The authors acknowledge the Microscopy core facility at the Faculty of Health Sciences, Link&#246;ping University for providing access to advanced imaging systems; Karl-Eric Magnusson (Emeritus Scientist) at the Dept. of Clinical and Experimental Medicine, Link&#246;ping University for providing access to Imaris 3D/4D image processing software (Bitplane, Switzerland); and S. Braian for his help with the lung model cartoon. This work was supported by funds from the Swedish Research Council (Alternatives to animal research, 2012-1951) and Swedish Research Council (2012-3349) to M.L. and Swedish Foundation for Strategic Research to S.B. S.B. receive grants from the Karolinska Institutet, Swedish Research Council, the Swedish International Development Cooperation Agency (Sida) and the Swedish Civil Contingencies Agency (MSB), and the Swedish Heart and Lung Foundation (HLF). M.S. received grants from the Karolinska Institutet and Stockholm County Council.

Not: Linköping Üniversitesi Hastanesi kan bankasından satın sağlıklı anonim kan vericilerden İnsan periferik kan, İsveç bu çalışma için bağışıklık hücrelerinin kaynağı olarak kullanıldı. Bu protokol, 24 mm 6-çukurlu plaka uçlar için tasarlanmıştır. Diğer iyi formatlarını doğrudan adaptasyon gelişimi sırasında hem dikey hem de yatay olarak doku modeli sözleşmeleri beri tavsiye edilmez. Bakteriler / Hücre Hatlarının Malzemeleri, Medya ve Kültür 1. Hazırlık <ol><li> Bakterilerin Kültürü: <ol><li> Mikobakteri suşu M. büyütün % 0.05 ihtiva eden Middlebrook 7H9 ortamında temel olarak yeşil fluoresan protein (GFP) ifade etmek için pFPV2 plazmiti taşıyan tuberculosis H37Rv, Tween-80,% 0.5 gliserol, kanamisin (20 ug / ml) ve (Middlebrook albümin, dekstroz ve katalaz zenginleştirme ile desteklenmiş Middlebrook ADC Zenginleştirme), 7-10 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de. Not: Tüm deneysel adımCanlı öldürücü M. içeren s tuberculosis suşlarında BSL-3 imkan yapılmalıdır. </li></ol></li><li> 1x Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) tam orta hazırlanması (1 mM sodyum piruvat, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 10 mM HEPES, 0.1 mM temel olmayan amino asitler ve 10 ile desteklenen % fetal sığır serumu (FBS)) ısı ile inaktive edilmiş. Ayrıca antibiyotik içermeyen DMEM tam orta hazırlayın. </li><li> 1x Minimum Essential Medium (MEM) tam orta hazırlanması (1 mM sodyum piruvat, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 10 mM HEPES, 0.1 mM temel olmayan amino asitler ve% 10 ısı ile ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS)). </li><li> Fibronektin / kolajen kaplı şişeler (toplam 10 mi) hazırlanması: <ol><li> Temiz bir tüp içine pipetle 8,8 ml steril 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS). 1 ml büyükbaş hayvan serum albümini (1 mg / ml), 100 ul tip I kollajen (3 mg / ml), sığır ve 100 ul rekombinant hu eklemeAdam fibronektin (ug / ml, 1 mg). </li><li> Baş aşağı 5 kez tüp çevirerek çözüm karıştırın. Bidonlar (a T-25 ve T-75 balonuna 2 ml 1 mi), bir fibronektin / kolajen çözeltisi ile kaplanır. 37 ° C&#39;de / Ç N bırakın. Kuluçkadan sonra, çözelti çıkarın ve oda sıcaklığında kaplanmış şişeler saklayın. Not: Toplanan çözelti, 4 ° C&#39;de saklanır ve üç kez tekrar edilebilir. 2 haftadan daha uzun saklama sıvı, atılmalıdır üzerine kahverengi (kristallerin oluşması) açılmasına neden olabilir. </li></ol></li><li> Fibroblast Kültürü: <ol><li> 37 ° C&#39;de% 5 CO2 içinde bitmiş DMEM içinde, büyümeye ve MRC-5 (14 haftalık erkek fetusun normal akciğer dokusundan elde edilen bir insan akciğer fibroblast hücre çizgisi) korumak. Geçitlerin 24-26 de fibroblastlar kullanın ve% 70-80 konfluent kadar büyür. Not: geçit&gt; 30 MRC-5 hücre hattı morfolojisi kaybetmek eğilimindedir ve doku modelinde kullanılması tavsiye edilmez. </li></ol></li><li> Epitel hücrelerinin kültürü:<ol><li> 16HBE14o- (16HBE), normal insan hava yolu epitel farklılaşmış morfolojisi ve fonksiyonunu koruyan bir ölümsüzleştirdi insan bronşiyal epitel hücre hattı, (bu Dieter Gruenert, Mt. Zion Kanser Merkezi, Kaliforniya Üniversitesi, San Fransisco bir hediye oldu edinin ABD 10.). Fibronektin / kolajen kaplı şişelerde kültür 16HBE hücreleri ve 37 ° C de% 5 CO2 tam MEM içinde hücreleri korumak. </li></ol></li><li> 5x DMEM hazırlanması <ol><li> DMEM tozu 13.4 g ve steril damıtılmış su içinde 150 ml sodyum bikarbonat 3.7 g çözülmesiyle 5x DMEM hazırlayın. , 7.3 ortamın pH ayarlama 200 ml hacim oluşturan ve 0,22 um membran filtre kullanılarak filtre. Steril bir kaba süzüldü orta toplamak ve oda sıcaklığında kullanıma kadar muhafaza edilmiştir. </li></ol></li></ol> Kollajen gömülü Fibroblast 2. Hazırlık <ol><li> 37 ° C su banyosu içinde FBS ve L-glutamin çözülme dondurulmuş tam bölünen miktarları.Çözündükten sonra buz üzerinde örnekleri tutmak. 4 ° C de sodyum bikarbonat (71.2 mg / ml) ve gentamisin (50 mg / ml) yerleştirin. 50 ml santrifüj tüplerine ve 4 ° C&#39;de 10 ml steril pipetler öncesi soğutulur. Not: (5x DMEM hariç) kullanılan bütün malzemelerin, kullanımdan önce buz üzerinde soğutulmuş ve tüm aşamaları, buz üzerinde gerçekleştirilir. Bu kollajen katılaşmasını engeller gibi sığır kollajeni (1,1 mg / ml), soğuk tutulmalıdır yazın. </li><li> Fibroblast hücreleri hazırlayın: <ol><li> Sıcak 37 ° C su banyosu içinde tripsin ve 37 ° C&#39;de% 5 CO2 seviyesinde 10 dakika boyunca akciğer fibroblast (MRC-5) hücreleri ile yeterli miktarda inkübe edin. 1x DMEM tam ekleyerek tripsin nötralize eder. 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücre süspansiyonu ve santrifüj aspire. Süpernatant aspire ve bitmiş DMEM içinde bir 2.3 x 10 5 hücre / ml&#39;de tekrar süspansiyon hücreleri. Kullanım için hazır olana kadar buz üzerinde hücreleri yerleştirin. </li></ol></li><li> Ön karışım hazırlayın: <ol><li> &quot;Pre-mix&quot; etiketli bir tüpe aşağıdakileri ekleyin; 3955x DMEM ul, 40 ul L-Glutamin, 120 ul NaHCO3 (71,2 mg / ml), 440 ul FBS, 5 ul gentamisin (50 mg / ml), Toplam hacim 1000 ml, sonra iyice önceden karıştırılır ve koymak girdap Buz. Not: Verilen miktarlar, bir 24 mm 6 oyuklu kültür eklemek içindir. Ekler toplam sayısı için gerekli belirli miktarları hesaplayın ama emin yeterli ön karışım hazırlanır olmak için ekstra bir tane ekleyin. </li></ol></li><li> Acellular kollajen karışımı hazırlayın: <ol><li> Her kültüre asellüler kollajen karışımı 1 ml ekleyin. Verilen sıraya göre, buz üzerinde bir 50-ml&#39;lik konik tüpe aşağıdakileri ekleyin; 1,1 mg / ml kolajen 686 ul, 250 ul Ön karışımı ve 1000 ul toplam hacim 64 ul 1x tam bir DMEM. Iyi hava kabarcıkları sağlanması çözüm karıştırın. Hızlı çalışmak ve hava kabarcıklarını önlemek için tüpün duvarında kollajen ekleyin. </li><li> 6 yuvalı plaka yerleştirilir inserte hücresel olmayan tabaka karışımı 1 ml ilave edilir. Insert dışında kuyuya herhangi orta katmayın. Içinde37 ° C kuluçka makinesi içinde 30 dakika için cubate. Acellular karışım herhangi bir hava kabarcığı olmadan tüm insert kapsar emin olun. </li></ol></li><li> Hücresel kollajen karışımı hazırlayın: <ol><li> Aşağıdaki sırayla, buz üzerinde tutulan bir 50 ml konik bir tüp içinde hücresel tabakanın bileşenleri karıştırın; 2 ml Kolajen, 615 ul Öncesi karışımı, 1x tam DMEM 58 ul ve 327 ul hücre süspansiyonu Akciğer fibroblastlar (MRC-5) 3000 ul toplam hacmi telafi etmek. Her kültür, hücresel kolajen karışımı 3 ml gerektirir. KRİTİK ADIM: dikkatle hücre süspansiyonu eklenmesinden önce kolajen ve ön karışımı karıştırmak için emin olun. Bu fibroblastlar üzerindeki toksik etkileri önlemek için kolajen pH nötralize edecektir. </li><li> Hücresel olmayan kollajen tabakanın üzerine hücresel tabakanın (3 mi) ilave edin ve 37 ° C kuluçka makinesi içinde 2 saat süreyle inkübe edin. Hızlı çalışmak ve hava kabarcıklarını önlemek için tüpün duvarında kollajen ekleyin. </li><li> Polimerizasyon sonrasında, t tam DMEM 2 ml ilaveO (insert altında) 6 plaka alt ve 24 saat süre ile inkübe edilir. NOT: polimerizasyon meydana olmadıysa, fibroblast kollajen matriks içeren plaka ekler atmak ve start-tekrar. En olası neden eklenmesi veya yukarıda listelenen reaktiflerin bir yanlış hacminde bir hatadır. </li></ol></li></ol> Fibroblast-kollajen Matrix 3. Sürekli Kültürü <ol><li> Dikkatle temiz bir forseps kullanarak ekleme kaldırın ve kuyunun dibinden kültür ortamı aspire. Insert içinde 2 ml bitmiş DMEM ile iyice takip tabanına 2 mi tam bir DMEM ekleyin. Bu, dış ve iç bölme arasında besin difüzyonunu önlemek gibi, ekleme altında hava baloncuklarının oluşumunu ortadan. Bir mikropipet ucu ile hava kabarcıklarını çıkarın. </li><li> Yaklaşık 5-7 gün kültür ortamı (iç ve uç altında) her ikinci gün ve kültürü değiştirin. Insert medya giderilmesinde özen gösterin. Conta önlemek içinfibroblast kollajen matriks ile ct, hafif temiz bir forseps kullanarak ekleme eğin ve insert duvarlarından medya aspire. KRİTİK ADIM: kolajen matrisindeki fibroblastlar uzunlamasına bir fenotip elde, kolajen, daha sonra sözleşmeler değişiklik yapmak gerekir. Yaklaşık 5-7 gün içinde, matris insert merkezinde bir platform (çapı 10-14 mm) oluşturmak üzere sözleşmeli. Almasına matrisi, bir sonraki aşamada kullanıma hazırdır. Fibroblastlar önce (Adım 2.6.1) tohumlama için kolajen ile iyice karıştırılır o kritik matris muntazam bir daralma elde etmek. </li></ol> Bağışıklık Hücreleri (Enfekte / Bulaşmamış Monosit-makrofaj Karışımı) 4. Tohum Not: Aşağıdaki deney adım virülan mikobakteriler yayılır ve bu nedenle, bir BSL-3 imkan yapılmalıdır. <ol><li> Birincil monositler ve makrofajlar hazırlanması: <ol><li> Bir Establi kullanarak verici kandan periferal kan monositleri yalıtmakprotokolü döken. Doku modeli ve kültür kurma aynı gün monositler yalıtmak ve M. enfeksiyonu önce yaklaşık 7 gün süreyle makrofajlar içine ayırt tüberküloz. NOT: Bu sağlayacaktır hem makrofajlar ve sözleşmeli fibroblast kollajen matriks 7 gün sonra kullanılabilir. Ayrıca enfekte makrofajlar ile birlikte eklenecektir taze monositleri izole. </li></ol></li><li> M. hazırlanması Tüberküloz ile enfekte makrofajlar <ol><li> , 1 x PBS antibiyotik içermeyen bitmiş DMEM içinde% 0.05 Tween-80, tekrar süspansiyon içeren yıkama, kültürlenmiş bakteri hasat bakteriyel kümeleri dağıtmak ve optik yoğunluğunun ölçülmesi için, bir kesik, steril 27 G iğne geçer. Not: M. Öncesi belirlemek Laboratuvarda optik yoğunluk birim eşdeğer oluşturan tüberküloz koloni. Bu bakterilerin tahmini sayısının enfeksiyonu için kullanılacak verecektir. </li><li> 4 saat süre ile inkübe makrofajlar &lt;em&gt; M. enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı) 10) tüberküloz. Enfeksiyondan sonra, hücre dışı bakteriler kaldırmak için 1 x PBS ile 3 kez yıkayın. M. aynı şekilde ancak olmadan kültürlenen enfekte olmayan makrofagları kullanın tüberküloz, kontrol olarak. </li><li> 37 ° C&#39;de 10 dakika süreyle 2 mM EDTA ile muamele ile kültür plakasından çıkarın ve makrofajlar antibiyotik içermeyen bitmiş DMEM içinde yeniden süspansiyon haline getirildi hücreleri. </li></ol></li><li> Monositlerin Etiketleme Not: monositler İzolasyonu ve markalama BSL2 tezgah gerçekleştirilir ve daha sonra daha ileri işlemler için BSL-3 imkan alınabilir. <ol><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, 5 dakika boyunca 2 uM PKH26 kırmızı boyanın bir son konsantrasyona sahip taze hazırlanmış monositler (2 x 10 7 hücreleri) Leke. Yıkama 3x 1 x 10 7 hücre / ml bir yoğunlukta antibiyotik içermeyen bitmiş DMEM ile hücreler tekrar süspansiyon ve. </li></ol></li><li> Bağışıklık hücrelerinin eklenmesi fibroblast-kollajen matrisin <ol><li> After fibroblast kollajen matrisin kültür 5-7 gün, dış ve iç bölmelerden kültür ortamı aspire dış odaya tam taze antibiyotik içermeyen DMEM 1,5 ml ilave ediniz. </li><li> MO bir oranı ile, etiketlenmiş bir monosit-makrofaj (enfekte edilmemiş / bulaşmış) karışım hazırlayın: MQ (5: 1), 50 | il DMEM içinde tamamlandı. 50.000 makrofajlar için 250,000 etiketli monositleri alır. </li><li> Fibroblast kollajen matris MQ karışımını 37 ° C&#39;de% 5 CO2 içinde, 1 saat boyunca inkübe edilir: 50 ul, MO ekleyin. İnkübasyondan sonra, yavaşça içine doğru kültür ortamı 2 ml ilave edilir ve 37 ° C&#39;de% 5 CO2 içinde, ilave 24 saat süreyle inkübe edin. Not: eklenen hücreler gevşek bağlanmış olduğundan, medyanın eklenmesi hafifçe ekin duvarlarına ekleyerek yavaş olmalıdır. </li></ol></li></ol> Akciğer Epitel Hücreleri 5. Tohum (16HBE) Not: Aşağıdaki adımlar BSL-3 imkan yapılmalıdır. <ol><li> Tohum akciğer eMQ-fibroblast kollajen tabaka: MO üstünde pithelial hücreleri (16HBE). Bunu gerçekleştirmek için, ilk olarak (. 2.2.1 gibi) tripsin ile muamele etmek suretiyle şişeden 16HBE hücreleri ayırmak ve antibiyotik içermeyen DMEM 4 x 10 6 hücre / ml&#39;de süspansiyon haline getirin. </li><li> Iç ve insert dışında kültür ortamı aspire. Daha sonra ekin dışında da alt tam 1.5 mi antibiyotik içermeyen DMEM ekleyin. </li><li> Immün hücre-fibroblast kollajen matrisinin üzerine 16HBE 50 ul ekle. Kaputu 2 dakika boyunca bırak ve% 5 CO2 ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde 1 saat boyunca inkübe edilir. Kuluçkadan sonra, 3 gün boyunca 37 ° C&#39;de ekleme ve kültür içinde tam antibiyotik içermeyen DMEM yavaşça 2 ml ekleyin. Kültür aşama dokusu modelinde epitelyal hücrelerin çoğalmasını kolaylaştırır. Not: eklenen hücreler gevşek bağlanmış olduğundan, medya eklenmesi geçmenin duvarlar aracılığıyla kaydırarak yavaş ve nazik olmalıdır. </li></ol> 3D Akciğer 6. Hava pozlamaÖrnek Not: Enfekte makrofajların 5 gün sonra eklenmesinden sonra, doku modelleri hava maruz kalan ve aşağıdaki adımları BSL-3 tesiste yapılmalıdır. <ol><li> Iç ve insert dışında kültür ortamı aspire. Not: Bu adımda, süpernatanlar salgılanan faktörler saptanması için toplanabilir. -70 ° C &#39;de santrifüj steril filtre ve mağaza süpernatanları. </li><li> Dış odanın içinde 1,8 ml antibiyotik içermeyen DMEM ile tamamlanmış ekleyin ve 2 gün boyunca 37 ° C inkübatör% 5 CO2 içinde inkübe edilir. Insert içinde kültür ortamı eklemeyin. NOT: Doku modeli Hava kaldırma insan akciğer dokusuna doku ve fizyolojik benzerlik kuvvet sağlayan tabakalı epitel ve mukus salgısının, oluşumunu kolaylaştırır. </li></ol> 7. Hasat ve 3D Akciğer Doku Modeli Montaj Not: Aşağıdaki adımlar BSL-3 imkan yapılmalıdır.<ol><li> Enfekte makrofajların gün 7 yazılan implantasyon üzerinde doku modelleri hasat için hazır. Doku modeli tamamen kültür ortamı çıkarın. Oda sıcaklığında, karanlıkta 30 dakika süreyle% 4 paraformaldehid doku modeli sabitleyin. Bu adım, bakterileri öldürür ve daha fazla işlem için doku / hücre morfolojisi giderir. </li><li> Bir neşter kullanılarak, kuyu ovülden zarını ayırın. Iyi içeren 1x PBS doku içeren membran aktarın. </li><li> Kes ve temiz bir neşter kullanılarak doku modelinin yüzüne çıkarmak. Sonra 4 yaklaşık eşit kare parçaya doku modeli dilim. Bir SuperFrost cam slayt üzerine bir doku parçası aktarın. 4 ° C &#39;de 1 x PBS içinde doku parçaları saklayın. </li><li> 5 dakika boyunca doku kurutun ve DAPI ve lamel ile uzatmak Altın antifade kullanarak monte edin. Kuruyana kadar oda sıcaklığında karanlıkta bozmadan slaytlar bırakın. Not: doku kalınlığı hafif tilti neden merkez ve çevre arasında değişebilirlamel ng. Bunu önlemek için, (örneğin parafilm için) aralama kapak kayma köşesinde yerleştirilebilir. </li><li> Lamel kenarlarına oje sürün ve kurumasını bekleyin. BSL-3 tesisin ortaya çıkarmak için onları güvenli hale getirmek için% 70 etanol slaytlar bırakın. </li></ol> 8. Görselleştirme, Toplama ve Kantitatif Analiz 3D <ol><li> Lazerler sırasıyla GFP (yeşil kanal), PKH26 etiketli monositler için DAPI (mavi) için 420 nm ve 555 nm (kırmızı) uyarılması için 488 nm&#39;de yayan bir konfokal mikroskop sistemi kullanılarak doku slaytları gözünüzde canlandırın. </li><li> Yığınlarının arasında 1.5 mikron ayrılık - Z-yığınlarının 20 mikron kalınlığında en az kapsayan ve 1 sahip bir 512x512 çözünürlükte 3D görüntüler elde edin. Doku tüm parça kapsayan 5-10 farklı alanlarda edinin. Not: optik çözünürlük (dalga boyu, lazer güç / pozlama, piksel boyutu ve zoom) optimal ayarları için böyle Nyqvist olarak yapılandırmayı kullanın. Un kaçınınder ya piksel doygunluk bitti. </li><li> 3D görüntü işleme yazılımı ile konfokal görüntüleri analiz edin. Hücre kümelerinin 3D ölçümü için, aşağıdaki adımlar uygun analiz için tavsiye edilir. </li><li> 3D görüntü işleme yazılımını açın ve resim yüklemek. Örneğin, bir görüntü analiz edilecek nesnelerin boyutları ölçmek, bir çekirdek, tek tek monosit ve tek bakteri boyutu. Bu gözlemler, nesnelerin tanımlanması ya filtre edilmesi için kullanışlıdır. </li><li> Bir ekran ayarlama aracını kullanarak, görüntü kontrast, parlaklık ve matlık karışımı için her bir kanalı ayarlayarak ses render optimize. Bu adım, volume rendering gürültü girişimi en aza indirmektir. Not: Gamma düzeltmesi kaçınılmalıdır böylece görüntü manipülasyonu neden olabilir ve. </li><li> Eşiği (otomatik veya manuel seçim) kırmızı kanalı (monositler) seçerek yüzeyleri oluşturun ve ayarlayın. Gerekirse, kırmızı monosit seçimini kısıtlamak için filtreleri kullanın veya b dışlamak içinackground. Benzer şekilde, yeşil (M. tüberküloz) ve yukarıda tarif edildiği gibi mavi (çekirdekler) kanalları için yüzeyler oluşturur. </li><li> Ms-Excel dosyaları içine verileri verme. Belirli bir parametreyi veya tüm verileri vermek mümkündür. Hücre kümeleme analizi için ilgili parametreler hacmi, yoğunluk, nesne sayısı, voksellerin ve küresellik sayısıdır. </li><li> Kaydet ve uygun bir resim formatında tercihen TIFF görüntüleri ihracat. NOT: Animasyonlar da animasyon menüsünü kullanılarak yapılan ve bir medya dosyası olarak kaydedilebilir. </li><li> Ekleme parametreleri seçeneği kullanarak her kanalın analiz ayarları kaydedin ve işlevini yeniden kullanarak daha sonra alınabilir. Aynı anda Toplu işleme aracını kullanarak daha fazla dosyaları analiz. Not: alımr, muamele edilir ve aynı şekilde analiz edilmelidir karşılaştırılabilir tüm görüntüler. Mesela bir 8 bitlik görüntü (256 tamsayı) 12 bitlik görüntüde (4096 tamsayı) ile karşılaştırıldığında edilmemelidir. </li></ol>

<ol>
	<li>Sakamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection.</a> Veterinary pathology. 49, 423-439 (2012).</li><li>Saunders, B. M., Britton, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+and+death+in+the+granuloma:+immunopathology+of+tuberculosis.">Life and death in the granuloma: immunopathology of tuberculosis.</a> Immunol Cell Biol. 85, 103-111 (2007).</li><li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+issues+in+tuberculosis.+Ann+Rheum+Dis.">New issues in tuberculosis. Ann Rheum Dis.</a> Ann Rheum Dis. 63, ii50-ii56 (2004).</li><li>Morrison, J., Pai, M., Hopewell, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculosis+and+latent+tuberculosis+infection+in+close+contacts+of+people+with+pulmonary+tuberculosis+in+low-income+and+middle-income+countries:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Tuberculosis and latent tuberculosis infection in close contacts of people with pulmonary tuberculosis in low-income and middle-income countries: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Infect Dis. 8, 359-368 (2008).</li><li>Barry 3rd, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spectrum+of+latent+tuberculosis:+rethinking+the+biology+and+intervention+strategies.">The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 845-855 (2009).</li><li>Puissegur, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+dual+model+of+mycobacterial+granulomas+to+investigate+the+molecular+interactions+between+mycobacteria+and+human+host+cells.">An in vitro dual model of mycobacterial granulomas to investigate the molecular interactions between mycobacteria and human host cells.</a> Cell Microbiol. 6, 423-433 (2004).</li><li>Kapoor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Granuloma+In+Vitro+Model,+for+TB+Dormancy+and+Resuscitation.">Human Granuloma In Vitro Model, for TB Dormancy and Resuscitation.</a> PLoS One. 8, e53657 (2013).</li><li>Nguyen Hoang, ., T, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+functional+properties+in+a+three-dimensional+tissue+model+of+human+lung+mucosa.">Dendritic cell functional properties in a three-dimensional tissue model of human lung mucosa.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L226-L237 (2012).</li><li>Parasa, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Mycobacterium+tuberculosis+early+granuloma+formation+in+experimental+human+lung+tissue.">Modeling Mycobacterium tuberculosis early granuloma formation in experimental human lung tissue.</a> Dis Model Mech. 7, 281-288 (2014).</li><li>Cozens, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+expression+and+chloride+secretion+in+polarized+immortal+human+bronchial+epithelial+cells.">CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).</li><li>Brighenti, S., Andersson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+immune+responses+in+human+tuberculosis:+learning+from+the+site+of+infection.">Local immune responses in human tuberculosis: learning from the site of infection.</a> J Infect Dis. 205, S316-S324 (2012).</li><li>Davis, J. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+granuloma+in+expansion+and+dissemination+of+early+tuberculous+infection.">The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection.</a> Cell. 136, 37-49 (2009).</li><li>Gupta, U. D., Katoch, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+tuberculosis.">Animal models of tuberculosis.</a> Tuberculosis (Edinb). 85, 277-293 (2005).</li><li>Kashino, S. S., Napolitano, D. R., Skobe, Z., Campos-Neto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guinea+pig+model+of+Mycobacterium+tuberculosis+latent/dormant+infection.">Guinea pig model of Mycobacterium tuberculosis latent/dormant infection.</a> Microbes Infect. 10, 1469-1476 (2008).</li><li>Singhal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+tuberculosis+in+the+Wistar+rat:+a+model+for+protective+immunity+and+control+of+infection.">Experimental tuberculosis in the Wistar rat: a model for protective immunity and control of infection.</a> PLoS One. 6, e18632 (2011).</li><li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphodiesterase-4+inhibition+alters+gene+expression+and+improves+isoniazid-mediated+clearance+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+rabbit+lungs.">Phosphodiesterase-4 inhibition alters gene expression and improves isoniazid-mediated clearance of Mycobacterium tuberculosis in rabbit lungs.</a> PLoS Pathog. 7, e1002262 (2011).</li><li>Lin, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+neutralization+results+in+disseminated+disease+in+acute+and+latent+Mycobacterium+tuberculosis+infection+with+normal+granuloma+structure+in+a+cynomolgus+macaque+model.">Tumor necrosis factor neutralization results in disseminated disease in acute and latent Mycobacterium tuberculosis infection with normal granuloma structure in a cynomolgus macaque model.</a> Arthritis Rheum. 62, 340-350 (2010).</li><li>Rahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+immune+responses+in+human+tuberculosis:+few+CD8++effector+T+cells+but+elevated+levels+of+FoxP3++regulatory+t+cells+in+the+granulomatous+lesions.">Compartmentalization of immune responses in human tuberculosis: few CD8+ effector T cells but elevated levels of FoxP3+ regulatory t cells in the granulomatous lesions.</a> Am J Pathol. 174, 2211-2224 (2009).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

The ability to recruit and form organized cell clusters at the site of infection is the hallmark of human TB 11. These dynamic structures known as tubercle granulomas primarily consist of immune cells (macrophages, monocytes, T-cells and B-cells) and multi-nucleated giant cells surrounding M. tuberculosis. The role of the granuloma has long been considered to wall off the infection, preventing local spread of bacteria. However, more recent studies show that granuloma formation is critical for early bacterial survival, growth and dissemination 12. A strategy of new studies is to identify molecules or pathways that could efficiently be targeted to inhibit the cellular migration in granuloma formation and/or TB dissemination. 
A caveat for novel studies on TB is the lack of models that recapitulate human TB. The most widely used experimental animals do not form true granuloma upon M. tuberculosis infection, and are therefore not appropriate choices for studies of TB 13-16. Non-human primates have the closest resemblance to human TB 17, but are not the preferred choice owing to high operational costs and ethical issues. Human TB is a complex immunological process and is difficult to model in vitro. Cell cultures of monolayers or co-cultures lack the 3D environment and tissue responses. Therefore, we have developed an innovative lung tissue model based on human primary immune cells and human lung-specific cell lines 8,9. The model displays characteristic features of human lung tissue, including epithelia with evenly integrated macrophages, formation of extracellular matrix, stratified epithelia and mucus secretion 9. 
The 3D human lung tissue model has several benefits over the in vitro single or co-cultures seeded on tissue culture plates or transwell inserts. First, the human lung-specific cells (fibroblasts and epithelial cells) are not commonly included in the in vitro single or co-cultures. Second, the immune cells and lung-specific cells are embedded in a 3D physiological context (collagen rich extra-cellular matrix products). The response of cells to a stimulus/infection and the migratory behaviour of cells, for instance formation of a granuloma, differ significantly between a 2D and 3D environment. Furthermore, the described method enables the 3D visualization and robust 3D quantitative analysis that provides pivotal information on spatial distribution and intricate cellular interactions. 
Experimental infection in the model tissue with M. tuberculosis resulted in clustering of macrophages at the site of infection, reminiscent of early TB granuloma (Figure 2 and 3). We have recently demonstrated that mutant strains defective in the ability to secrete the virulence factor ESAT-6 or Mycobacterium bovis BCG that lacks ESAT-6 did not induce the clustering of monocytes (no early granuloma), in contrast to the virulent M. tuberculosis 9. These data are consistent with the observations made from Mycobacterium marinum-infected zebrafish embryos, whose transparency allows for elegant live imaging of granuloma formation 12. As there is no gold-standard model for TB, we took advantage of the surgically resected tissue biopsies from TB patients for validation of the method 9. Our in vitro tissue model shares several characteristics with the lung and lymph node biopsies from TB patients, including the aggregation of macrophages in granuloma, the presence of both intra- and extracellular bacteria 18 and induction of necrosis 11. 
Although the described model has physiological relevance to human TB and has several advantages over other in vitro models, it has some limitations. For instance, out of more than 20 collagen proteins identified in humans, only type I is included to the model to mimic the extra-cellular matrix. However, type I collagen is a complex mixture of extra-cellular matrix products and is the most abundant collagen in the human body. Further, we have demonstrated the presence of collagen IV and several extra-cellular matrix proteins such as tropoelastin, vimentin and laminin, which are produced by the epithelial cells and fibroblasts in the tissue model, indicating the synthesis of new collagen 8. Presently, the lung tissue model only has monocytes and macrophages, besides lung-specific cells. It lacks neutrophils and lymphocytes that are also known to be present in the granuloma. Remarkably the model is not limited to the introduction of additional immune cells and is of interest to explore how they contribute to the complex cellular interactions in human TB. Implantation of primary alveolar macrophages, skin-specific cells and lung carcinoma cells has already been tested in the model. Since our objective was to use a model that closely resembles human TB, introduction of mouse cells have not been attempted.
In summary, the lung tissue model has implications for both basic mechanistic and applied studies. Potential applications of the lung model include the study of innate immunity, investigating mechanistic aspects of host defences such as phagosomal maturation, autophagy, production of cytokines, chemokines and anti-microbial peptides, and functional characterization of individual cell types. Strikingly, the in vitro tissue model allows manipulation of one or more cells types and provides a relevant tissue micro-environment, not only for studies on TB, but for a variety of infectious and non-infectious diseases that affect the lungs.

İnsanlarda, enfeksiyon, doku iltihabı, hücresel işe alım, doku yeniden ve doku homeostazının düzenlemeye tepkiler farklı hücre tiplerini içeren karmaşık olaylardır. Dolayısıyla, bu süreçler en iyi lokal doku ortamında incelenir. Daha önce, bu çoğunlukla deneysel hayvan modelleri kullanılarak mümkün olmuştur. Genellikle insanlarda daha farklı bir şekilde patojenlere karşı cevap verir ve aynı zamanda hastalığın 1 farklı bir yol göstermek Ancak, yaygın olarak kullanılan deney hayvanları birçok sınırları tutun. In vitro akciğer dokusunda modelinde Bir insan, insan akciğerinde spesifik immün yanıtları incelemek için olasılıkları tutar. İnsan tüberküloz enfeksiyonu (TB). Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), TB etkeni bakteriler akciğer dendri tarafından yuttu alveoler alana, taşınır aerosol damlacıkları yoluyla akciğere ulaşır akciğerleri etkileyen bir hastalıktırtik hücreleri ve enfeksiyon 2,3 doğuştan gelen bağışıklık yanıtının bir parçası olarak alveolar makrofajlar. Patojenin Fagositoz bir fagozomun içinde hata bölümlendirme yol açar ve ideal phagocyte ile nötralizasyon ve patojenin öldürülmesi ile sonuçlanır. M. maruz kalan bireylerin% 50 kadar tuberculosis tabii immun cevabın 4 ile enfeksiyonu temizleyebileceğine mümkün olduğuna inanılmaktadır. Diğer enfeksiyon sonuçların bir sonraki aşamada, latent enfeksiyon ya da en kötü durumda, kronik aktif hastalık 5 adaptif bağışıklık sistemi tarafından açıklık vardır. Daha önce, insan TBC çalışmalar için bir in vitro doku modelleri olmuştur. Insan makrofajları ve diğer periferal kan hücrelerinin tekli hücre kültürleri, genellikle 6,7 kullanılmıştır. Bu yaklaşımın dezavantajı, M. maruz kalan akciğer dokusu içinde birlikte çalışan farklı hücre tiplerinin dinamiklerini yansıtmıyor olmasıdır tüberküloz </em&gt;. Bu nedenle, TB ve işlevsel mekanistik çalışmalar yapabilmek için bir in vitro model için bir ihtiyaç vardır. Hücre tabanlı Burada anlatılan in vitro insan akciğer dokusu modelinde orijinal dendritik hücre fonksiyonları 8 çalışmalar için bizim grup tarafından kurulmuştur. Biz TB çalışması için bu yöntemi adapte var. Burada sunulan insan akciğer dokusu modeli dokuya özgü epitel hücreler ve fibroblastlar 8 oluşur. Bu hücreler, bir Transwell ek ve normal insan akciğer dokusu (Şekil 1) benzer bir şekilde yapılarında gözenekli bir zar üzerine kolajen matrisi içinde kültürlenir. Hava maruz kaldığında hücreler apikal tarafında 8&#39;de mukus salgılamaya başlar. Insan birincil makrofajlar implante tarafından M ile enfekte bağışıklık hücreleri dokuda göç ve TB granülom 9 erken aşamalarında formu nasıl modele tüberküloz, biz gözlemledik. Bu ilk insan dokusu modeli descri olduğunuTB IBED ve TB ve akciğer ve diğer hastalıklara karşı doğal immün yanıtları çalışmak için gelecek vaat eden bir araç teşkil etmektedir. Bugüne kadar, modelinde bağışıklık hücreleri sadece olarak monositleri ve makrofajlan kullanılan ama karmaşıklık düzeyi ilgili ek hücre tipleri dahil edilmesi ile artırılabilir. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig1.jpg" /> Akciğer dokusu modelinin 1. şematik anahat rakam. (A) bir model M., insan akciğer epitel hücrelerine özgü oluşmaktadır tüberküloz primer makrofajlar ile enfekte ve kırmızı boya etiketli monositler bir transwell filtre üzerinde hazırlanan kollajen gömülü fibroblastlar üzerine numaralı seribaşı. Havaya doku modeli Pozlama epitel ile hücre dışı matriks proteinlerin üretimini, mukus salgılanmasını ve tabakalaşma başlatır. Böylece geliştirilen 3D doku modeli M. incelemek için yararlı bir araçtır clo bir ortamda tuberculosis enfeksiyonuyapt klar insan akciğeri. (B) bir doku modeli hazırlanmasında farklı adımların Örnek mikroskopik ve görüntüler. (C) akciğer modeli, doku bölümünün komple yapı benzemektedir. Ölçek -. 100 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC-5 cells, lung fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATCC#CCL-171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16HBE cells, lung epithelial cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco, USA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 x Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (5 x DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-082</td>
			<td>Made from powder but add 5 times less water. Adjust pH to 7.3 and filter it using a 0.2 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium with glucose (DMEM) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM) 1x with Earle&#8217;s salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids Solution, 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3 (71.2 mg/ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Heat inactivated for 30 min, 56 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes buffer solution 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (Pen Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield</td>
			<td>7801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure 0.5 M EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Collagen PA treated (500 ml)</td>
			<td>Organogenesis</td>
			<td>200-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure col purified Bovine Collagen solution (100 ml)</td>
			<td>Advanced biomatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix protein, Fibronectin (1 mg)</td>
			<td>BD</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human monocytes/macrophages</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Isolated from human whole blood or buffy coats.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red fluorescent cell linker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MINI26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37Rv expressing green fluorescent protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M. tuberculosis H37Rv wild type was transformed with the pFPV2 plasmid constitutively expressing GFP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 medium&#160;</td>
			<td>Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook ADC Enrichment</td>
			<td>BBL</td>
			<td>211887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin B sulfate (20 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold anti=-fade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMaris Scientific 3D/4D image processing software, version 7.6.8</td>
			<td>Bitplane AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3d human lung tissue model for functional studies on mycobacterium tuberculosis infection

Tüberküloz (TB) hala tüm dünyada insanların sağlığı için büyük bir tehdit tutar ve bize yeni tedavi seçeneklerinin keşifler hastalık mekanizmalarını anlamak ve ilerletmek yardımcı olmak için düşük maliyetli ama güvenilir modelleri için bir ihtiyaç vardır. Mono tabakaları In vitro hücre kültürleri ya da ko-kültürler üç boyutlu (3D) bir ortam ve doku tepkileri yoksundur. Bu yazıda, Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) ile enfeksiyon sırasında meydana gelen karmaşık olayları incelemek için etkili bir araç olarak umut vaat insan akciğer dokusu, in vitro model yenilikçi açıklar. 3D doku modeli gözenekli bir zar üzerine kolajen matrisi içinde kültürlenir dokuya özgü epitel hücreleri ve fibroblastlar, oluşur. Hava maruziyet üzerine, epitel hücreleri tabakalandırmak ve apikal tarafında mukus salgılar. Insan birincil makrofajlar tanıştırarak M. ile enfekte Doku moduna tüberkülozl, immün hücreleri enfekte doku içine göç ve TBC granülom erken aşamalarında meydana göstermiştir. Bu yapılar temelde farklı veya sık yaygın olarak kullanılan deneysel hayvan modellerinde gözlenen değil, insan TB, granülom, ayrı özelliği özetlemek. Bu Organotipik kültür yöntemi konak hücre-patojen etkileşimleri mekansal ve zamansal özellikleri önemli bilgi sağlar 3 boyutlu görselleştirme ve sağlam nicel analiz sağlar. Birlikte ele alındığında, akciğer doku modeli TB çalışmaları için fizyolojik ilgili doku mikro ortam sağlar. Böylece, akciğer doku modeli temel mekanik ve uygulamalı çalışmalar hem de potansiyel etkileri vardır. Önemli olarak, model, böylece akciğerleri etkileyen enfeksiyon hastalıklarının çeşitli modellemek için kullanımını genişler tek tek hücre tiplerinde, ilave ya da manipülasyon.

İnsan TB için bir 3D akciğer doku modeli etkin bir şekilde M. konak-patojen etkileşimleri çalışmak için kullanılabilir Tüberküloz enfeksiyonu. Bu yöntem temel aşamaları, farklı adımlar bir doku kesitinin bir genel mikroskobik yapısı temsili mikroskopik görüntüleri, Şekil 1 &#39;de özetlenmiştir. Modeli akciğer fibroblastlarında, bronşiyal epitel hücrelerinde ve primer monosit / makrofajlar dahil olmak üzere, insan akciğer dokusu çeşitli bileşenleri bulunmaktadır 3D doku ortamında gömülü. Insan akciğer dokusu bileşenlerini içeren yanı sıra, model, fizyolojik koşullar epitel mukus salgılanmasının, yani tabakalaşma benzemektedir. Bir TB enfeksiyonunu izleyerek akciğer dokusu modelinin kullanımı için bir örnek Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. M. görselleştirmek için Tüberküloz -immune hücre göçü ve etkileşim, biz M ile enfekte makrofajlar tanıttı GFP ifade tüberküloz(yeşil) birlikte, doku modeline taze izole PKH26 etiketli monositler (kırmızı) ile (mavi, DAPI çekirdekleri için boyandı). M. gün 7 sonrası ek Açık Doku modeline tüberküloz ile enfekte hücreler, konfokal mikroskopi insan TB 9 damgasını lezyonları taklit enfeksiyonu (yeşil) sitesinde (Şekil 2), kırmızı monosit kümeleme ortaya koymaktadır. M. 3D görselleştirme için temsili görüntüleri bir dizi Tüberküloz doku modeli ve hücre kümelerinin ölçümü Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. 3D görselleştirme, etkileşim incelemek ve 3D görüntüde çeşitli özellikler ölçmek için kullanıcı esnekliği sağlar ile enfekte. M. yerinde monositlerin kümelenmesini ortaya Şekil 3B&#39;de, gösterildiği gibi, yeşil ve kırmızı bakteri kümeleri monosit spatyal, apikal rotasyonel ve yanal görünümünde görülebilir tüberküloz. kümeler ob değildibulaşmamış dokularda (Şekil 3A) görev yaptı. Biz monosit hücre kümelerinin sayısını ve boyutunu sayısal ve bireysel monosit sayısı M. (p &lt;0.01) azalmıştır hücre kümeleri boyutu (hacmi), (p &lt;0.001) artmış olduğu bulundu enfekte edilmemiş doku modelleri (Şekil 3C ve 3D) kıyasla tüberküloz dokuları bulaştırılır. Bu veriler M. erken granülom oluşumu önceki bulguyu doğrular Tüberküloz enfeksiyonu 2B doku kesitlerinde 9 analiz akciğer dokusunda modellerinde gözlenen. Bulgularımız doku modeli karmaşık ev sahibi M. hücre- araştırmak için doğal bir 3D yaşam sağladığını göstermektedir tüberküloz iletişim ağı. Biz de 3 boyutlu görselleştirme ve kantitatif analiz doku modelinde (Şekil 3) özelliklerini incelemek için daha iyi araçlar olduğunu gördük. Bir hücre kümesinin Kantitasyonu (örneğin granülom) sıklıkla Stretç<html> birkaç hücre tabakası hes alınmakta ve bir 3D niceliksel analizi ile yakalanabilir. Dahası, tek tek hücrelerin veya modele bakteri kesin mekansal ve zamansal özellikleri görselleştirme belirlenmiş bir laboratuarda canlı görüntüleme, göç ve izleme çalışmaları tanır. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53084/53084fig2.jpg" /> Öldürücü M. etrafında doku modeli kümede Şekil 2. Monosit tüberküloz. bulaşmamış ve M. Temsilcisi konfokal görüntüler tüberküloz ile enfekte doku modeli sunulmuştur. Bulaşmamış dokulara kıyasla Paneller yeşilden (M., tüberküloz GFP), kırmızı (PKH26 etiketli monositler), mavi (DAPI-lekeli çekirdekleri) ve birleştirilmiş kanallar enfekte dokuda monositlerin göstermektedir. Ölçek - 100 mikron.large.jpg &quot;style =&quot; font-size: 14px; line-height: 28px; &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53084/53084fig3.jpg" /> Şekil 3. 3 boyutlu görselleştirme ve doku modelinin kantitatif analiz yararlı bilgiler sağlamaktadır. M. ile enfekte tüm doku modeli (A) bulaşmamış doku, (B) 3 boyutlu görselleştirme Temsilcisi görüntüleri tüberküloz, Imaris görüntü işleme yazılımı (sürüm 7.6.8) tarafından Zeiss LSM700 konfokal mikroskop ve kantitatif analiz kullanılarak optik kesit boyunca. Bu görüntüler 20X büyütmede elde edildi, apikal, dönme yatay, düşey dönme ve lateral görünümde (A ve B) görselleştirme izin 1.5 mikron aralıklarla 19.5 um doku kalınlığı kapsayan 14 z-yığınları. (C) QuaM. sonrası erken granülom kümelerin monosit hücre kümelerinin ntitative analizi geliştirilmiş ortaya koymaktadır (p &lt;0.0001) boyutu enfekte olmuş dokudaki fazla kümeleri tekrarlayan, enfekte olmamış bir doku ile karşılaştırıldığında enfeksiyon olmamasına kıyasla tüberküloz enfeksiyonu. (D) monosit sayısının nicelleştirilmesi enfekte olmuş dokudaki bir düşüş (p &lt;0.01). Yeşil - M. tüberküloz GFP, Kırmızı - PKH26 etiketli monositler, Mavi - hücre çekirdekleri, Ölçek -. 100 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection at JoVE.com

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Fonksiyonel Araştırmaları 3D İnsan Akciğer Doku Modeli<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Enfeksiyon

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

a-3d-human-lung-tissue-model-for-functional-studies-on-mycobacterium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

18.7K Görüntüleme.  Linköping University. Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.