Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones R01 HL109420 de WM y AHA 9320033N a LY.

Ratón del injerto y modelo de trasplante de injerto singénico Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y comités de uso de la Universidad de Yale. Para el modelo de aloinjerto, segmentos de aorta torácica de macho, 4-5 semanas de edad WT (C57BL/6J) o ratones IFN-γR-KO se interponen en la aorta abdominal de la hembra receptora, 8-12 semanas de edad WT utilizando un extremo a -end anastomosis microquirúrgica técnica (véase el siguiente para más detalles). Para el modelo de injerto singénico, los segmentos de la aorta torácica, 4-5 semanas de edad, los ratones WT macho se interponen en la aorta abdominal del macho, 8-12 semanas de edad IFN-γR1-KO con un extremo-a-extremo microquirúrgico técnica anastomótica. En 1 semana después de la cirugía, los animales fueron inoculados intravenosamente con Ad5.CMV-ratón IFN-γ o Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) a 1 x 10 9 PFU. Suero de ratón IFN-γ niveles se midieron por ELISA (eBioscience) a 1 y 5 semanas después de la administración de adenovirus. Algunos animales recibieron BrdU(Sigma-Aldrich) a 100 mg / kg sc durante 2 semanas antes del sacrificio. End-to-end anastomosis microquirúrgica técnica (Video se tomará para esta parte): 1. Procedimiento de Donantes <ol><li> Anestesiar a los ratones donantes con inyecciones intraperitoneales de ketamina (50 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). </li><li> Después de asegurarse de anestesia adecuada, colocar los ratones donantes bajo el microscopio de operación en X8-30 magnificación en una bandeja en una posición supina, y el uso de yodo cojín de la preparación y alcohol cojín de la preparación para la preparación de la pared torácica. </li><li> Una incisión en la pared anterior del tórax a través de las costillas y el diafragma para exponer el corazón. </li><li> Abra la aurícula derecha, inyectar 10 ml de heparina (100 U / ml) de solución salina en el ventrículo izquierdo para eliminar los ratones usando una jeringa de 10 ml con una aguja de calibre 25. </li><li> Resecar el corazón y los pulmones para exponer toda la longitud de la aorta torácica. </li><li> Disección de la aorta torácica con cuidado para minimizar el trauma directo, while identificar, ligar y dividir las ramas de madera con 11-0 sutura cerca de la aorta. </li><li> Una vez que la aorta torácica está libre de tejido circundante, especiales toda la aorta torácica para el trasplante. </li><li> Enjuague el extremo cortado de la aorta de donantes con heparinizada (100 U / ml) solución salina, y almacenarla en la misma solución en hielo (hasta 6 horas) hasta el trasplante. </li></ol> 2. Procedimiento destinatario <ol><li> Inyectar los ratones receptores con ketoprofeno IP (5 mg / kg) para la analgesia, y thenanesthetize los ratones con ketamina IP (50 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). Los ratones receptores se anestesiaron profundamente dentro de los 10 minutos por una duración de 60 a 90 min. Durante la cirugía, el nivel de anestesia se evalúa cada 15 min por pellizcar la pared abdominal anterior o el pie usando fórceps. Si el animal reacciona a los estímulos nocivos en cualquier momento durante la cirugía, una dosis adicional de ketamina y xilazina (1/4 o 1/3 de la dosis inicial) será administrado por sc o im </li><li> Después de asegurarse de anestesia adecuada, rapó el pelo en la pared abdominal anterior con una máquina de afeitar eléctrica, limpie la piel con yodo Prep Pad y Alcohol Prep Pad, cubra los ojos con ungüento oftálmico. Durante la cirugía, las siguientes técnicas asépticas se utilizarán para las operaciones, incluyendo la limpieza de la mesa de operaciones con 10% de lejía, el uso de guantes estériles y el uso de instrumentos de microcirugía esterilizados (instrumentos de vapor-esterilizados para el inicio de la operación, a continuación, de vidrio caliente del grano-esterilizada instrumentos entre múltiples operaciones, etc.) </li><li> Coloque los ratones receptores bajo el microscopio de operación con un aumento de X8-30 en una bandeja en una posición supina. </li><li> Una incisión en la pared abdominal en la línea media de xifoides hasta el pubis, y la propagación de la pared abdominal, aparte utilizando un micro-retractor para exponer la cavidad abdominal. </li><li> Retirar el intestino superior y envolver con una gasa humedecida con solución salina. Los ratones receptores se congelan por la pérdida de la Ley de Educación Superiort externalizados a través de los intestinos. Es importante mantener el calor animal. Sin embargo, la placa de calefacción no se utiliza durante la cirugía como modesta hipotermia es de beneficio en la prevención de lesión de la médula durante la oclusión del flujo sanguíneo aórtico, así como no hay transferencia de calor ineficiente con el flujo sanguíneo ausente a la mitad inferior del cuerpo de los ratones. </li><li> Mueva los órganos reproductivos inferiormente, envuelva las áreas del abdomen de ratones receptores con una gasa con solución salina solución humedecido, y lo utilizan para retraer el recto hacia el lado derecho del abdomen. Los tejidos expuestos se riegan periódicamente con una solución salina durante el trasplante. </li><li> Diseccionar sin rodeos un segmento de la aorta infrarrenal entre el vaso renal proximal y distalmente bifurcación aórtica y separarse de la vena cava inferior (IVC) cuidadosamente. </li><li> Identificar y ligar todas las ramas pequeñas provenientes de este segmento de la aorta abdominal con sutura monofilamento de poliamida 11-0. </li><li> Pinzamiento del segmento aislado de unaaorta bdominal utilizando dos pinzas vasculares aproximadamente 5 mm aparte, uno en cada extremo. </li><li> Corte transversal de la aorta abdominal entre las pinzas afiladas utilizando micro-tijeras para crear los sitios de anastomosis. </li><li> Resecar un pequeño segmento de la aorta abdominal (hasta 0,4 mm de longitud) de un extremo de corte seccionado la aorta receptor para alojar el injerto aórtico donante. </li><li> Lave los segmentos de aorta entre las abrazaderas con solución salina heparinizada para eliminar la sangre residual. Los segmentos aórticos entre las abrazaderas y el donante de injerto aórtico se riegan periódicamente con heparinizada (100 U / ml) solución salina (hasta 40 ml / kg) durante la anastomosis. </li><li> Corte transversal de ambos lados de la aorta de donantes con micro-tijeras afiladas para crear un injerto de segmento de 2,5 mm de longitud para el trasplante. </li><li> Coloque el injerto aórtico donante en la posición ortotópica, anastomosis extremo proximal y distal del injerto del donante a la proximal y distal extremo cortado del destinatario de la aorta abdominal, respectivamente, con un extremo-tpatrón o de fondo utilizando 11-0 poliamida monofilamento de sutura. </li><li> Para las suturas continuas, coloque las suturas a los 3 y nueve posiciones en primer lugar. Entre dos suturas de sujeción a cada lado del injerto, se anastomosan ambos bordes de corte en 3-4 puntos de sutura usando las suturas continuas, y atan las suturas continuas para pasar suturas con un nudo doble. Dado que ambas capas de cierre son continuas, el riesgo de dehiscencia se incrementa. El injerto aórtico de donantes debe ser de longitud adecuada para conectar proximal y distal extremo cortado del destinatario de la aorta abdominal. </li><li> Para las suturas interrumpidas, la construcción de cuatro anastomosis en 3 y nueve posiciones en ambos lados del injerto en primer lugar, y anastomosis de ambos bordes de corte en 3-4 puntos de sutura entre dos suturas de sujeción a cada lado del injerto. </li><li> Suelte la pinza distal para permitir que el flujo retrógrado en injerto, identificar los sitios de sangrado y hacer puntos adicionales a los 3 minutos. </li><li> Después de comprobar la hemostasia satisfactoria, suelte la pinza proximal. </li><li> Confirmar la permeabilidad del injerto por la presencia de la pulsación vigorosa en el injerto y el segmento adyacente proximal de la aorta abdominal nativa, en particular en el segmento adyacente distal de la aorta abdominal y la arteria mesentérica inferior. Considere la posibilidad de trombosis en sitios anastomóticas si la pulsación disminuye en unos pocos minutos después de la restauración del flujo sanguíneo. </li><li> Volver los intestinos en la cavidad abdominal. </li><li> Sutura cerrar la pared abdominal con sutura de nylon 5-0 en la capa muscular y la capa de la piel, respectivamente. </li><li> Coloque los ratones receptores en una jaula limpia en la parte superior de una almohadilla de calefacción, y esperar 1-2 horas para los ratones para recuperar la conciencia y recuperarse de la anestesia. Es importante mantener el calor animal adecuada durante la recuperación. Mantener los ratones en la jaula cálido y seco antes de estela animales de la anestesia. </li><li> Evaluación de la función motora de las extremidades posteriores después de la recuperación ratones, y de nuevo en el segundo día. Será confirmado una cirugía de trasplante con éxito if sin disfunción de las extremidades posteriores se observó en ratones receptores en el segundo día. </li><li> Administrar los ratones receptores con ketoprofeno en el agua potable (5 mg / kg / d = 27 ug / ml en el agua potable) durante 48 horas. Si cualquier ratones receptores sufren de dolor no se alivia con los analgésicos postoperatorios como se evidencia por la pérdida de la movilidad, la ausencia de limpieza, agrupado postura anormal, etc, se practicó la eutanasia. Los animales se sacrificaron a los predefinidos puntos finales después de 1-60 días. </li></ol> Análisis del injerto Injertos de arteria de aloinjerto se adquirieron a las 4 semanas y de los injertos en el modelo de injerto singénico eran 6 semanas después de la operación (5 semanas después de la infección viral) y se analizaron mediante técnicas histológicas estándar para Gieson (EVG) tinción Elastica-furgoneta, hematoxilina y eosina (HE) tinción y la tinción de inmunofluorescencia. Las fotografías fueron tomadas con un sistema de microscopio de inmunofluorescencia (Zeiss). Recuento de células de núcleos rodeados por inmunotinción positiva era realizared con gran aumento y un promedio de 5 secciones para cada injerto. Las mediciones de área de injerto de la luz (en el endotelio), íntima (entre el endotelio y la lámina elástica interna, IEL), los medios de comunicación (entre el IEL y la lámina elástica externa, EEL), espesor de la pared (entre el endotelio y la lámina elástica externa) y el recipiente entero (dentro de la EEL) se calcula a partir de 5 secciones transversales de serie, 150 micras de distancia para cada injerto, utilizando el análisis de imagen asistido por ordenador y NIH Image 1.60 ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/nih-image/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/nih-image</a> ). El análisis estadístico Todos los datos se expresan como media ± SEM. Dos colas, pares de pruebas t y un análisis de dos vías ANOVA se realizaron con el programa de software Prism (GraphPad Software). Las diferencias con p &lt;0,05 fueron considerados estadísticamente significativos.

<ol>
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S., Tellides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+plays+a+nonredundant+role+in+mediating+T+cell-dependent+outward+vascular+remodeling+of+allogeneic+human+coronary+arteries.">Interferon-gamma plays a nonredundant role in mediating T cell-dependent outward vascular remodeling of allogeneic human coronary arteries.</a> Faseb J. 18, 606-608 (2004).</li><li>Yacoub-Youssef, H., Marcheix, B., Calise, D., Thiers, J. C., Benoist, H., Blaes, N., Segui, B., Dambrin, C., Thomsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+vascular+rejection:+histologic+comparison+between+two+murine+experimental+models.">Chronic vascular rejection: histologic comparison between two murine experimental models.</a> Transplant. Proc. 37, 2886-2887 (2005).</li><li>Yokota, T., Shimokado, K., Kosaka, C., Sasaguri, T., Masuda, J., Ogata, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogenic+activity+of+interferon+gamma+on+growth-arrested+human+vascular+smooth+muscle+cells.">Mitogenic activity of interferon gamma on growth-arrested human vascular smooth muscle cells.</a> Arterioscler. Thromb. 12, 1393-1401 (1992).</li><li>Yu, L., Qin, L., Zhang, H., He, Y., Chen, H., Pober, J., Tellides, G., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AIP1+prevents+graft+arteriosclerosis+by+inhibiting+IFN-&#947;-dependent+smooth+muscle+cell+proliferation+and+intimal+expansion.">AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting IFN-&#947;-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion.</a> Cir. Res. 109, 418-427 (2011).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Los protocolos descritos se centran en modelos de ratón GA. Los procedimientos se pueden aplicar a otros modelos de trasplante de injerto. Estos modelos incluyen xenoinjertos humanizado (es decir, los segmentos de las arterias coronarias humanas interponen a la aorta infra-renal de ratones inmunodeficientes), y el modelo GA mouse rechazo agudo (es decir, una aorta del ratón de una cepa genética en otro destinatario línea genética). Nuestros modelos de ratón descritos son más para cerrar lesiones...

Arteriosclerois injertados (GA), también llamados vasculopatía del injerto, es una lesión patológica que se desarrolla durante meses a años en los órganos trasplantados se caracterizan por la estenosis difusa, circunferencial de todo el árbol vascular del injerto 7. Las etapas iniciales pueden causar estenosis excéntricas y focal que son más evidentes en las arterias, por lo tanto se asemeja más estrechamente estenosis visto en la aterosclerosis convencional. La pérdida de lumen de los vasos de injerto resultados de la expansión la íntima debido a la infiltración de células T del huésped y de los macrófagos y, especialmente, a la acumulación de matriz extracelular y de músculo liso como las células se originó a partir del injerto, principal o con ambos 5, 13, 19, que se compensa adecuadamente por el remodelado vascular hacia el exterior. En aloinjertos cardíacos, las lesiones clínicamente más significativos son los de las arterias coronarias epicárdicas y intramiocárdica. En última instancia, GA de las arterias coronarias se causar insuficiencia cardíaca isquémica. GA es la causa principal de la tarde gr cardiacapérdida de popa. Las estenosis de GA se detienen en las líneas de sutura, lo que implica fuertemente la respuesta del huésped a aloantígenos injerto en su patogenia y que nos lleva a clasificar GA como una forma de rechazo crónico 3. Sin embargo, otras formas de lesión arterial pueden aumentar el riesgo de GA, ya sea mediante el aumento de la carga neta de la lesión o mediante la intensificación y / o modulación de la respuesta aloinmune. La célula (CE) revestimiento endotelial de las arterias del injerto se conserva en GA humana y las regiones más superficiales de la íntima adyacente al forro de CE es el sitio más fuertemente infiltrado por el anfitrión derivado de IFN-γ-la producción de células T y macrófagos 11; en algunos pacientes GA se asocia con el desarrollo de aloanticuerpos donante-específicos que se unen a injerto CE 16 pero los vasos muestran poca evidencia de la necrosis fibrinoide que es característica de rechazo agudo mediado por anticuerpos 11. El componente más crítico de GA patogénesis es laproliferación de células de músculo liso, como en la íntima, y ​​si este proceso puede ser detenido, GA es poco probable que el progreso. Trabajos previos de nuestro grupo ha demostrado que intimas de segmentos de la arteria coronaria humana interpuestos en las aortas infra-renal de ratones inmunodeficientes se expanden en respuesta a transferidas adoptivamente células T humanas alogénicas para el donante arteria y que este proceso podría ser inhibida mediante la neutralización de IFN- γ 18. Además exógena de IFN-γ humano podría causar la íntima (y medial) la proliferación de células del músculo liso (VSMC) vascular en estos injertos arteriales en la ausencia de células T humanas 15, 17. (Es importante tener en cuenta que el ser humano y el ratón IFN-γ no se cruzan las especies, descartando los efectos indirectos en el host del ratón en este sistema experimental.) Estos modelos de ratón humanizado tienen el beneficio de recapitular humana de células T / interacciones de las células vasculares y la íntima Las lesiones se componen en gran parte de las células humanas (es decir injerto derivado),como se ha observado en muestras clínicas, pero no completamente recapitular la situación clínica porque ignoran el papel de los macrófagos de acogida y posiblemente otros tipos de células que intervienen en las lesiones de trasplantes clínicos. Un modelo de ratón convencional de este proceso podría teóricamente frente a este problema, como complemento de las limitaciones del modelo humanizado mediante la participación de un sistema inmune del huésped completa y proporcionar la ventaja adicional de permitir que el poder de enfoques genéticos de ratón para ser aplicado a GA. Los dos modelos de ratón más utilizados incluyen el trasplante heterotópico de corazón y la arteria trasplante ortotópico 1. Las lesiones que se desarrollan en las arterias de los injertos de corazón heterotópico están mayoritariamente compuestas de células huésped, probablemente de origen de médula ósea, mientras que las células de la íntima de las arterias en los injertos de corazón humano son en su mayoría de origen injerto de 5, 13, 19. Esta es una distinción importante que ha llevado a desarrollar modelos alternativos de ratón. Interposición deuna aorta de ratón a partir de una cepa a otra cepa de ratón receptor es aún más limitado como un modelo para el rechazo crónico en los seres humanos debido a la respuesta de rechazo mediado por células aguda en este modelo de ratón elimina por completo todas las células vasculares derivadas del donante del injerto dentro de dos-tres semana 19. En consecuencia, los cambios subsiguientes visto en el segmento de vaso interpuesta son únicamente una respuesta de las células huésped que han repobladas la descelularizado recipiente de andamio, la creación de una situación altamente artefactual de importancia limitada como un modelo para los cambios en los vasos de injerto que se producen en la clínica. Hemos desarrollado recientemente dos nuevos modelos de ratón para eludir estos problemas 21. El primer modelo consiste en la interposición de un segmento de vaso de un ratón macho en una hembra receptora de la misma cepa endogámica (C57BL/6J). El segundo modelo consiste en la interposición de un segmento de la arteria de un tipo salvaje C57BL/6J donante ratón en un ratón de acogida de la misma cepa y género que carece de la receptor de IFN-γ (IFN-γR-KO), seguido por la administración de IFN-γ de ratón (se entrega a través de la infección del hígado de ratón con un vector adenoviral. A continuación, describimos protocolos detallados y las ventajas de nuestros modelos GA ratón.

<table border="1" >
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C57BL/6J (H-2b)</td>
 <td>Jackson Laboratories 
 (Bar Harbor, ME)</td>
 <td>000664</td>
 <td>Donor (5 weeks) 
 Recipient (8-12weeks)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ketamine Hydrochloride Injection </td>
 <td>Hospira Inc.</td>
 <td>NDC 0409-2053</td>
 <td>Storage Solution(50 mg/ml) 
 Working Solution(5 mg/ml)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Xylazine Sterile Solution</td>
 <td>Lloyd Inc.</td>
 <td>NADA# 139-236</td>
 <td>Storage Solution(100 mg/ml) 
 Working Solution(1 mg/ml)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ketoprofen</td>
 <td>Fort Dodge Animal Health</td>
 <td>NDC 0856-4396-01</td>
 <td>Storage Solution(100 mg/ml) 
 Working Solution-oral 
 (0.027 mg/ml)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heparin Sodium</td>
 <td>Sagent Pharmaceticals</td>
 <td>NDC 25021-400</td>
 <td>Storage Solution(1000 U/ml) 
 Working Solution(100 U/ml)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride)</td>
 <td>CareFusion</td>
 <td>AL4109</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.9% Sodium Chloride Injection</td>
 <td>Hospira Inc.</td>
 <td>NDC 0409-4888-10</td>
 <td>To prepare the anesthetic </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petrolatum Ophthalmic Ointment </td>
 <td>Dechra Veterinary Products</td>
 <td>NDC 17033-211-38</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodine Prep Pads </td>
 <td>Triad Disposables, Inc.</td>
 <td>NDC 50730-3201-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alcohol Prep Pads</td>
 <td>McKesson Corp.</td>
 <td>NDC 68599-5805-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>MZ95</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Scissors</td>
 <td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
 <td>RS-5693</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spring Scissors</td>
 <td>F.S.T</td>
 <td>15009-08</td>
 <td>To transect the aorta of donor or recipient </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Extra Narrow Scissors</td>
 <td>F.S.T</td>
 <td>14088-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle Holder/Forceps</td>
 <td>MICRINS</td>
 <td>MI1542</td>
 <td>To hold the needle</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine Forceps</td>
 <td>F.S.T </td>
 <td>11254-20</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forceps</td>
 <td>F.S.T</td>
 <td>11251-35</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Standard Pattern Forceps</td>
 <td>F.S.T</td>
 <td>11000-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forceps</td>
 <td>F.S.T </td>
 <td>13011-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LANCASTER Eye Speculum</td>
 <td>Zepf Medical Instruments</td>
 <td>42-1209-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Vascular Clip</td>
 <td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
 <td>RS-6472</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Clip Applying Forceps With Lock</td>
 <td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
 <td>RS-5440</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Black Polyamide Monofilament Suture</td>
 <td>AROSurgical Instruments Corporation</td>
 <td>Cat #T4A10Q07</td>
 <td>10-0 suture, Needle=70 microns</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Black Monofilament Nylon Suture</td>
 <td>Syneture 
 (Covidien)</td>
 <td>SN-1956</td>
 <td>6-0 suture</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Non-Woven Songes</td>
 <td>McKesson Corp.</td>
 <td>Reorder No. 94442000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml Syringe</td>
 <td>BD</td>
 <td>REF 309659</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3 ml Syringe</td>
 <td>BD</td>
 <td>REF 309657</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml Syringe</td>
 <td>BD</td>
 <td>REF 309604</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18G 1 1/2, 
 Hypodermic Needle</td>
 <td>BD</td>
 <td>REF 305196</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25G 7/8, 
 Hypodermic Needle</td>
 <td>BD</td>
 <td>REF 305124</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>27G 1/2, 
 Hypodermic Needle</td>
 <td>BD</td>
 <td>REF 305109</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>30G 1/2, 
 Hypodermic Needle</td>
 <td>BD</td>
 <td>REF 305106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hearting Pad</td>
 <td>Sunbeam</td>
 <td>Z-1228-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trimmer</td>
 <td>Wahl</td>
 <td>9854-500</td>
 <td></td>
 </tr>
<tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 2. Specific reagents and equipment.</td>
</tr>
 </tbody>
</table>

mouse models for graft arteriosclerosis

Arteriosclerois injertados (GA), también llamados vasculopatía del injerto, es una lesión patológica que se desarrolla durante meses a años en los órganos trasplantados se caracterizan por la estenosis difusa, circunferencial de todo el árbol vascular del injerto. El componente más crítico de GA patogénesis es la proliferación de células de músculo liso como dentro de la íntima. Cuando un segmento de la arteria coronaria humana se interpone en la aorta infra-renal de ratones inmunodeficientes, las intimas podrían expandirse en respuesta a las células T humanas transferidas adoptivamente alogénico para el donante arteria o exógeno humano IFN-γ en ausencia de células T humanas. La interposición de una aorta de ratón a partir de una cepa a otra cepa de ratón receptor se limita como un modelo para el rechazo crónico en los seres humanos debido a la respuesta de rechazo celular agudo mediado en este modelo de ratón elimina por completo todas las células vasculares derivadas del donante del injerto dentro de dos-tres semana. Recientemente hemos desarrollado dos nuevos mOuse modelos para evitar estos problemas. El primer modelo consiste en la interposición de un segmento de vaso de un ratón macho en una hembra receptora de la misma cepa endogámica (C57BL/6J). El rechazo del injerto en este caso sólo se dirige contra antígenos menores de histocompatibilidad codificado por el cromosoma Y (presente en el macho, pero no la hembra) y la respuesta de rechazo que se produce es suficientemente indolente para conservar las células musculares lisas derivadas del donante durante varias semanas. El segundo modelo consiste en la interposición de un segmento de la arteria de un tipo salvaje C57BL/6J donante ratón en un ratón de acogida de la misma cepa y género que carece del receptor de IFN-γ seguido de la administración de ratón IFN-γ (entregado a través de la infección de ratón hígado con un vector adenoviral. No hay rechazo en este caso como donante y ratones receptores son de la misma cepa y género pero las células del músculo liso donantes proliferan en respuesta a la citoquina mientras que las células derivadas del huésped, que carecen del receptor deesta citocina, no responden. Por retrocruzamiento de cambios genéticos adicionales en el recipiente de donante, ambos modelos pueden ser utilizados para evaluar el efecto de los genes específicos en la progresión de GA. A continuación, se describen los protocolos detallados para nuestros modelos GA ratón.

Ratón modelo de aloinjerto de la arteriosclerosis (GA): En este modelo, una aorta macho donante se trasplanta en hembra receptora para que el host induce respuestas T alorreactivas aloinmunes mediadas por células contra un antígeno Y menor (el menor de histocompatibilidad HY antígeno específica de los machos) expresado en el injerto 12, y a su vez de las células T produce IFN-γ-unidades de la proliferación de VSMC 20 como se observa en otros modelos de trasplante de aloinje...

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Mouse Models for Graft Arteriosclerosis

Se describen protocolos para nuestros arteriosclerois de injerto de ratón (GA) modelos que implican la interposición de un segmento de vaso del ratón en un receptor de la misma cepa endogámica. Por retrocruzamiento de cambios genéticos adicionales en el recipiente de donante, el modelo se puede evaluar el efecto de los genes específicos en GA.

Modelos de ratón para Arteriosclerosis Graft

Graft arteriosclerois (GA),  also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over  months to years in transplanted organs ...

Research

JoVE Journal

Medicine

13.6K vistas.  Yale University School of Medicine. Se describen protocolos para nuestros arteriosclerois de injerto de ratón (GA) modelos que implican la interposición de un segmento de vaso del ratón en un receptor de la misma cepa endogámica. Por retrocruzamiento de cambios genéticos adicionales en el recipiente de donante, el modelo se puede evaluar el efecto de los genes específicos en GA.

Video: Mouse Models for Graft Arteriosclerosis

MRI and PET in Mouse Models of Myocardial Infarction

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ideal model for testing novel therapeutic strategies.
In vivo magnetic resonance imaging (MRI) gives excellent views of the heart noninvasively with clear anatomical detail, which can be used for accurate functional assessment. Contrast agents can provide basic measures of tissue viability but these are nonspecific. Positron emission tomography (PET) is a complementary technique that is highly specific for molecular imaging, but lacks the anatomical detail of MRI. Used together, these techniques offer a sensitive, specific and quantitative tool for the assessment of the heart in disease and recovery following treatment.
In this paper we explain how these methods are carried out in mouse models of acute myocardial infarction. The procedures described here were designed for the assessment of putative protective drug treatments. We used MRI to measure systolic function and infarct size with late gadolinium enhancement, and PET with fluorodeoxyglucose (FDG) to assess metabolic function in the infarcted region. The paper focuses on practical aspects such as slice planning, accurate gating, drug delivery, segmentation of images, and multimodal coregistration. The methods presented here achieve good repeatability and accuracy maintaining a high throughput.

We describe how to perform MRI and PET imaging of the mouse heart. The protocol is tailored to assess treatment efficacy in models of myocardial infarction and heart failure.

Resonancia magnética y PET en modelos de ratón de infarto de miocardio

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ...

Investigación

Medicina

Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins (HDL). It has been recognized that high levels of plasma ApoCIII constitutea risk factor for cardiovascular diseases (CVD). Elevated plasma ApoCIII level often correlates with insulin resistance, obesity, and hypertriglyceridemia. Invaluable knowledge on the roles of ApoCIIIin lipid metabolisms and CVD has been obtained from transgenic mouse models including ApoCIII knockout (KO) mice; however, it is noted that the metabolism of lipoprotein in mice is different from that of humans in many aspects. It is not known until now whether elevated plasma ApoCIII is directly atherogenic. We worked to develop ApoCIII KO rabbits in the present study based on the hypothesis that rabbits can serve as a reasonablemodelfor studying human lipid metabolism and atherosclerosis. Zinc finger nuclease (ZFN) sets targeting rabbit ApoCIIIgene were subjected to in vitro validation prior to embryo microinjection. The mRNA was injected to the cytoplasm of 35 rabbit pronuclear stage embryos, and evaluated the mutation rates at the blastocyst state. Of sixteen blastocysts that were assayed, a satisfactory 50% mutation rate (8/16) at the targeting site was achieved, supporting the use of Set 1 for in vivo experiments. Next, we microinjected 145 embryos with Set 1 mRNA, and transferred these embryos to 7 recipient rabbits. After 30 days gestation, 21 kits were born, out of which five were confirmed as ApoCIII KO rabbits after PCR sequencing assays. The KO animal rate (#KO kits/total born) was 23.8%. The overall production efficiency is 3.4% (5 kits/145 embryos transferred). The present work demonstrated that ZFN is a highly efficient method to produce KO rabbits. These ApoCIII KO rabbits are novel resources to study the roles of ApoCIII in lipid metabolisms.

Recent development in gene targeting tools makes production of knockout (KO) rabbits possible. In the present work, we generated five Apolipoprotein (Apo) C-III KO rabbits using Zinc Finger Nucleases (ZFN). This work demonstrated that ZFN is a highly efficient method to produce KO rabbits.

La producción de la apolipoproteína C-III Conejos Knockout utilizando nucleasas de dedos de zinc

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins ...

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. The long-term clinical results showed excellent patency rates, however, with significant incidence of stenosis. To investigate the cellular and molecular mechanisms of vascular neotissue formation and prevent stenosis development in tissue engineered vascular grafts (TEVGs), we developed a mouse model of the graft with approximately 1 mm internal diameter. First, the TEVGs were assembled from biodegradable tubular scaffolds fabricated from a polyglycolic acid nonwoven felt mesh coated with &#949;-caprolactone and L-lactide copolymer. The scaffolds were then placed in a lyophilizer, vacuumed for 24 hr, and stored in a desiccator until cell seeding. Second, bone marrow was collected from donor mice and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation. Third, approximately one million cells were seeded on a scaffold and incubated O/N. Finally, the seeded scaffolds were then implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. The implanted grafts demonstrated excellent patency (&#62;90%) without evidence of thromboembolic complications or aneurysmal formation. This murine model will aid us in understanding and quantifying the cellular and molecular mechanisms of neotissue formation in the TEVG.

To improve our knowledge of cellular and molecular neotissue formation, a murine model of the TEVG was recently developed. The grafts were implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. This model achieves similar results to those achieved in our clinical investigation, but over a far shortened time-course.

Implantación de la vena cava inferior interposición del injerto en modelo de ratón

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

Ratón Trasplante de Riñón: Modelos de rechazo del aloinjerto

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

Alta frecuencia de imágenes por ultrasonido del mouse ganglios linfáticos cervicales

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune system of the recipient causes damage of the arterial wall and dysfunction of endothelial cells and smooth muscle cells. This triggers a pathological repair response that is characterized by intimal thickening and luminal occlusion. Understanding the mechanisms by which the immune system causes vasculature rejection and TA may inform the development of novel ways to manage graft failure. Here, we describe a mouse aortic interposition model that can be used to study the pathogenic mechanisms of vascular rejection and TA. The model involves grafting of an aortic segment from a donor animal into an allogeneic recipient. Rejection of the artery segment involves alloimmune reactions and results in arterial changes that resemble vascular rejection. The basic technical approach we describe can be used with different mouse strains and targeted interventions to answer specific questions related to vascular rejection and TA.

We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure.

Modelo de ratón de rechazo vascular inducida por aloinmune y Arteriosclerosis Trasplante

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount &#946;-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

La denervación quirúrgica cutánea: Un método para probar el requisito de nervios en el ratón modelos de enfermedad de la piel

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

La interposición de la vena del modelo: un modelo adecuado para estudiar la permeabilidad del injerto de bypass

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated with an increased survival rate and greater quality of patient&#8217;s life when compared to conventional dialysis. Regrettably, transplantology suffers from a lack of reliable methods for organ quality assessment. Standard diagnostic techniques are limited to macroscopic appearance inspection or invasive tissue biopsy, which do not provide comprehensive information about the graft. The proposed protocol aims to introduce solid phase microextraction (SPME) as an ideal analytical method for comprehensive metabolomics and lipidomic analysis of all low molecular compounds present in kidneys allocated for transplantation. The small size of the SPME probe enables performance of a chemical biopsy, which enables extraction of metabolites directly from the organ without any tissue collection. The minimum invasiveness of the method permits execution of multiple analyses over time: directly after organ harvesting, during its preservation, and immediately after revascularization at the recipient&#8217;s body. It is hypothesized that the combination of this novel sampling method with a high-resolution mass spectrometer will allow for discrimination of a set of characteristic compounds that could serve as biological markers of graft quality and indicators of possible development of organ dysfunction.

The protocol presents utilization of the chemical biopsy approach followed by comprehensive metabolomic and lipidomic analysis for quality assessment of kidney grafts allocated for transplantation.

Uso de una biopsia química para la evaluación de la calidad del injerto

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...

Near Infrared Photoimmunotherapy for Mouse Models of Pleural Dissemination

The efficacy of photoimmunotherapy can be evaluated more accurately with an orthotopic mouse model than with a subcutaneous one. A pleural dissemination model can be used for the evaluation of treatment methods for intrathoracic diseases such as lung cancer or malignant pleural mesothelioma.
Near-infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) is a recently developed cancer treatment strategy that combines the specificity of tumor-targeting antibodies with toxicity caused by a photoabsorber (IR700Dye) after exposure to NIR light. The efficacy of NIR-PIT has been reported using various antibodies; however, only a few reports have shown the therapeutic effect of this strategy in an orthotopic model. In the present study, we demonstrate an example of efficacy evaluation of the pleural disseminated lung cancer model, which was treated using NIR-PIT.

Near-infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) is an emerging cancer therapeutic strategy that utilizes an antibody-photoabsorber (IR700Dye) conjugate and NIR light to destroy cancer cells. Here, we present a method to evaluate the antitumor effect of NIR-PIT in a mouse model of pleural disseminated lung cancer and malignant pleural mesothelioma using bioluminescence imaging.

Fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano para modelos de ratón de diseminación pleural

The efficacy of photoimmunotherapy can be evaluated more accurately with an orthotopic mouse model than with a subcutaneous one. A pleural dissemination ...