminación archivos de referencia de la captura de la imagen utilizando la siguiente serie de comandos en el panel de navegación del software de imagen molecular: Imagen&gt; Matemáticas&gt; Imagen Tipo: Tarea&gt; Calcular: Corrección de la iluminación. Seleccione la imagen de entrada (X) que desea aplicar el archivo de referencia de iluminación (Y) para. Cambie el nombre del archivo corregido (Z). (Ver Figura 7). </li></ol> 3. Manejo de Animales <ol><li> La adquisición de Animales <ol><li> Compra presas embarazadas de los criadores comerciales o criar ratones hembra en casa a las 12 semanas de edad (o más) de conformidad con la directriz institucionals. </li><li> ratones recién nacidos casa con las madres lactantes hasta el día postnatal (PN) 10. </li></ol></li><li> Anestesia Animal (PN 10) <ol><li> Preparar un cóctel de ketamina / xilazina para anestesiar PN 10 ratones para efectos anestésicos prolongados que duran hasta 40 minutos. Añadir 500 l de ketamina (100 mg / ml) a 75 l de xilazina (100 mg / ml). Diluir 1:10 en una solución salina al 0,9% para hacer una mezcla de ketamina (100 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg) cóctel anestésico. </li><li> Pesar los ratones recién nacidos. </li><li> Usando una jeringa de 3/10 con una aguja 31 G 5/16 pulgadas (8 mm), administrar 10 l / g de peso corporal de la anestesia con una inyección intraperitoneal. </li><li> Mantener a los animales en seco y aislados para evitar la pérdida excesiva de calor corporal. </li></ol></li></ol> 4. traqueal instilaciones <ol><li> Preparar una solución salina intratraqueal compuesto por NaCl 140 mM, KCl 5 mM, 1 mM CaCl 2, y HEPES 10 mM; pH = 7,4. La osmolalidad de esta solución debe ser319 mosm / kg de H2O </li><li> Monte anestesiaron los animales lado ventral hacia arriba sobre una tabla inclinada quirúrgica utilizando cinta quirúrgica. Ensurethat cabezas de los animales se encuentran en la parte superior de la pendiente. </li><li> Realizar una pizca dedo del pie para asegurarse de que los animales son anestesiados y listo para la cirugía. Desinfectar todas las áreas quirúrgica, instrumentos, y la región torácica del animal. </li><li> Hacer una pequeña incisión (3 mm) en la cara ventral anterior medial del cuello (región de la garganta), utilizando un bisturí quirúrgico, tamaño 11. Hacer a un lado el platisma y anterior músculos traqueales utilizando unas pinzas de punta roma con el fin de visualizar y acceder a la tráquea. </li><li> Inculcar 3 l / g de peso (aproximadamente 10 - 30 l de volumen final) de solución salina a través de la tráquea expuesta utilizando una aguja de 31 G 5/16 pulgadas (8 mm). La pequeña incisión se deja abierta durante el diagnóstico por animal y por lo general se cura bien. Consulte con local de la División de Recursos Animales para determinar si la incisión del mismo modo puede dejarse abierta. De lo contrario, suturas puedenser requerido. </li></ol> 5. Animal Imaging <ol><li> Coloque los cachorros ventral en un fondo claro,, bandeja extraíble de imágenes de animales. Centre los animales de modo que el haz de rayos X será directamente sobre la zona torácica. </li><li> Para cohortes de animales numerados impares, colocar la primera pup directamente en el medio de la bandeja, y por cohortes pares colocan la primera pup justo a la izquierda del centro de modo que cuando los otros animales se colocan en la bandeja de todos los animales se centran. </li><li> Devolver la bandeja de imágenes para el gabinete de imágenes de rayos X y cierre la puerta del armario. </li><li> Encienda la unidad de control térmico de los animales para mantener la temperatura corporal de los animales anestesiados. Utilice el ajuste alto para alcanzar una temperatura de la cámara de aproximadamente 35 - 37 ° C. Encendido de la unidad de anestesia para animales (isoflurano vaporizado entregado a través de oxígeno) para asegurar que los animales son anestesiados y se inmovilizan en toda la duración del procedimiento de imagen de 2 horas. </li><li> La ejecución de protocolo de formación de imágenes de rayos X<ol><li> Haga clic en Capturar y seleccione el protocolo apropiado, por ejemplo, &quot;Protocolo de demostración Jove,&quot; desde el menú desplegable Protocolo. (Ver Figura 8). </li><li> Haga clic en el botón Ejecutar Protocolo seleccionado en el software de imagen molecular. Nota: Aparecerá una ventana emergente para realizar el seguimiento del estado de la adquisición de la imagen, cuando el protocolo se ha completado la ventana desaparecerá. La dosis de rayos X es bajo, &lt;a 0,3 mRem o alrededor de 10 veces menos que una radiografía dental. Al igual que con otros procedimientos de rayos X, no hay radiación residual. </li><li> Cuando la sesión de adquisición de 2 horas, retire los animales de la bandeja de imágenes y devolverlos a sus jaulas. Observar a los animales para la recuperación completa antes de volver a bastidores. </li></ol></li></ol> Análisis 6. Datos Nota: El software de imagen molecular permite la cuantificación y la traducción de Xray intensidad de los píxeles en la velocidad de eliminación de líquido pulmonar. Los pasos siguientes describen los procedimientos necesarios para normalizar las imágenes de rayos X y cuantificar las intensidades en las regiones definidas de interés (ROI). <ol><li> Diseñar una plantilla de retorno de la inversión Nota: Una región de la plantilla de interés debe ser creado específica a las imágenes de rayos X capturados durante el estudio 2 hr, y se debe utilizar con el fin de comparar las intensidades de rayos X entre los grupos experimentales. Desde pequeños volúmenes de desafíos de solución salina normalmente se acumulan en el lóbulo superior izquierdo del pulmón 4-6, la ROI (s) debe centrarse en esta porción del pulmón. <ol><li> Abrir la primera y la última imagen de rayos x en el conjunto de 2 horas. Seleccione la ventana de la imagen de la primera radiografía. </li><li> En la barra de herramientas de navegación, seleccione Manual-ROI&gt; Nueva ROI Set. </li><li> Haga clic ROI Elipse y crear un retorno de la inversión que cubra adecuadamente la izquierda lung.An ROI del ratón no se define hasta que el rojo, esbozó ROI es dragged a una posición diferente. Un ROI definido se resume en azul con un número. </li><li> Si se crean imágenes de varios cachorros, haga clic en el rojo, el ROI se indica y arrastrar a los pulmones izquierdos de los otros ratones para crear más regiones de interés individual en el mismo conjunto. Arrastre el rojo, el ROI se indica a una zona con un fondo claro para crear un retorno de la inversión del fondo. <ol><li> Seleccionar puntero de selección para posicionar las regiones de interés para mentir sobre el pulmón izquierdo de cada ratón, directamente debajo de la segunda costilla. </li></ol></li><li> En la barra de herramientas superior, haga clic en la pantalla de imagen. </li><li> Compruebe superposición en el diálogo de la pantalla de imagen para superponer la imagen de rayos X última vez que mantiene las ubicaciones conjunto de ROI. Si es necesario, seleccione puntero de selección en la barra de herramientas de navegación para ajustar las posiciones de las ROI y asegurar una cobertura adecuada de pulmón en ambas imágenes. </li><li> En el diálogo ROI Manual, seleccione Plantilla&gt; Guardar modelo. nombre tque plantilla y haga clic en OK. </li><li> Cierre las dos imágenes. Seleccione No cuando se le pida para guardar los cambios. </li><li> Aplicar la plantilla de retorno de la inversión de cada imagen de rayos X capturado para analizar el líquido de limpieza al abrir todas las imágenes tomadas durante el estudio para. Para empezar, seleccione un archivo abierto y haga clic en regiones de interés Manual&gt; Plantilla. </li><li> Seleccione la plantilla de ROI previamente creado en el menú desplegable y haga clic en Aplicar a todos los documentos abiertos. </li></ol></li><li> Exportación numérica ROI Los datos de las imágenes a una hoja de cálculo <ol><li> En la esquina superior izquierda, haga clic en Archivo&gt; Exportar datos&gt; ROI. </li><li> Compruebe como se muestra y apertura automática en Excel en el cuadro de diálogo emergente. </li><li> Seleccionar documentos de exportación todas abiertas. </li><li> Nombre del archivo y haga clic en Guardar. </li><li> software de imágenes moleculares estrecha. </li></ol></li></ol&gt;

<ol>
	<li>Institute of Laboratory Animal Resources. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2011).</li><li>Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+tracheal+instillation+of+solutes+into+mouse+lung.">Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Hilgendorff, A., Reiss, I., Ehrhardt, H., Eickelberg, O., Alvira, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+lung+disease+in+the+preterm+infant.+Lessons+learned+from+animal+models.">Chronic lung disease in the preterm infant. Lessons learned from animal models.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 50, 233-245 (2014).</li><li>Goodson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nadph+oxidase+regulates+alveolar+epithelial+sodium+channel+activity+and+lung+fluid+balance+in+vivo+via+O2-+signaling.">Nadph oxidase regulates alveolar epithelial sodium channel activity and lung fluid balance in vivo via O2- signaling.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L410-L419 (2012).</li><li>McNeilly, T. N., Tennant, P., Lujan, L., Perez, M., Harkiss, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+infection+efficiencies+of+peripheral+lung+and+tracheal+tissues+in+sheep+infected+with+Visna/maedi+virus+via+the+respiratory+tract.">Differential infection efficiencies of peripheral lung and tracheal tissues in sheep infected with Visna/maedi virus via the respiratory tract.</a> J Gen Virol. 88, 670-679 (2007).</li><li>Starcher, B., Williams, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+intratracheal+instillation+of+endotoxin+into+the+lungs+of+mice.">A method for intratracheal instillation of endotoxin into the lungs of mice.</a> Lab Anim. 23, 234-240 (1989).</li><li>Downs, C. A., Kumar, A., Kreiner, L. H., Johnson, N. M., Helms, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2O2+regulates+lung+ENaC+via+ubiquitin-like+protein+Nedd8.">H2O2 regulates lung ENaC via ubiquitin-like protein Nedd8.</a> J Biol Chem. 288, 8136-8145 (2013).</li><li>Gammon, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+anatomical,+molecular,+and+functional+imaging+of+the+lung+with+multiple+modalities.">Preclinical anatomical, molecular, and functional imaging of the lung with multiple modalities.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L897-L914 (2014).</li><li>Takemura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+regulation+of+epithelial+sodium+channels+in+rat+alveolar+type+2+epithelial+cells.">Cholinergic regulation of epithelial sodium channels in rat alveolar type 2 epithelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L428-L437 (2013).</li><li>Lewis, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+the+lungs+using+x-ray+phase+contrast.">Dynamic imaging of the lungs using x-ray phase contrast.</a> Phys Med Biol. 50, 5031-5040 (2005).</li><li>Nyren, S., Radell, P., Mure, M., Petersson, J., Jacobsson, H., Lindahl, S. G., Sanchez-Crespo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhalation+anesthesia+increases+V/Q+heterogeneity+during+spontaneous+breathing+in+healthy+subjects.">Inhalation anesthesia increases V/Q heterogeneity during spontaneous breathing in healthy subjects.</a> Anesthesiology. 113 (6), 1370-1375 (2010).</li></ol>

Este artículo es parte de una edición especial sobre Imaging Multimodal Preclínica, patrocinado por Bruker Biospin.

El uso de imágenes de rayos X, imágenes claras de los pulmones neonatales pueden ser analizados por los volúmenes de fluidos pulmonares. Nos 7,3,11, 10 y otros, hemos utilizado con éxito imágenes de rayos X para determinar los cambios dinámicos en el volumen de líquido pulmonar en modelos animales anestesiados libremente la respiración, y esta técnica es una gran promesa para avanzar en el estudio de la lesión pulmonar neonatal. Una gran ventaja en el uso de nuestro enfoque para evaluar e...

Al nacer, el pulmón del recién nacido debe hacer la transición desde un fluido que secretan a un órgano reabsorber fluido para establecer la ventilación y la oxigenación del cuerpo adecuada. Los mecanismos que facilitan (o dificulte) una depuración efectiva del líquido pulmonar en el momento del nacimiento no están claros. Modelado de la velocidad de eliminación del fluido alveolar en C57BL / 6 crías de ratón recién nacido va a llevar a una mejor comprensión de los factores regulatorios que pueden realzar o atenuar la tasa de absorción de líquidos. También se podría aplicar a otros modelos neonatales de la lesión pulmonar aguda o infección, y podría conducir a nuevas estrategias terapéuticas para los recién nacidos con dificultad respiratoria. Dado que los pulmones del recién nacido son minúsculos en comparación con los adultos pulmones, las medidas convencionales de líquido de limpieza alveolar que se basan en mediciones de lavado o gravimétrico puede no ser adecuado para estudiar con precisión el líquido de limpieza de pulmón en modelos pulmonares neonatales. En este protocolo, se demuestra un ensayo que permitela determinación precisa de las tasas de eliminación de fluidos alveolares en postnatal cachorros día 10 de C57BL / 6 ratones usando un pequeño generador de imágenes de animales. Una ventaja importante de utilizar un enfoque fluoroscópica es que los animales son imágenes in vivo. Ellos están respirando libremente y pueden recuperarse de este ensayo mínimamente invasiva para el futuro de la observación y estudio. El objetivo general de este método es el modelo de edema pulmonar en el pulmón del recién nacido, y evaluar la velocidad de eliminación del fluido alveolar en pulmón neonatal. Esta técnica fue desarrollada, en parte, como una estrategia de reducción para disminuir el número de animales necesarios, sin embargo, maximizar la producción experimental. Esta técnica también permite la detección superior de los volúmenes de fluidos pulmonares utilizando imágenes de rayos X y requiere el dominio de sujeción de los animales básica y gastos de envío 1; pequeña cirugías animales y traqueal instilación 2, un pequeño generador de imágenes animal, y el software básico de análisis de imagen. Los investigadores que deseen evaluar los volúmenes de líquido pulmonar in vivo (BRE librementeathing anestesiado modelos animales) puede encontrar el procedimiento adecuado para su aplicación. Por último, este protocolo podría aumentar otros modelos existentes de la lesión pulmonar neonatal utilizado en el estudio mecanicista de la displasia broncopulmonar, incluidas las lesiones inducidas por hiperoxia pulmonar, ventilación mecánica, y los modelos de inflamación pulmonar 3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="826">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Preclinical Imaging System (In- Vivo MS FX PRO)</td>
			<td style="width:241px;">Bruker; Billerica, MA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketamine</td>
			<td>Ketaset; Fort Dodge Animal Health, IA</td>
			<td>26637-411-01</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylazine</td>
			<td>Lloyd Laboratories; Shenandoah, IA</td>
			<td>4821</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (with Calcium and Magnesium)&#160;</td>
			<td>Lonza; Walkersville, MD</td>
			<td>17-513F</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Amresco; Solon, OH</td>
			<td>241</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassuim chloride</td>
			<td>Fisher Scientific; Fair Lawn, NJ</td>
			<td>P217-3</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich; St. Loius, MO</td>
			<td>C5080</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich; St. Loius, MO</td>
			<td>H3375</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.3 mL insulin syringe with 31Gx5/16&#34; (8mm) needle</td>
			<td>BD Insulin Syringe; Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>328438</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time x-ray imaging of lung fluid volumes in neonatal mouse lung

En el nacimiento, el pulmón experimenta un profundo interruptor fenotípica de la secreción a la absorción, lo que permite la adaptación a respirar de forma independiente. Promoción y mantenimiento de este fenotipo es críticamente importante en el crecimiento y el intercambio de gas alveolar normal de toda la vida. Varios estudios in vitro han caracterizado el papel de las proteínas reguladoras clave, moléculas de señalización, y hormonas esteroides que pueden influir en la velocidad de eliminación de líquido pulmonar. Sin embargo, en los exámenes vivo deben ser realizadas para evaluar si estos factores reguladores desempeñan importantes funciones fisiológicas en la regulación de la absorción de líquido pulmonar perinatal. Como tal, la utilización de imágenes de rayos X en tiempo real para determinar el líquido de limpieza de pulmón perinatal, o edema pulmonar, representa un avance tecnológico en el campo. Aquí, nos explican e ilustran un método para evaluar la velocidad de eliminación de líquido pulmonar alveolar y la inundación alveolar en ratones C57BL / 6 en el día post parto nosotros 10ing formación de imágenes y análisis de rayos X. La implementación exitosa de este protocolo requiere la aprobación previa de los comités institucionales de cuidado y uso de animales (IACUC), un sistema de imágenes de rayos X de pequeño animal in vivo, y software de imágenes moleculares compatibles.

Los paneles de la izquierda en las figuras 9 - 10 son de PN 10 pulmones de ratones fotografiados al inicio del estudio (pre-inculcado). Estas imágenes muestran la instilación de solución salina con éxito de desafíos en el lóbulo izquierdo de los pulmones neonatales. En la Figura 9, el pulmón de ratón se traqueal inculca con la solución salina se ha definido anteriormente (ver sección 2.1). Los paneles central y derecha de la figura 9</s...

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Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology.

En tiempo real de imágenes de rayos X de los pulmones de volúmenes de líquido en pulmón de ratón neonatal

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting ...

real-time-x-ray-imaging-of-lung-fluid-volumes-in-neonatal-mouse-lung

Research

JoVE Journal

Medicine

8.6K vistas.  Emory University. We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology. 

Video: Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

X-ray Dose Reduction through Adaptive Exposure in Fluoroscopic Imaging

X-ray fluoroscopy is widely used for image guidance during cardiac intervention. However, radiation dose in these procedures can be high, and this is a significant concern, particularly in pediatric applications. Pediatrics procedures are in general much more complex than those performed on adults and thus are on average four to eight times longer1. Furthermore, children can undergo up to 10 fluoroscopic procedures by the age of 10, and have been shown to have a three-fold higher risk of developing fatal cancer throughout their life than the general population2,3.
We have shown that radiation dose can be significantly reduced in adult cardiac procedures by using our scanning beam digital x-ray (SBDX) system4-- a fluoroscopic imaging system that employs an inverse imaging geometry5,6 (Figure 1, Movie 1 and Figure 2). Instead of a single focal spot and an extended detector as used in conventional systems, our approach utilizes an extended X-ray source with multiple focal spots focused on a small detector. Our X-ray source consists of a scanning electron beam sequentially illuminating up to 9,000 focal spot positions. Each focal spot projects a small portion of the imaging volume onto the detector. In contrast to a conventional system where the final image is directly projected onto the detector, the SBDX uses a dedicated algorithm to reconstruct the final image from the 9,000 detector images.
For pediatric applications, dose savings with the SBDX system are expected to be smaller than in adult procedures. However, the SBDX system allows for additional dose savings by implementing an electronic adaptive exposure technique. Key to this method is the multi-beam scanning technique of the SBDX system: rather than exposing every part of the image with the same radiation dose, we can dynamically vary the exposure depending on the opacity of the region exposed. Therefore, we can significantly reduce exposure in radiolucent areas and maintain exposure in more opaque regions. In our current implementation, the adaptive exposure requires user interaction (Figure 3). However, in the future, the adaptive exposure will be real time and fully automatic.
We have performed experiments with an anthropomorphic phantom and compared measured radiation dose with and without adaptive exposure using a dose area product (DAP) meter. In the experiment presented here, we find a dose reduction of 30%.

We are developing a dynamic adaptive exposure technique using our scanning beam digital X-ray system. Rather than exposing an object uniformly, the exposure is adapted depending on the opacity of the object. Here we show an experiment on an anthropomorphic phantom that resulted in a dose saving of 30%.

Dosis de rayos X a través de la reducción de la exposición de adaptación en imagen fluoroscópica

X-ray fluoroscopy is widely used for image guidance during cardiac intervention. However, radiation dose in these procedures can be high, and this is a ...

Investigación

Medicina

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are associated with obesity, though the precise underlying mechanisms that contribute to the disease are currently being delineated.2,3 Several small animal models of obesity have been developed and are employed in a variety of studies.4 A critical component to these experiments involves the collection of regional and/or total animal fat content data under varied conditions.
Traditional experimental methods available for measuring fat content in small animal models of obesity include invasive (e.g. ex vivo measurement of fat deposits) and non-invasive (e.g. Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA), or Magnetic Resonance (MR)) protocols, each of which presents relative trade-offs. Current invasive methods for measuring fat content may provide details for organ and region specific fat distribution, but sacrificing the subjects will preclude longitudinal assessments. Conversely, current non-invasive strategies provide limited details for organ and region specific fat distribution, but enable valuable longitudinal assessment. With the advent of dedicated small animal X-ray computed tomography (CT) systems and customized analytical procedures, both organ and region specific analysis of fat distribution and longitudinal profiling may be possible. Recent reports have validated the use of CT for in vivo longitudinal imaging of adiposity in living mice.5,6 Here we provide a modified method that allows for fat/total volume measurement, analysis and visualization utilizing the Carestream Molecular Imaging Albira CT system in conjunction with PMOD and Volview software packages.

Fat content analysis is routinely conducted in studies utilizing murine obesity models. Emerging methods in small animal CT imaging and analysis are providing for longitudinal detail rich fat content analysis. Here we detail step by step procedures for performing small animal CT imaging, analysis, and visualization.

La segmentación y la medición de los volúmenes de grasa en modelos murinos de obesidad Usando rayos X de tomografía computarizada

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Un sencillo método de intubación ratón de pulmón

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Líquido cefalorraquídeo MicroRNA perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Diagnostic Ultrasound Imaging of Mouse Diaphragm Function

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive surgical procedures. Although this is an effective method of assessing in vitro diaphragm activity, it involves non-survival surgery. The application of non-invasive ultrasound imaging as an in vivo procedure is beneficial since it not only reduces the number of animals sacrificed, but is also suitable for monitoring disease progression in live mice. Thus, our ultrasound imaging method may likely assist in the development of novel therapies that alleviate muscle injury induced by various respiratory diseases. Particularly, in clinical diagnoses of obstructive lung diseases, ultrasound imaging has the potential to be used in conjunction with other standard tests to detect the early onset of diaphragm muscle fatigue. In the current protocol, we describe how to accurately evaluate diaphragm contractility in a mouse model using a diagnostic ultrasound imaging technique.

Diagnostic ultrasound imaging has proven to be effective in diagnosing various respiratory diseases in human and animal subjects. We demonstrate a comprehensive ultrasound protocol utilized by Dr. Zuo's lab to analyze diaphragm kinetics specifically in mouse models. This is also a non-invasive research technique which can provide quantitative information on mouse respiratory muscle function.

Ultrasonido Diagnóstico por la Imagen de la función del ratón del diafragma

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive ...

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and repair damage in simple tissues in the orthopedic and periodontal fields. However, attempts to regenerate the structures and functions of more complex three-dimensional (3D) organs such as lungs have not been very successful because the biological processes of organ regeneration have not been well explored. It is becoming clear that angiogenesis, the formation of new blood vessels, plays key roles in organ regeneration. Newly formed vasculatures not only deliver oxygen, nutrients and various cell components that are required for organ regeneration but also provide instructive signals to the regenerating local tissues. Therefore, to successfully regenerate lungs in an adult, it is necessary to recapitulate the lung-specific microenvironments in which angiogenesis drives regeneration of local lung tissues. Although conventional in vivo angiogenesis assays, such as subcutaneous implantation of extracellular matrix (ECM)-rich hydrogels (e.g., fibrin or collagen gels or Matrigel - ECM protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells), are extensively utilized to explore the general mechanisms of angiogenesis, lung-specific angiogenesis has not been well characterized because methods for orthotopic implantation of biomaterials in the lung have not been well established. The goal of this protocol is to introduce a unique method to implant fibrin gel on the lung surface of living adult mouse, allowing for the successful recapitulation of host lung-derived angiogenesis inside the gel. This approach enables researchers to explore the mechanisms by which the lung-specific microenvironment controls angiogenesis and alveolar regeneration in both normal and pathological conditions. Since implanted biomaterials release and supply physical and chemical signals to adjacent lung tissues, implantation of these biomaterials on diseased lung can potentially normalize the adjacent diseased tissues, enabling researchers to develop new therapeutic approaches for various types of lung diseases.

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

El implante de gel de fibrina en pulmón de ratón para el Estudio de la angiogénesis pulmón específico

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

Mouse Pneumonectomy Model of Compensatory Lung Growth

In humans, disrupted repair and remodeling of injured lung contributes to a host of acute and chronic lung disorders which may ultimately lead to disability or death. Injury-based animal models of lung repair and regeneration are limited by injury-specific responses making it difficult to differentiate changes related to the injury response and injury resolution from changes related to lung repair and lung regeneration. However, use of animal models to identify these repair and regeneration signaling pathways is critical to the development of new therapies aimed at improving pulmonary function following lung injury. The mouse pneumonectomy model utilizes compensatory lung growth to isolate those repair and regeneration signals in order to more clearly define mechanisms of alveolar re-septation. Here, we describe our technique for performing mouse pneumonectomy and sham pneumonectomy. This technique may be utilized in conjunction with lineage tracing or other transgenic mouse models to define molecular and cellular mechanism of lung repair and regeneration.

Mouse pneumonectomy is a commonly employed model of compensatory lung growth. This procedure can be used in conjunction with lineage tracing or transgenic mouse models to elucidate underlying mechanisms.

Ratón neumonectomía Modelo de Compensatoria crecimiento pulmonar

In humans, disrupted repair and remodeling of injured lung contributes to a host of acute and chronic lung disorders which may ultimately lead to ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. As this technology expands and improves, the ability to potentially evaluate and improve the quality of substandard lungs prior to transplant is a critical need. In order to more rigorously evaluate these approaches, a reproducible animal model needs to be established that would allow for testing of improved techniques and management of the donated lungs as well as to the lung-transplant recipient. In addition, an EVLP animal model of associated pathologies, e.g., ventilation induced lung injury (VILI), would provide a novel method to evaluate treatments for these pathologies. Here, we describe the development of a rat EVLP lung program and refinements to this method that allow for a reproducible model for future expansion. We also describe the application of this EVLP system to model VILI in rat lungs. The goal is to provide the research community with key information and &#8220;pearls of wisdom&#8221;/techniques that arose from trial and error and are critical to establishing an EVLP system that is robust and reproducible.

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. Here, we describe the development of a rat EVLP program and refinements that allow for a reproducible model for future expansion.

Método de aislados<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusión pulmonar en un modelo de rata: Lecciones Aprendidas de Desarrollo de un Programa EVLP Rata

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Evaluación de pulmón metástasis en el ratón mamarias modelos tumorales mediante PCR cuantitativa en tiempo real

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Echocardiographic Measurement of Right Ventricular Diastolic Parameters in Mouse

Diastolic dysfunction is a prominent feature of right ventricular (RV) remodeling associated with conditions of pressure overload. However, the RV diastolic function is rarely quantified in experimental studies. This might be due to technical difficulties in the visualization of the RV in the apical four-chamber view in rodents. Here we describe two positions facilitating the visualization of the apical four-chamber view in mice to assess the RV diastolic function.
The apical four-chamber view is enabled by tilting the mouse fixation platform to the left and caudally (LeCa) or to the right and cranially (RiCr). Both positions provide images of comparable quality. The results of the RV diastolic function obtained from two positions are not significantly different. Both positions are comparably easy to perform. This protocol can be incorporated into published protocols and enables detailed investigations of the RV function.

Here we describe and compare two positions for obtaining the apical four-chamber view in mice. These positions enable the quantification of the right ventricular function, provide comparable results, and can be used interchangeably.

En tiempo real de imágenes de rayos X de los pulmones de volúmenes de líquido en pulmón de ratón neonatal

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