The authors acknowledge the Microscopy core facility at the Faculty of Health Sciences, Link&#246;ping University for providing access to advanced imaging systems; Karl-Eric Magnusson (Emeritus Scientist) at the Dept. of Clinical and Experimental Medicine, Link&#246;ping University for providing access to Imaris 3D/4D image processing software (Bitplane, Switzerland); and S. Braian for his help with the lung model cartoon. This work was supported by funds from the Swedish Research Council (Alternatives to animal research, 2012-1951) and Swedish Research Council (2012-3349) to M.L. and Swedish Foundation for Strategic Research to S.B. S.B. receive grants from the Karolinska Institutet, Swedish Research Council, the Swedish International Development Cooperation Agency (Sida) and the Swedish Civil Contingencies Agency (MSB), and the Swedish Heart and Lung Foundation (HLF). M.S. received grants from the Karolinska Institutet and Stockholm County Council.

<ol>
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The authors declare no competing financial interests.

The ability to recruit and form organized cell clusters at the site of infection is the hallmark of human TB 11. These dynamic structures known as tubercle granulomas primarily consist of immune cells (macrophages, monocytes, T-cells and B-cells) and multi-nucleated giant cells surrounding M. tuberculosis. The role of the granuloma has long been considered to wall off the infection, preventing local spread of bacteria. However, more recent studies show that granuloma formation is critical for early bacterial survival, growth and dissemination 12. A strategy of new studies is to identify molecules or pathways that could efficiently be targeted to inhibit the cellular migration in granuloma formation and/or TB dissemination. 
A caveat for novel studies on TB is the lack of models that recapitulate human TB. The most widely used experimental animals do not form true granuloma upon M. tuberculosis infection, and are therefore not appropriate choices for studies of TB 13-16. Non-human primates have the closest resemblance to human TB 17, but are not the preferred choice owing to high operational costs and ethical issues. Human TB is a complex immunological process and is difficult to model in vitro. Cell cultures of monolayers or co-cultures lack the 3D environment and tissue responses. Therefore, we have developed an innovative lung tissue model based on human primary immune cells and human lung-specific cell lines 8,9. The model displays characteristic features of human lung tissue, including epithelia with evenly integrated macrophages, formation of extracellular matrix, stratified epithelia and mucus secretion 9. 
The 3D human lung tissue model has several benefits over the in vitro single or co-cultures seeded on tissue culture plates or transwell inserts. First, the human lung-specific cells (fibroblasts and epithelial cells) are not commonly included in the in vitro single or co-cultures. Second, the immune cells and lung-specific cells are embedded in a 3D physiological context (collagen rich extra-cellular matrix products). The response of cells to a stimulus/infection and the migratory behaviour of cells, for instance formation of a granuloma, differ significantly between a 2D and 3D environment. Furthermore, the described method enables the 3D visualization and robust 3D quantitative analysis that provides pivotal information on spatial distribution and intricate cellular interactions. 
Experimental infection in the model tissue with M. tuberculosis resulted in clustering of macrophages at the site of infection, reminiscent of early TB granuloma (Figure 2 and 3). We have recently demonstrated that mutant strains defective in the ability to secrete the virulence factor ESAT-6 or Mycobacterium bovis BCG that lacks ESAT-6 did not induce the clustering of monocytes (no early granuloma), in contrast to the virulent M. tuberculosis 9. These data are consistent with the observations made from Mycobacterium marinum-infected zebrafish embryos, whose transparency allows for elegant live imaging of granuloma formation 12. As there is no gold-standard model for TB, we took advantage of the surgically resected tissue biopsies from TB patients for validation of the method 9. Our in vitro tissue model shares several characteristics with the lung and lymph node biopsies from TB patients, including the aggregation of macrophages in granuloma, the presence of both intra- and extracellular bacteria 18 and induction of necrosis 11. 
Although the described model has physiological relevance to human TB and has several advantages over other in vitro models, it has some limitations. For instance, out of more than 20 collagen proteins identified in humans, only type I is included to the model to mimic the extra-cellular matrix. However, type I collagen is a complex mixture of extra-cellular matrix products and is the most abundant collagen in the human body. Further, we have demonstrated the presence of collagen IV and several extra-cellular matrix proteins such as tropoelastin, vimentin and laminin, which are produced by the epithelial cells and fibroblasts in the tissue model, indicating the synthesis of new collagen 8. Presently, the lung tissue model only has monocytes and macrophages, besides lung-specific cells. It lacks neutrophils and lymphocytes that are also known to be present in the granuloma. Remarkably the model is not limited to the introduction of additional immune cells and is of interest to explore how they contribute to the complex cellular interactions in human TB. Implantation of primary alveolar macrophages, skin-specific cells and lung carcinoma cells has already been tested in the model. Since our objective was to use a model that closely resembles human TB, introduction of mouse cells have not been attempted.
In summary, the lung tissue model has implications for both basic mechanistic and applied studies. Potential applications of the lung model include the study of innate immunity, investigating mechanistic aspects of host defences such as phagosomal maturation, autophagy, production of cytokines, chemokines and anti-microbial peptides, and functional characterization of individual cell types. Strikingly, the in vitro tissue model allows manipulation of one or more cells types and provides a relevant tissue micro-environment, not only for studies on TB, but for a variety of infectious and non-infectious diseases that affect the lungs.

En los seres humanos, las respuestas a la infección, la inflamación del tejido, el reclutamiento celular, la remodelación tisular y la regulación de la homeostasis del tejido son eventos complejos que implican diferentes tipos de células. Por lo tanto, estos procesos son los más estudiados en el entorno del tejido local. Anteriormente, esto ha sido principalmente posible utilizando modelos animales experimentales. Sin embargo, los animales experimentales utilizados tienen muchos límites ya que a menudo responden a los patógenos de una manera diferente que los humanos y también muestran un curso diferente de la enfermedad 1. Un humano en el modelo de tejido pulmonar vitro tiene las posibilidades para estudiar las respuestas inmunes específicas en el pulmón humano. Infección de tuberculosis humana (TB) es una enfermedad que afecta principalmente a los pulmones. Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), el agente causante de la TB, alcanza el pulmón a través de gotitas de aerosol que son transportados al espacio alveolar, donde las bacterias son engullidas por dendri pulmonarcélulas de tics y macrófagos alveolares como parte de la respuesta inmune innata a la infección 2,3. La fagocitosis del patógeno conduce a la compartimentación del error dentro de un fagosoma e idealmente como resultado la neutralización y el asesinato del agente patógeno por el fagocito. Hasta 50% de los individuos expuestos a M. la tuberculosis se cree que son capaces de eliminar la infección a través de la respuesta inmune innata 4. Otros resultados de la infección son un despeje de la adaptación del sistema inmunológico en una etapa posterior, la infección latente o en el peor de los casos la enfermedad activa crónica 5. Anteriormente no se han presentado los modelos de tejidos in vitro para el estudio de la tuberculosis humana. Cultivos de células individuales de los macrófagos humanos u otras células de sangre periférica a menudo se han utilizado 6,7. La desventaja de este enfoque es que no pueden reflejar la dinámica de los diferentes tipos de células que operan juntos en un tejido pulmonar expuesto a M. tuberculosis </em&gt;. Por lo tanto, hay una necesidad de un modelo in vitro para ser capaz de realizar estudios funcionales y mecanicistas sobre la tuberculosis. El modelo en el tejido pulmonar humano in vitro descrito aquí basada en células fue establecida originalmente por nuestro grupo de estudios sobre las funciones celulares dendríticas 8. Hemos adaptado este método para el estudio de la tuberculosis. El modelo de tejido pulmonar humano que aquí se presenta se compone de células epiteliales y fibroblastos 8 específicos de tejido. Estas células se cultivan en una matriz de colágeno en la parte superior de una membrana porosa en un inserto de transwell y las estructuras de forma que se asemeje tejido pulmonar humano normal (Figura 1). Cuando se expone al aire las células comienzan a secretar moco en la parte apical 8. Mediante la implantación de los macrófagos primarios humanos infectados con M. tuberculosis al modelo, hemos observado cómo las células inmunes migran en el tejido y forman primeras etapas de granulomas TB 9. Este es el primer modelo de tejido descr humanaibed para la tuberculosis y plantea una herramienta prometedora para el estudio de la respuesta inmune innata a la tuberculosis y otras enfermedades del pulmón. Hasta la fecha, hemos utilizado sólo monocitos y macrófagos como células inmunes en el modelo, pero el nivel de complejidad se puede aumentar mediante la inclusión de tipos de células relevantes adicionales. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema Esquema del modelo de tejido pulmonar. (A) El modelo se compone de células epiteliales pulmonares-específica humanos, M. tuberculosis infectados con macrófagos primarios y tinte rojo monocitos marcados sembró en colágeno incrustado fibroblastos preparados en un filtro transwell. La exposición de la modelo de tejido al aire inicia la producción de proteínas de la matriz extra-celular, la secreción de moco y la estratificación por el epitelio. El modelo de tejido 3D así desarrollada es una herramienta útil para estudiar M. infección de tuberculosis en un entorno que closely se asemeja a un pulmón humano. (B) imágenes microscópicas representativas de los diferentes pasos en la preparación del modelo de tejido. (C) estructura completa de la sección de tejido modelo de pulmón. Escala -. 100 m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC-5 cells, lung fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATCC#CCL-171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16HBE cells, lung epithelial cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco, USA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 x Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (5 x DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-082</td>
			<td>Made from powder but add 5 times less water. Adjust pH to 7.3 and filter it using a 0.2 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium with glucose (DMEM) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM) 1x with Earle&#8217;s salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids Solution, 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3 (71.2 mg/ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Heat inactivated for 30 min, 56 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes buffer solution 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (Pen Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield</td>
			<td>7801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure 0.5 M EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Collagen PA treated (500 ml)</td>
			<td>Organogenesis</td>
			<td>200-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure col purified Bovine Collagen solution (100 ml)</td>
			<td>Advanced biomatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix protein, Fibronectin (1 mg)</td>
			<td>BD</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human monocytes/macrophages</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Isolated from human whole blood or buffy coats.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red fluorescent cell linker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MINI26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37Rv expressing green fluorescent protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M. tuberculosis H37Rv wild type was transformed with the pFPV2 plasmid constitutively expressing GFP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 medium&#160;</td>
			<td>Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook ADC Enrichment</td>
			<td>BBL</td>
			<td>211887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin B sulfate (20 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold anti=-fade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMaris Scientific 3D/4D image processing software, version 7.6.8</td>
			<td>Bitplane AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3d human lung tissue model for functional studies on mycobacterium tuberculosis infection

La tuberculosis (TB) sigue teniendo una gran amenaza para la salud de las personas en todo el mundo, y hay una necesidad de modelos rentables, pero fiables para ayudarnos a entender los mecanismos de la enfermedad y promover los descubrimientos de nuevas opciones de tratamiento. Cultivos celulares in vitro de las monocapas o co-cultivos carecen de la tridimensional medio ambiente (3D) y las respuestas de los tejidos. En este documento, se describe un innovador modelo in vitro de un tejido pulmonar humano, que promete ser una herramienta eficaz para el estudio de los complejos acontecimientos que ocurren durante la infección por Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). El modelo de tejido 3D consiste en células epiteliales y fibroblastos específicos de tejido, que son cultivadas en una matriz de colágeno en la parte superior de una membrana porosa. Tras la exposición de aire, las células epiteliales estratificar y secretar moco en la parte apical. Mediante la introducción de los macrófagos primarios humanos infectados con M. tuberculosis al modo de tejidol, hemos demostrado que las células inmunitarias migran al tejido infectado y forman primeras etapas de granuloma TB. Estas estructuras recapitulan la característica distintiva de la tuberculosis humana, el granuloma, que es fundamentalmente diferente o no se observa comúnmente en modelos animales experimentales utilizados. Este método de cultivo organotípico permite la visualización en 3D y el análisis cuantitativo robusto que proporciona información fundamental sobre las características espaciales y temporales de las interacciones célula-patógeno de acogida. En conjunto, el modelo de tejido pulmonar proporciona un tejido microambiente fisiológicamente relevante para los estudios sobre la tuberculosis. Por lo tanto, el modelo de tejido pulmonar tiene implicaciones potenciales para ambos estudios mecanicistas y aplicados básicos. Es importante destacar que el modelo permite la adición o manipulación de tipos de células individuales, que de este modo amplía su uso para modelar una variedad de enfermedades infecciosas que afectan a los pulmones.

Un modelo de tejido pulmonar 3D para la tuberculosis humana puede ser utilizado eficazmente para estudiar las interacciones huésped-patógeno en M. infección por tuberculosis. Los pasos básicos de este método, las imágenes microscópicas representativas de diferentes pasos y una estructura microscópica general de una sección de tejido se indica en la Figura 1. El modelo tiene varios componentes del tejido pulmonar humano, incluyendo fibroblastos de pulmón, células epiteliales bronquiales y monocitos primarios / macrófagos incrustado en el entorno del tejido 3D. Además de la incorporación de componentes de tejido de pulmón humano, el modelo se asemeja a condiciones fisiológicas a saber, la estratificación de los epitelios y la secreción de moco. Un ejemplo para el uso del modelo de tejido pulmonar en el seguimiento de una infección de TB se presenta en la Figura 2. Para visualizar la M. tuberculosis migración celular -immune e interacción, que introdujeron los macrófagos infectados con M. tuberculosis que expresan GFP(verde) junto con los monocitos PKH26 marcado recién aisladas (rojo) en el modelo de tejido (azul, manchado DAPI para los núcleos). En el día 7 después de la adición de M. tuberculosis células infectadas en el modelo de tejido, microscopía confocal revela la agrupación de los monocitos de color rojo en el sitio de infección (verde) (Figura 2), que imita las lesiones característicos de la TB humana 9. Una serie de imágenes representativas para la visualización 3D de M. tuberculosis infectados con modelo de tejido y la cuantificación de los grupos de células se muestra en la Figura 3. La visualización en 3D da la flexibilidad para el usuario para interactuar, examinar y cuantificar varias características en una imagen en 3D. La disposición espacial de las bacterias verdes y rojos racimos de monocitos se puede ver desde la vista apical, rotacional y lateral como se ilustra en la figura 3B, lo que revela la agrupación de los monocitos en el sitio de M. Los racimos de tuberculosis. no se observido en los tejidos no infectados (Figura 3A). Hemos cuantificado el tamaño y el número de grupos de células de monocitos y encontramos que el tamaño (volumen) de grupos de células se ha mejorado (p &lt;0,001), mientras que el número de monocitos individuales disminuyó (p &lt;0,01) en M. tuberculosis tejidos infectados en comparación con los modelos de tejido no infectadas (Figura 3C y 3D). Estos datos valida nuestra anterior conclusión de la formación de granulomas a principios de M. infección tuberculosa observa en los modelos de tejido pulmonar analizados en secciones de tejido 2D 9. Nuestros datos sugieren que el modelo de tejido proporciona un hábitat natural 3D para investigar el complejo de acogida por células M. red de comunicación tuberculosis. También se encontró que la visualización en 3D y el análisis cuantitativo son mejores herramientas para el estudio de las características del modelo de tejido (Figura 3). La cuantificación de un grupo de células (granuloma por ejemplo) a menudo stretch<html> hes a varias capas de células y pueden ser capturados por completo por un análisis cuantitativo 3D. Además, la visualización de las características espaciales y temporales exactas de las células individuales o bacterias en el modelo permite estudios de imagen en vivo, de migración y de seguimiento en un laboratorio designado. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig2.jpg" /> Figura 2. monocitos en el clúster modelo tejido alrededor virulenta M. tuberculosis. confocal de imágenes representativas de los no infectados y M. se presenta la tuberculosis modelo de tejido infectado. Paneles de verde (M. tuberculosis- GFP), rojo (monocitos PKH26 marcado), azul (núcleos teñidos con DAPI) y canales fusionadas muestran el reclutamiento de monocitos en el tejido infectado en comparación con los tejidos infectados. Scale - 100 micras.large.jpg &quot;style =&quot; font-size: 14px; line-height: 28px; &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig3.jpg" /> Figura 3. Visualización 3D y el análisis cuantitativo de modelo de tejido proporcionan información útil. Imágenes representativas de visualización en 3D de todo el modelo de tejido (A) del tejido infectado, (B) infectados con M. tuberculosis, a través de seccionamiento óptico Zeiss LSM700 usando microscopio confocal y análisis cuantitativo por el software de procesamiento de imágenes Imaris (versión 7.6.8). Estas imágenes fueron adquiridas a 20X aumentos, 14 z-pilas que cubren un espesor de tejido de 19,5 m con 1,5 micras intervalo, permitiendo la visualización de la posición horizontal apical, de rotación, vista vertical y lateral de rotación (A y B). (C) Quaanálisis ntitative de grupos de células de monocitos revelan mejorada (p &lt;0,0001) tamaño de los clusters granuloma primeros después M. infección de tuberculosis cuando se compara con la ausencia de infección. (D) Cuantificación de número de monocitos mostró una disminución (p &lt;0,01) en el tejido infectado en comparación con el tejido no infectado, reiterando más grupos en el tejido infectado. Verde - M. GFP tuberculosis, Red - monocitos marcados PKH26, Azul - núcleos celulares, Escala -. 100 m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Un modelo de tejido 3D Pulmón humano de Estudios funcionales en<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infección

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

18.7K vistas.  Linköping University. Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.