Esta investigación tiene como objetivo establecer un protocolo eficiente para preservar el contenido de las vías respiratorias de ratones en modelos de infección pulmonar. Estamos desarrollando la capacidad de responder a la pregunta de dónde terminan las esporas de hongos inhaladas en los pulmones. Recientemente, muchos grupos han identificado las funciones de varias células epiteliales de las vías respiratorias en la detección de infecciones y el inicio de respuestas inmunitarias protectoras.
Estas células epiteliales van desde células de club en los bronquios hasta células epiteliales de tipo II en los alvéolos terminales. La técnica común de preparación pulmonar consiste en inflar el pulmón con el fijador líquido para preservar el tejido pulmonar para los análisis histológicos posteriores. Sin embargo, esta técnica desplaza el contenido de las vías respiratorias, como las esporas de hongos inhaladas.
Nuestro protocolo preserva la ubicación natural de las esporas de hongos inhaladas en el pulmón mientras mantiene la morfología pulmonar adecuada a través del inflado de aire y la fijación pulmonar adecuada a través de la perfusión vascular. Esperamos utilizar este protocolo para caracterizar las uniones broncoalveolares donde las esporas parecen estar aterrizando en nuestro modelo, pero utilizaremos las ubicaciones de las esporas en las proximidades de varias células epiteliales y estudiaremos las respuestas inmunitarias resultantes. Para comenzar, tiñir una vez 10 a la potencia de seis esporas de Coccidioides posadasii con una concentración de cinco micromolares de CFSE durante 30 minutos a 30 grados centígrados.
Después de teñir, lave las esporas con PBS. Centrifugar las esporas a 12.000 g y resuspender el pellet en 25 microlitros de PBS para el inóculo de esporas a la concentración adecuada. Prepare una pipeta con 25 microlitros del inóculo de esporas.
Después de anestesiar al ratón en un frasco de Nalgene, coloque al ratón en posición supina con una mano y permita que respire de tres a cinco veces sin aliento regularmente. Coloque la punta de la pipeta en la parte posterior de la orofaringe del ratón y libere el inóculo durante la inhalación. Sienta crujidos en las caras posterior y anterior del tórax del ratón con la mano y el pulgar para confirmar la inhalación del inóculo.
Rocíe el ratón profundamente anestesiado con etanol al 70%. Con unas tijeras, corta con cuidado la piel del ratón y luego sepárala para exponer el peritoneo. Luego, tira de la piel de la mitad superior sobre la cabeza del ratón, liberando los brazos.
Ahora, corte la membrana peritoneal en el esternón y a lo largo de la cara inferior de la caja torácica, exponiendo el peritoneo. Desplaza el hígado hacia abajo para revelar el diafragma. Use tijeras para perforar cuidadosamente el diafragma lejos del parénquima pulmonar.
A continuación, corta la caja torácica del lado izquierdo para exponer el corazón. Con una aguja de calibre 30, inyecte de cinco a 10 mililitros de PBS en el ventrículo derecho. Después de retirar la aguja, use una aguja nueva para inyectar cinco mililitros de formalina tamponada neutra al 10% en el ventrículo derecho.
Con unas tijeras, retire la mitad anterior de la caja torácica. Para exponer la tráquea, corte las costillas superiores y las clavículas a la derecha y a la izquierda del cuello, evitando la línea media donde se encuentra la tráquea. Con pinzas, sujete las costillas superiores y las clavículas restantes cerca de la línea media del cuello y tire hacia arriba hasta que la tráquea quede expuesta.
Prepara un hilo de sutura de 10 centímetros y pásalo por debajo de la tráquea. Ata previamente un nudo suelto en el extremo inferior de la tráquea expuesta. Luego, prepare una jeringa de aire de un mililitro con un catéter de calibre 18.
Con una aguja de calibre 18, haga un agujero en la tráquea en el extremo superior de la región expuesta. Ahora, inserte el catéter en el orificio, asegurándose de un ajuste apretado para evitar que el aire se escape. Luego, inyecte lentamente un mililitro de aire en los pulmones durante 10 segundos, observando el inflado de todos los lóbulos pulmonares.
El inflado completo hace que los pulmones se envuelvan ligeramente alrededor del corazón y llenen el volumen ocupado en el diafragma no perforado. Después de aislar los pulmones del ratón, colóquelo en el borde superior de un tubo cónico de 50 mililitros lleno de 20 mililitros de formalina tamponada neutra al 10%. Coloque las roscas de sutura fuera del tubo, luego enrosque la tapa.
Para comenzar, enjuague los pulmones de ratón aislados en PBS y colóquelos en una solución de PBS al 30% de sacarosa durante 72 a 96 horas a cuatro grados Celsius. A continuación, retire el exceso de tejido y coloque los pulmones en un Cryomold con medio OCT. Congele la muestra a menos 80 grados centígrados.
Equilibre la muestra en criobloques OCT a menos 20 grados Celsius durante una hora antes de seccionar los bloques de 20 a 100 micrómetros de espesor. Recoja las secciones en un portaobjetos de vidrio y déjelas secar durante 30 minutos a una hora. Coloque el portaobjetos en un baño de PBS a temperatura ambiente durante 30 minutos para eliminar la OCT del pañuelo.
Luego, use una toallita para eliminar el exceso de gotas del perímetro del portaobjetos alrededor de la muestra de tejido. Dibuja un perímetro alrededor de la muestra en el portaobjetos con un bolígrafo PAP hidrofóbico y deja que se seque durante cinco minutos. A continuación, agregue 300 microlitros de solución de bloqueo sin animales recién preparada en el portaobjetos e incube a temperatura ambiente.
Ahora, incube el portaobjetos en 300 microlitros de solución primaria de anticuerpos EpCAM conjugados contra ratas Alexa Fluor 647 durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, retire la solución de anticuerpos y lave el portaobjetos dos veces con 300 microlitros de PBS durante cinco minutos. Después del secado, agregue una gota de medio de montaje de vidrio SlowFade a temperatura ambiente a cada pieza de pañuelo.
Coloque un cubreobjetos sobre el tejido, asegurándose de que se extienda más allá de la muestra y del perímetro del marcador hidrofóbico. Para comenzar, coloque la sección de pulmón de ratón inmunoteñida con esporas de hongos inoculada bajo un microscopio fluorescente multicanal y seleccione un objetivo apropiado. Para capturar todo el lóbulo pulmonar, recoja suficientes mosaicos de imágenes y combínelos.
Con el software del microscopio, exporte la imagen de todo el lóbulo pulmonar para su procesamiento posterior. En QuPath, cree un archivo de proyecto y agregue las imágenes fluorescentes al archivo. Clasifique los píxeles positivos para EpCAM como epitelio seleccionando secuencialmente Clasificar, Clasificación de píxeles y Crear umbral.
Seleccione la resolución, el canal, el sigma de suavizado y el valor de umbral para identificar la región de destino. Guarde el clasificador con un nombre único y seleccione Crear objetos. En la nueva ventana Crear objetos, seleccione Nuevo tipo de objeto como Anotación.
Para el epitelio pulmonar, establezca el tamaño mínimo del objeto y el tamaño mínimo del orificio en 100 micrómetros cuadrados. Después de seleccionar Aceptar, se crearán las anotaciones y se pueden modificar con la herramienta de pincel. Para clasificar las esporas, repita los pasos que se muestran para las anotaciones del epitelio pulmonar.
A continuación, en la ventana Crear objetos, seleccione Detección como nuevo tipo de objeto. Establezca el tamaño mínimo del objeto y el tamaño mínimo del agujero en cero micrómetros cuadrados y seleccione Dividir objetos. A continuación, para realizar un análisis espacial de las esporas de forma secuencial, seleccione Analizar, Análisis espacial y calcular la distancia con signo a las anotaciones bidimensionales.
Las distancias al epitelio EpCAM positivo se calcularán para cada espora detectada. Por último, haga clic en Medir, seguido de Exportar medidas para exportar los resultados. Las esporas de Coccidioides posadasii se acumularon principalmente en los bronquios distales y en los espacios alveolares cercanos en los pulmones inflados por aire.
Las esporas parecían más dispersas lejos de los bronquios en los pulmones formales e inflados con líquido en comparación con los pulmones inflados con aire. La distancia entre las esporas y el epitelio bronquiolar positivo para EpCAM fue mayor en los pulmones inflados con líquido en comparación con la inflación fisiológica del aire, lo que indica esporas más dispersas.
