Name: real-time x-ray imaging of lung fluid volumes in neonatal mouse lung
Uploaded: 2016-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
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This work is supported by a grant awarded to MNH by Children's Healthcare of Atlanta, the APS 2014 Short-Term Research Education Program to Increase Diversity in Health-Related Research (STRIDE) fellowship awarded to PT, and the University of Notre Dame Integrated Imaging Facility.

Tutte le tecniche sperimentali devono essere condotte in conformità con le linee guida istituzionali di cura e del Comitato Usa. 1. X-ray Imaging Acquisition <ol><li> Panoramica del software (vedi Figura 1 per una panoramica delle Impostazioni del software). <ol><li> Selezionare il pulsante Cattura direttamente sotto la scheda File. </li><li> Nel menu a discesa Impostazioni, selezionare sessione corrente. </li><li> Selezionare Esposizione standard nella casella a discesa posto sotto Tempo di esposizione. </li><li> Impostare il tempo di esposizione a 2,00 min, e n Le esposizioni verso 1. Impostare la X e Y Binning categorizzazione a 2 pixel. Vedere la Figura 1. </li><li> Selezionare accumulo finale dal menu a discesa Opzioni di esportazione. </li><li> Nelle impostazioni di illuminazione, seleCT a raggi X dal menu a discesa Fonte di illuminazione. Il valore predefinito KVP è fissato a 35. </li><li> Selezionare Autoselect nel menu Applicare il file di riferimento discesa per applicare il file di riferimento a raggi X corrispondente. (Vedere paragrafo 2). </li><li> Nella fotocamera impostata impostazioni, impostare l&#39;f-stop a 2.51. </li><li> Impostare il FOV (campo visivo) a 125.64 per topi PN10. </li><li> Impostare il piano focale a 13, e nel menu a discesa accanto al dispositivo di scorrimento piano focale, selezionare X-Ray. </li><li> Per i raggi X, impostare il filtro di eccitazione e il filtro per le emissioni a 0 nel menu a discesa. </li><li> Salva sessione corrente facendo clic su Nuovo sulla parte superiore accanto a Impostazioni. Inserire il nome per la nuova Acquisisci impostazioni del file, ad esempio, &quot;Evento Giove singola esposizione per fare un protocollo.&quot; Vedere la Figura 2. </li></ol&gt; </li><li> Creazione di un protocollo di imaging a raggi X <ol><li> Fare clic sul pulsante Crea / Modifica protocolli sul lato destro della finestra aperta. </li><li> Come appare la finestra pop-up nuovo protocollo, fare clic sul pulsante Nuovo nell&#39;angolo in alto a destra </li><li> Inserire il nome che il protocollo salverà sotto, ad esempio &quot;Giove Demo Protocol&quot;, e fare clic su OK. (Vedi figura 3). </li><li> Nella parte inferiore della finestra pop-up protocollo nel protocollo passaggi, assicurarsi che Fase 1 è evidenziata in rosso, Capture Nuove Immagini è selezionata, e non fare nulla è selezionato nel menu a discesa Prima di Acquisizione Immagine. </li><li> In Capture Impostazioni, selezionare l&#39;evento esposizione singola di recente generato dal punto 1.1.12. </li><li> Selezionare Wait (sec) dal menu a discesa Dopo Acquisizione Immagine. </li><li> Fare clic sul pulsante Modifica, tipe 180 nella casella di pop-up, e fare clic su OK per aggiungere un 3 min tempo di attesa dopo ogni acquisizione 2 min. </li><li> Duplicate Passo 1 facendo clic destro sulla scheda Fase 1 e Fase selezionando Duplica. Creare 23 duplicati per un periodo di osservazione di 2 ore. (Vedi Figura 4). </li><li> Sul passo finale (punto 24), modificare l&#39;immagine Dopo l&#39;impostazione per non fare niente da Wait (sec) Capture. </li><li> Fare clic sul pulsante Salva e uscire dall&#39;editor protocollo. </li></ol></li></ol> 2. File di riferimento di illuminazione Nota: Applicare file di riferimento illuminazione a raggi X ad una immagine a raggi X per correggere automaticamente le variazioni di rivelatore uniformità delle immagini a raggi X ottenuti durante esperimento. Le procedure descritte di seguito sono specifiche per la Bruker imaging in vivo sistemi animali; altri sistemi di imaging in vivo puòessere usato. <ol><li> Generare un file di riferimento illuminazione aprendo il software di imaging molecolare e facendo clic sul pulsante Cattura. </li><li> Utilizzando il menu a comparsa, stabilire le impostazioni di acquisizione dei raggi X a Fonte di illuminazione (vedere Impostazioni di cui alla sezione 1) e poi selezionare riferimento Illuminazione nel tipo di esposizione. Questo può essere trovato sotto le esposizioni standard casella a discesa. (Vedi figura 5). </li><li> Rimuovere tutti i campioni dalla stazione di immagine. Impostare il binning X e Y a 4 x 4 binning. Fare riferimento alla Tabella 1: tempi di esposizione file di riferimento illuminazione per determinare il tempo di esposizione accurata. </li><li> Press Expose. </li><li> Applicare il file di riferimento selezionando Selezione automatica dal menu a discesa sotto Applicare file di riferimento. (Vedi figura 6). Il file di riferimento illuminazione sarà ora applicato automaticamente a tutti im raggi Xetà catturati con le stesse impostazioni della fotocamera. I passaggi 2,1-2,4 non dovrà essere ripetuta se stesse impostazioni della fotocamera sono utilizzati in esperimenti successivi. Nota: Un file di riferimento illuminazione può essere applicata dopo l&#39;acquisizione delle immagini, o se un messaggio di errore si verifica dopo l&#39;auto-selezione dei file di riferimento. Applicare l&#39;illuminazione file di riferimento cattura post-immagine utilizzando la seguente serie di comandi nel pannello di navigazione del software di imaging molecolare: Immagine&gt; Immagine matematica&gt; Tipo: Task&gt; Calcolare: correzione illuminazione. Selezionare l&#39;immagine in ingresso (X) che si desidera applicare il file di riferimento illuminazione (Y). Rinominare il file corretto (Z). (Vedi Figura 7). </li></ol> Manipolazione 3. Animal <ol><li> L&#39;acquisizione di animali <ol><li> Acquisto dighe in stato di gravidanza da allevatori commerciale o allevare topi femmina in casa a 12 settimane di età (o più) in conformità con le linee guida istituzionaliS. </li><li> Casa topi neonati con madri che allattano fino al giorno postnatale (PN) 10. </li></ol></li><li> Anestesia animali (PN 10) <ol><li> Preparare un cocktail ketamina / xylazina per anestetizzare PN 10 topi per effetti anestetici prolungati della durata massima di 40 min. Aggiungere 500 ml di ketamina (100 mg / ml) a 75 ml di xilazina (100 mg / ml). Diluire 1:10 in una soluzione salina allo 0,9% per fare una ketamina (100 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg) cocktail anestetico. </li><li> Pesare i topi appena nati. </li><li> Utilizzando una siringa 3/10 con un ago 31 G 5/16 pollici (8 mm), somministrare 10 ml / g di peso corporeo di anestesia con una iniezione intraperitoneale. </li><li> Mantenere gli animali asciutto e coibentato per evitare la perdita eccessiva di calore del corpo. </li></ol></li></ol> 4. tracheale Instillazioni <ol><li> Preparare una soluzione salina intratracheale composto da 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2, e 10 mM HEPES; pH = 7.4. La osmolalità della soluzione deve essere319 mosmol / kg H 2 O. </li><li> Monte anestetizzato animali lato ventrale up su una tavola inclinata chirurgica con del nastro chirurgico. Ensurethat teste degli animali sono in cima della salita. </li><li> Eseguire un pizzico punta a garantire che gli animali sono anestetizzati e pronti per la chirurgia. Disinfettare tutte le aree chirurgiche, strumenti e regione toracica dell&#39;animale. </li><li> Fare una piccola (3 mm) incisione sotto l&#39;aspetto ventrale antero-mediale della (regione della gola) del collo utilizzando un bisturi chirurgico, dimensione 11. mettere da parte il platisma e anteriore muscoli tracheale con pinze smussati in modo da visualizzare e accedere alla trachea. </li><li> Instillare 3 ml / g di peso (circa 10 - 30 ml di volume finale) di soluzione fisiologica attraverso la trachea esposto usando un ago 31 G 5/16 pollici (8 mm). L&#39;incisione minore viene lasciato aperto durante l&#39;imaging animale e di solito si guarisce bene. Consultare divisione locale di risorse animali per determinare se l&#39;incisione allo stesso modo può essere lasciata aperta. In caso contrario, può sutureessere richiesto. </li></ol> 5. Imaging Animal <ol><li> Posizionare i cuccioli ventrale su una chiara fondo, estraibile, vassoio di imaging animale. Centrare gli animali così che il fascio di raggi X verrà direttamente sopra la zona toracica. </li><li> Per dispari coorti di animali numerati, posizionare il primo cucciolo direttamente nel centro del vassoio, e per le coorti anche numerato il primo cucciolo appena a sinistra del centro in modo che quando gli altri animali sono posizionati sul vassoio tutti gli animali sono centrati. </li><li> Riportare il vassoio di imaging per il mobile imaging a raggi X e chiudere la porta dell&#39;armadio. </li><li> Accendere l&#39;unità di controllo termico all&#39;animale di mantenere la temperatura corporea degli animali anestetizzati. Utilizzare l&#39;impostazione alta per ottenere una temperatura della camera di circa 35-37 ° C. Accendere l&#39;unità animale anestesia (isoflurano vaporizzato distribuito mediante ossigeno) per garantire gli animali sono anestetizzati e immobilizzati per tutta la durata della procedura di imaging 2 ore. </li><li> protocollo di imaging Esecuzione a raggi X<ol><li> Clicca sulla cattura e selezionare il protocollo appropriato, ad esempio, &quot;Giove Demo protocollo,&quot; dal menu a discesa Protocollo. (Vedere Figura 8). </li><li> Fare clic sul pulsante Esegui protocollo selezionato il software di imaging molecolare. Nota: Viene visualizzata una finestra pop-up per monitorare lo stato della acquisizione delle immagini, quando il protocollo è completata la finestra scompare. La dose di raggi X è bassa, &lt;di 0,3 mrem o circa 10 volte meno di un dentale X-ray. Come con altre procedure X-Ray, non c&#39;è nessuna radiazione residua. </li><li> Quando la sessione di acquisizione 2 ore, rimuovere gli animali dal vassoio di imaging e restituirli alla loro gabbia. Monitorare gli animali per il pieno recupero prima di tornare a rack. </li></ol></li></ol> Analisi 6. Dati Nota: il software di imaging molecolare permette per la quantificazione e la traduzione di Xray intensità dei pixel in frequenza della clearance fluido polmonare. Le seguenti procedure delineano le procedure necessarie per normalizzare le immagini a raggi X e quantificare intensità nelle regioni definite di interesse (ROI). <ol><li> Progettare un modello di ROI Nota: Una regione di template interesse deve essere creata specifico per le immagini radiografiche acquisite durante lo studio 2 hr, e deve essere usato per comparare le intensità dei raggi X tra i gruppi sperimentali. Da piccoli volumi di soluzione salina sfide tipicamente accumulano nel lobo superiore sinistro del polmone 4-6, il ROI (s) dovrebbe concentrarsi su questa parte del polmone. <ol><li> Aprire la prima e l&#39;ultima immagine a raggi x nel set di 2 ore. Selezionare la finestra dell&#39;immagine prima x-ray. </li><li> Nella barra degli strumenti di navigazione, selezionare Manuale-ROI&gt; Nuovo ROI Set. </li><li> Clicca ROI Ellisse e creare un ROI che copre adeguatamente il mouse a destra lung.An ROI non è definito fino a quando il rosso, ha delineato il ROI è il dragged in una posizione diversa. Un ROI definita verrà delineata in blu con un numero. </li><li> Se più cuccioli vengono esposte, clicca con il rosso, il ROI delineato e trascinare per i polmoni a sinistra degli altri topi per creare più ROI individuale nello stesso set. Trascinare il rosso, ROI delineato in una zona con un fondo chiaro per creare un ROI sfondo. <ol><li> Selezionare puntatore di selezione per posizionare le ROI a giacere sopra polmone sinistro di ogni mouse, direttamente sotto la seconda costola. </li></ol></li><li> Nella barra degli strumenti superiore, fare clic su display LCD. </li><li> Controllare Overlay nella finestra di visualizzazione delle immagini per sovrapporre l&#39;ultima immagine a raggi x, pur mantenendo le posizioni set ROI. Se necessario, selezionare puntatore di selezione nella barra degli strumenti di navigazione per regolare le posizioni del ROI e garantire una copertura adeguata del polmone in entrambe le immagini. </li><li> Nella finestra di dialogo ROI manuale, selezionare Modello&gt; Salva come modello. nome tegli modello e fare clic su OK. </li><li> Chiudere entrambe le immagini. Selezionare No quando viene richiesto di salvare le modifiche. </li><li> Applicare il modello di ROI per ogni immagine a raggi X catturato per analizzare gioco fluido con l&#39;apertura di tutte le immagini scattate nel corso dello studio. Inizia selezionando un file aperto e fare clic su ROI Manuale&gt; Modello. </li><li> Selezionare il modello ROI creato in precedenza dal menu a discesa e fare clic su Applica a tutti i documenti aperti. </li></ol></li><li> Export numerica ROI dati dalle immagini su un foglio di calcolo <ol><li> Nell&#39;angolo in alto a sinistra, fare clic su File&gt; Esporta dati&gt; ROI. </li><li> Controllare come visualizzato e Auto Open in Excel nella finestra di pop-up. </li><li> Selezionare Esporta tutti aperti Documenti. </li><li> Assegnare un nome al file e fare clic su Salva. </li><li> Chiudi software di imaging molecolare. </li></ol></li></ol&gt;

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	<li>Institute of Laboratory Animal Resources. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2011).</li><li>Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+tracheal+instillation+of+solutes+into+mouse+lung.">Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Hilgendorff, A., Reiss, I., Ehrhardt, H., Eickelberg, O., Alvira, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+lung+disease+in+the+preterm+infant.+Lessons+learned+from+animal+models.">Chronic lung disease in the preterm infant. Lessons learned from animal models.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 50, 233-245 (2014).</li><li>Goodson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nadph+oxidase+regulates+alveolar+epithelial+sodium+channel+activity+and+lung+fluid+balance+in+vivo+via+O2-+signaling.">Nadph oxidase regulates alveolar epithelial sodium channel activity and lung fluid balance in vivo via O2- signaling.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L410-L419 (2012).</li><li>McNeilly, T. N., Tennant, P., Lujan, L., Perez, M., Harkiss, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+infection+efficiencies+of+peripheral+lung+and+tracheal+tissues+in+sheep+infected+with+Visna/maedi+virus+via+the+respiratory+tract.">Differential infection efficiencies of peripheral lung and tracheal tissues in sheep infected with Visna/maedi virus via the respiratory tract.</a> J Gen Virol. 88, 670-679 (2007).</li><li>Starcher, B., Williams, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+intratracheal+instillation+of+endotoxin+into+the+lungs+of+mice.">A method for intratracheal instillation of endotoxin into the lungs of mice.</a> Lab Anim. 23, 234-240 (1989).</li><li>Downs, C. A., Kumar, A., Kreiner, L. H., Johnson, N. M., Helms, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2O2+regulates+lung+ENaC+via+ubiquitin-like+protein+Nedd8.">H2O2 regulates lung ENaC via ubiquitin-like protein Nedd8.</a> J Biol Chem. 288, 8136-8145 (2013).</li><li>Gammon, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+anatomical,+molecular,+and+functional+imaging+of+the+lung+with+multiple+modalities.">Preclinical anatomical, molecular, and functional imaging of the lung with multiple modalities.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L897-L914 (2014).</li><li>Takemura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+regulation+of+epithelial+sodium+channels+in+rat+alveolar+type+2+epithelial+cells.">Cholinergic regulation of epithelial sodium channels in rat alveolar type 2 epithelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L428-L437 (2013).</li><li>Lewis, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+the+lungs+using+x-ray+phase+contrast.">Dynamic imaging of the lungs using x-ray phase contrast.</a> Phys Med Biol. 50, 5031-5040 (2005).</li><li>Nyren, S., Radell, P., Mure, M., Petersson, J., Jacobsson, H., Lindahl, S. G., Sanchez-Crespo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhalation+anesthesia+increases+V/Q+heterogeneity+during+spontaneous+breathing+in+healthy+subjects.">Inhalation anesthesia increases V/Q heterogeneity during spontaneous breathing in healthy subjects.</a> Anesthesiology. 113 (6), 1370-1375 (2010).</li></ol>

Questo articolo fa parte di un numero speciale su Imaging multimodale pre-clinico, sponsorizzato da Bruker Biospin.

L&#39;utilizzo di immagini a raggi X, immagini nitide di polmoni neonatali possono essere analizzati per polmone volumi fluidi. Noi 7,3,11, e altri 10, hanno utilizzato con successo imaging a raggi X per determinare i cambiamenti dinamici nel volume del fluido polmonare in modelli animali liberamente respirazione anestetizzati, e questa tecnica rappresenta una grande promessa per far progredire lo studio del danno polmonare neonatale. Uno dei principali vantaggi nell&#39;utilizzo nostro approccio p...

Alla nascita, il polmone neonato deve passare da un secernenti liquido ad un organo riassorbire il fluido di stabilire una adeguata ventilazione e l&#39;ossigenazione del corpo. I meccanismi che facilitano (o ostacola) distanza effettiva di liquido polmonare al momento della nascita rimangono poco chiari. Modellazione il tasso di gioco fluido alveolare in C57BL / 6 cuccioli appena nati del mouse porterà a una migliore comprensione dei fattori normativi che possono migliorare o attenuare il tasso di assorbimento di liquidi. Potrebbe essere applicato anche ad altri modelli neonatali di danno polmonare acuto o infezione, e potrebbe portare a nuove strategie terapeutiche per neonati con distress respiratorio. Dal momento che i polmoni appena nati sono minuscoli rispetto ai polmoni adulti, misure convenzionali di spazio fluido alveolare che si basano su misurazioni di lavaggio o gravimetrici potrebbero non essere adatto per studiare con precisione spazio fluido polmonare in modelli polmone neonatale. In questo protocollo, dimostriamo un metodo che permette dila determinazione accurata della velocità di clearance fluidi alveolari in postnatali cuccioli giorno 10 C57BL / 6 del mouse con un piccolo imager animali. Uno dei principali vantaggi di utilizzare un approccio fluoroscopic è che gli animali vengono esposte in vivo. Essi sono liberamente respirazione e può recuperare da questo test minimamente invasiva per la futura osservazione e lo studio. L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di modellare edema polmonare nel polmone neonato, e valutare il tasso di gioco fluido alveolare polmonare neonatale. Questa tecnica è stata sviluppata, in parte, come strategia di riduzione per diminuire il numero di animali necessari, ma massimizzare la produzione sperimentale. Questa tecnica consente inoltre di rilevazione superiore di volumi di fluido polmonari utilizzando immagini a raggi X e richiede competenza in moderazione animale base e trattare 1; piccoli interventi chirurgici su animali e tracheale instillazione 2, un piccolo imager animali, e software di base di analisi di immagine. Gli investigatori che desiderano valutare i volumi di fluido polmonare in vivo (liberamente Breathing anestetizzato modelli animali), può trovare questa procedura adatta per la loro applicazione. Infine, questo protocollo potrebbe aumentare di altri modelli esistenti di danno polmonare neonatale utilizzato nello studio meccanicistico di displasia broncopolmonare, tra cui lesioni iperossia indotta polmone, ventilazione meccanica, e modelli di infiammazione polmonare 3.

<table><tbody><tr><td>Preclinical Imaging System (In- Vivo MS FX PRO)</td><td>Bruker; Billerica, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Ketaset; Fort Dodge Animal Health, IA</td><td>26637-411-01</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Laboratories; Shenandoah, IA</td><td>4821</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (with Calcium and Magnesium)&amp;nbsp;</td><td>Lonza; Walkersville, MD</td><td>17-513F</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Amresco; Solon, OH</td><td>241</td><td></td></tr><tr><td>Potassuim chloride</td><td>Fisher Scientific; Fair Lawn, NJ</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich; St. Loius, MO</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich; St. Loius, MO</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>0.3 ml insulin syringe with 31 G x 5/16&quot; (8 mm) needle</td><td>BD Insulin Syringe; Franklin Lakes, NJ</td><td>328438</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time x-ray imaging of lung fluid volumes in neonatal mouse lung

Alla nascita, il polmone subisce un interruttore fenotipica profonda da secrezione di assorbimento, che permette l&#39;adattamento alla respirazione indipendente. Promuovere e sostenere questo fenotipo è di fondamentale importanza nel normale scambio di crescita e di gas alveolari per tutta la vita. Diversi studi in vitro hanno caratterizzato il ruolo delle proteine ​​normativi chiave, molecole di segnalazione, e ormoni steroidei che possono influenzare il tasso di gioco fluido polmonare. Tuttavia, negli esami in vivo deve essere eseguita per valutare se questi fattori di regolazione giocano importanti ruoli fisiologici nella regolazione perinatale assorbimento del liquido polmonare. Come tale, l&#39;utilizzazione del tempo reale di immagini a raggi X per determinare perinatale passaggio fluido polmonare o edema polmonare, rappresenta un avanzamento tecnologico nel campo. Qui, spieghiamo e illustrare un approccio per valutare il tasso di alveolare spazio fluido polmonare e inondazioni alveolare in C57BL / 6 topi a post natale giorno ci 10ing imaging a raggi X e l&#39;analisi. Il successo di questo protocollo richiede l&#39;approvazione preventiva da parte la cura degli animali e sull&#39;uso di comitati istituzionali (IACUC), un sistema di imaging a raggi X per piccoli animali in vivo, e software di imaging molecolare compatibili.

I pannelli a sinistra nelle figure 9 - 10 sono di PN 10 polmoni del mouse imaged al basale (pre-instillato). Queste immagini mostrano instillazione successo di sfide salina nel lobo sinistro dei polmoni neonatali. Nella figura 9, il polmone del mouse è stato tracheally instillato con la soluzione salina definito sopra (vedi paragrafo 2.1). I pannelli centrali e di destra di figura 9 sono immagini a raggi X dello stesso topo ottenuto 5 m...

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Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology.

In tempo reale a raggi X Imaging del polmone volumi di fluido in neonatale topo polmone

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting ...

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8.6K Views.  Emory University. We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology. 

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Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung is the most difficult to assess using intravital optical imaging due to its enclosed position within the body, delicate nature and vital role in sustaining proper physiology. While clinical modalities (positron emission tomography (PET), magnetic resonance imaging (MRI) and computed tomography (CT)) are capable of providing noninvasive images of this tissue, they lack the resolution necessary to visualize the earliest seeding events, with a single pixel consisting of nearly a thousand cells. Current models of metastatic lung seeding postulate that events just after a tumor cell&#39;s arrival are deterministic for survival and subsequent growth. This means that real-time intravital imaging tools with single cell resolution 2 are required in order to define the phenotypes of the seeding cells and test these models. While high resolution optical imaging of the lung has been performed using various ex vivo preparations, these experiments are typically single time-point assays and are susceptible to artifacts and possible erroneous conclusions due to the dramatically altered environment (temperature, profusion, cytokines, etc.) resulting from removal from the chest cavity and circulatory system 3. Recent work has shown that time-lapse intravital optical imaging of the intact lung is possible using a vacuum stabilized imaging window 2,4,5 however, typical imaging times have been limited to approximately 6 hr. Here we describe a protocol for performing long-term intravital time-lapse imaging of the lung utilizing such a window over a period of 12 hr. The time-lapse image sequences obtained using this method enable visualization and quantitation of cell-cell interactions, membrane dynamics and vascular perfusion in the lung. We further describe an image processing technique that gives an unprecedentedly clear view of the lung microvasculature.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.

A lungo termine ad alta risoluzione intravitale Microscopia nel polmone con un vuoto stabilizzato finestra Imaging

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic alterations in oncogenes such as the KRAS oncogene, which constitutes ~25% of lung cancer cases. The difficulty in therapeutically targeting KRAS-driven lung cancer partly stems from having poor models that can mimic the progression of the disease in the lab. We describe a method that permits the relative quantification of primary KRAS lung tumors in a Cre-inducible LSL-KRAS G12D mouse model via ultrasound imaging. This method relies on brightness (B)-mode acquisition of the lung parenchyma. Tumors that are initially formed in this model are visualized as B-lines and can be quantified by counting the number of B-lines present in the acquired images. These would represent the relative tumor number formed on the surface of the mouse lung. As the formed tumors develop with time, they are perceived as deep clefts within the lung parenchyma. Since the circumference of the formed tumor is well-defined, calculating the relative tumor volume is achieved by measuring the length and width of the tumor and applying them in the formula used for tumor caliper measurements. Ultrasound imaging is a non-invasive, fast and user-friendly technique that is often used for tumor quantifications in mice. Although artifacts may appear when obtaining ultrasound images, it has been shown that this imaging technique is more advantageous for tumor quantifications in mice compared to other imaging techniques such as computed tomography (CT) imaging and bioluminescence imaging (BLI). Researchers can investigate novel therapeutic targets using this technique by comparing lung tumor initiation and progression between different groups of mice.

This protocol describes the steps taken to induce KRAS lung tumors in mice as well as the quantification of formed tumors by ultrasound imaging. Small tumors are visualized in early timepoints as B-lines. At later timepoints, relative tumor volume measurements are achieved by the measurement tool in the ultrasound software.

Rilevamento della progressione del tumore del polmone nei topi mediante Ultrasound Imaging

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

A seguito in tempo reale l&#39;impatto dei fattori di virulenza pneumococco in un acuto mouse Polmonite modello tramite batteri bioluminescenti

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Immunologia e infezioni

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Casting vascolare di polmoni di mouse postnatali adulti e precoci per l'imaging Micro-CT

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Biologia dello sviluppo

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which causes significant deterioration in lung function and subsequent death from respiratory failure.
The pathogenesis of IPF in experimental animal models has been induced by bleomycin administration. In this study, we investigate an IPF-like mouse model induced by a double intratracheal bleomycin instillation. Standard histological assessments used for studying lung fibrosis are invasive terminal procedures. The goal of this work is to monitor lung fibrosis through noninvasive imaging techniques such as Fluorescent Molecular Tomography (FMT) and Micro-CT. These two technologies validated with histology findings could represent a revolutionary functional approach for real time non-invasive monitoring of IPF disease severity and progression. The fusion of different approaches represents a step further for understanding the IPF disease, where the molecular events occurring in a pathological condition can be observed with FMT and the subsequent anatomical changes can be monitored by Micro-CT.

We describe a non-invasive multimodal imaging approach based on Micro-CT and fluorescence molecular tomography for longitudinal assessment of the mouse lung fibrosis model induced by double intratracheal instillation of bleomycin.

Un Multimodal Imaging approccio basato su Micro-CT e fluorescenza molecolare tomografia per valutazione longitudinale della fibrosi polmonare indotta da bleomicina in topi

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a protocol for studying the pathogenesis of E. coli O1:K1:H7, a serotype responsible for high mortality rates in neonates. Our method utilizes intravital imaging of neonatal pups at different time points during the progression of infection. This imaging, paralleled by measurement of bacteria in the blood, inflammatory profiling, and tissue histopathology, signifies a rigorous approach to understanding infection dynamics during sepsis. In the current report, we model two infectious inoculums for comparison of bacterial burdens and severity of disease. We find that subscapular infection leads to disseminated infection by 10 h post-infection. By 24 h, infection of luminescent E. coli was abundant in the blood, lungs, and other peripheral tissues. Expression of inflammatory cytokines in the lungs is significant at 24 h, and this is followed by cellular infiltration and evidence of tissue damage that increases with infectious dose. Intravital imaging does have some limitations. This includes a luminescent signal threshold and some complications that can arise with neonates during anesthesia. Despite some limitations, we find that our infection model offers an insight for understanding longitudinal infection dynamics during neonatal murine sepsis, that has not been thoroughly examined to date. We expect this model can also be adapted to study other critical bacterial infections during early life.

Infection of neonatal mice with bioluminescent E. coli O1:K1:H7 results in a septic infection with significant pulmonary inflammation and lung pathology. Here, we describe procedures to model and further study neonatal sepsis using longitudinal intravital imaging in parallel with enumeration of systemic bacterial burdens, inflammatory profiling, and lung histopathology.

Un modello di imaging neonatale di sepsi batterica gram-negativa

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung injury (ALI)/acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other respiratory pathologies in vivo is difficult due to the limited accessibility and inherent motion artifacts of the lungs. Nonetheless, various approaches have been developed to overcome these challenges. This protocol describes a method for intravital fluorescence microscopy to study real-time leukocyte-endothelial interactions in the pulmonary microcirculation in an experimental model of ALI. An in vivo lung imaging system and 3-D printed intravital microscopy platform are used to secure the anesthetized mouse and stabilize the lung while minimizing confounding lung injury. Following preparation, widefield fluorescence microscopy is used to study leukocyte adhesion, leukocyte rolling, and capillary function. While the protocol presented here focuses on imaging in an acute model of inflammatory lung disease, it may also be adapted to study other pathological and physiological processes in the lung.

Intravital fluorescence microscopy can be utilized to study leukocyte-endothelial interactions and capillary perfusion in real-time. This protocol describes methods to image and quantify these parameters in the pulmonary microcirculation using a vacuum-stabilized lung imaging system.

Microscopia a fluorescenza intravitale a campo largo della microcircolazione polmonare polmonare polmonare acuta sperimentale utilizzando un sistema di imaging stabilizzato sotto vuoto

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...

Hyperpolarized 129Xe Lung MRI and Spectroscopy in Mechanically Ventilated Mice

Hyperpolarized (HP) xenon-129 (129Xe) is an inhaled magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent with unique spectral and physical properties that can be exploited to quantify pulmonary physiology, including ventilation, restricted diffusion (alveolar-airspace size), and gas exchange. In humans, it has been used to evaluate disease severity and progression in a variety of pulmonary disorders and is approved for clinical use in the United States and United Kingdom. Beyond its clinical applications, the ability of 129Xe MRI to noninvasively assess pulmonary pathophysiology and provide spatially resolved information is valuable for preclinical research. Among animal models, mice are the most widely used due to the accessibility of genetically modified disease models. Here, 129Xe MRI is promising as a minimally invasive, radiation-free, and sensitive technique to longitudinally monitor lung disease progression and therapy response (e.g., in drug discovery). This technique can extend to preclinical applications by incorporating an MRI-triggered, free-breathing apparatus or mechanical ventilator to deliver gas. Here, we describe the steps and provide checklists to ensure robust data collection and analysis, including creating a thermally polarized xenon gas phantom for quality control, optimizing polarization, animal handling (sedation, intubation, ventilation, and care for mice), and protocols for ventilation, restricted diffusion, and gas exchange data. While preclinical 129Xe MRI can be applied in various animal models (e.g., rats, pigs, sheep), this protocol focuses on mice due to the challenges posed by their small anatomy, which are balanced by their affordability and the availability of many disease models.

Hyperpolarized xenon MRI can quantify regional lung microstructure (air-space dimensions) and physiology (ventilation and gas exchange) in translational research and clinical care. Although challenging, it can provide comparable pulmonary insights in preclinical studies. This protocol describes the infrastructure and procedures needed to perform routine xenon lung MRI in mice.

Risonanza magnetica polmonare iperpolarizzata 129Xe e spettroscopia in topi ventilati meccanicamente

Hyperpolarized (HP) xenon-129 (129Xe) is an inhaled magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent with unique spectral and physical properties that can ...

Bioingegneria

<meta charset="utf8"></head><body>Conservazione della localizzazione delle spore fungine nei polmoni per l'analisi al microscopio a fluorescenza

Efficient Method for Imaging Murine Lungs that Preserves Spatial Dynamics of Fungal Spores in the Airways

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and bronchioles, branch until terminating in the alveolar airspace where gas exchange occurs. Infections originating in the bronchioles or alveoli elicit distinct host responses and disease manifestations. Therefore, understanding precisely where spores naturally localize in the lungs, particularly soon after infection, expands opportunities for investigation of host-pathogen interactions. Herein, we detail an in-situ analysis of lungs from mice infected with Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3&#916; arthroconidia. Conventional methods for histological preservation involve liquid inflation of the airways with a fixative solution, which displaces the natural location of aspirated fungal particles, pushing spores from proximal bronchioles to terminal airspaces.
Conversely, this method of air-inflation with blood vasculature perfusion-fixation preserves the physiologic position of fungal spores within the bronchioles. Moreover, we describe a simple approach to cryopreserving, embedding, and imaging lung specimens. We also share high-throughput computational techniques via the open-source QuPath program to analyze the spatial distribution of fungal spores within the lung. The method presented here is simple and quick, requires minimal equipment to perform, and can be easily adapted for use with many respiratory fungal infection models.

<meta charset="utf8"></head><body>Metodo efficiente per l'imaging dei polmoni murini che preserva la dinamica spaziale delle spore fungine nelle vie aeree

We present a method for a fungal pathogenesis model that preserves the natural positioning of fungal spores in the lung airways for analysis via fluorescent microscopy.

Metodo efficiente per l'imaging dei polmoni murini che preserva la dinamica spaziale delle spore fungine nelle vie aeree

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and ...

In tempo reale a raggi X Imaging del polmone volumi di fluido in neonatale topo polmone

Riepilogo

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Capitoli in questo video

A lungo termine ad alta risoluzione intravitale Microscopia nel polmone con un vuoto stabilizzato finestra Imaging

Rilevamento della progressione del tumore del polmone nei topi mediante Ultrasound Imaging

A seguito in tempo reale l'impatto dei fattori di virulenza pneumococco in un acuto mouse Polmonite modello tramite batteri bioluminescenti

Casting vascolare di polmoni di mouse postnatali adulti e precoci per l'imaging Micro-CT

Un Multimodal Imaging approccio basato su Micro-CT e fluorescenza molecolare tomografia per valutazione longitudinale della fibrosi polmonare indotta da bleomicina in topi

Un modello di imaging neonatale di sepsi batterica gram-negativa

Microscopia a fluorescenza intravitale a campo largo della microcircolazione polmonare polmonare polmonare acuta sperimentale utilizzando un sistema di imaging stabilizzato sotto vuoto

Risonanza magnetica polmonare iperpolarizzata ¹²⁹Xe e spettroscopia in topi ventilati meccanicamente

Metodo efficiente per l'imaging dei polmoni murini che preserva la dinamica spaziale delle spore fungine nelle vie aeree

Metodo efficiente per l'imaging dei polmoni murini che preserva la dinamica spaziale delle spore fungine nelle vie aeree