The authors acknowledge the Microscopy core facility at the Faculty of Health Sciences, Link&#246;ping University for providing access to advanced imaging systems; Karl-Eric Magnusson (Emeritus Scientist) at the Dept. of Clinical and Experimental Medicine, Link&#246;ping University for providing access to Imaris 3D/4D image processing software (Bitplane, Switzerland); and S. Braian for his help with the lung model cartoon. This work was supported by funds from the Swedish Research Council (Alternatives to animal research, 2012-1951) and Swedish Research Council (2012-3349) to M.L. and Swedish Foundation for Strategic Research to S.B. S.B. receive grants from the Karolinska Institutet, Swedish Research Council, the Swedish International Development Cooperation Agency (Sida) and the Swedish Civil Contingencies Agency (MSB), and the Swedish Heart and Lung Foundation (HLF). M.S. received grants from the Karolinska Institutet and Stockholm County Council.

<ol>
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The authors declare no competing financial interests.

The ability to recruit and form organized cell clusters at the site of infection is the hallmark of human TB 11. These dynamic structures known as tubercle granulomas primarily consist of immune cells (macrophages, monocytes, T-cells and B-cells) and multi-nucleated giant cells surrounding M. tuberculosis. The role of the granuloma has long been considered to wall off the infection, preventing local spread of bacteria. However, more recent studies show that granuloma formation is critical for early bacterial survival, growth and dissemination 12. A strategy of new studies is to identify molecules or pathways that could efficiently be targeted to inhibit the cellular migration in granuloma formation and/or TB dissemination. 
A caveat for novel studies on TB is the lack of models that recapitulate human TB. The most widely used experimental animals do not form true granuloma upon M. tuberculosis infection, and are therefore not appropriate choices for studies of TB 13-16. Non-human primates have the closest resemblance to human TB 17, but are not the preferred choice owing to high operational costs and ethical issues. Human TB is a complex immunological process and is difficult to model in vitro. Cell cultures of monolayers or co-cultures lack the 3D environment and tissue responses. Therefore, we have developed an innovative lung tissue model based on human primary immune cells and human lung-specific cell lines 8,9. The model displays characteristic features of human lung tissue, including epithelia with evenly integrated macrophages, formation of extracellular matrix, stratified epithelia and mucus secretion 9. 
The 3D human lung tissue model has several benefits over the in vitro single or co-cultures seeded on tissue culture plates or transwell inserts. First, the human lung-specific cells (fibroblasts and epithelial cells) are not commonly included in the in vitro single or co-cultures. Second, the immune cells and lung-specific cells are embedded in a 3D physiological context (collagen rich extra-cellular matrix products). The response of cells to a stimulus/infection and the migratory behaviour of cells, for instance formation of a granuloma, differ significantly between a 2D and 3D environment. Furthermore, the described method enables the 3D visualization and robust 3D quantitative analysis that provides pivotal information on spatial distribution and intricate cellular interactions. 
Experimental infection in the model tissue with M. tuberculosis resulted in clustering of macrophages at the site of infection, reminiscent of early TB granuloma (Figure 2 and 3). We have recently demonstrated that mutant strains defective in the ability to secrete the virulence factor ESAT-6 or Mycobacterium bovis BCG that lacks ESAT-6 did not induce the clustering of monocytes (no early granuloma), in contrast to the virulent M. tuberculosis 9. These data are consistent with the observations made from Mycobacterium marinum-infected zebrafish embryos, whose transparency allows for elegant live imaging of granuloma formation 12. As there is no gold-standard model for TB, we took advantage of the surgically resected tissue biopsies from TB patients for validation of the method 9. Our in vitro tissue model shares several characteristics with the lung and lymph node biopsies from TB patients, including the aggregation of macrophages in granuloma, the presence of both intra- and extracellular bacteria 18 and induction of necrosis 11. 
Although the described model has physiological relevance to human TB and has several advantages over other in vitro models, it has some limitations. For instance, out of more than 20 collagen proteins identified in humans, only type I is included to the model to mimic the extra-cellular matrix. However, type I collagen is a complex mixture of extra-cellular matrix products and is the most abundant collagen in the human body. Further, we have demonstrated the presence of collagen IV and several extra-cellular matrix proteins such as tropoelastin, vimentin and laminin, which are produced by the epithelial cells and fibroblasts in the tissue model, indicating the synthesis of new collagen 8. Presently, the lung tissue model only has monocytes and macrophages, besides lung-specific cells. It lacks neutrophils and lymphocytes that are also known to be present in the granuloma. Remarkably the model is not limited to the introduction of additional immune cells and is of interest to explore how they contribute to the complex cellular interactions in human TB. Implantation of primary alveolar macrophages, skin-specific cells and lung carcinoma cells has already been tested in the model. Since our objective was to use a model that closely resembles human TB, introduction of mouse cells have not been attempted.
In summary, the lung tissue model has implications for both basic mechanistic and applied studies. Potential applications of the lung model include the study of innate immunity, investigating mechanistic aspects of host defences such as phagosomal maturation, autophagy, production of cytokines, chemokines and anti-microbial peptides, and functional characterization of individual cell types. Strikingly, the in vitro tissue model allows manipulation of one or more cells types and provides a relevant tissue micro-environment, not only for studies on TB, but for a variety of infectious and non-infectious diseases that affect the lungs.

Chez l&#39;homme, les réponses à l&#39;infection, l&#39;inflammation des tissus, le recrutement cellulaire, remodelage tissulaire et la régulation de l&#39;homéostasie tissulaire sont des événements complexes impliquant différents types de cellules. Par conséquent, ces procédés sont le mieux étudiés dans l&#39;environnement tissulaire local. Auparavant, cela a surtout été possible en utilisant des modèles animaux expérimentaux. Toutefois, les animaux de laboratoire largement utilisés détiennent de nombreux limites car ils répondent souvent à des agents pathogènes d&#39;une manière différente que les humains et affichent également un cours différent de la maladie 1. Un être humain dans le modèle de tissu pulmonaire vitro détient les possibilités d&#39;étudier les réponses immunitaires spécifiques dans le poumon humain. L&#39;infection de la tuberculose humaine (TB) est principalement une maladie affectant les poumons. Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), l&#39;agent causal de la tuberculose, atteint le poumon par des gouttelettes d&#39;aérosol qui sont transportés à l&#39;espace alvéolaire, où les bactéries sont engloutis par dendri pulmonairecellules tic et les macrophages alvéolaires dans le cadre de la réponse immunitaire innée à l&#39;infection 2,3. Phagocytose de l&#39;agent pathogène mène à la compartimentation de la bogue dans un phagosome et aboutit à la neutralisation et le meurtre de l&#39;agent pathogène par le phagocyte idéalement. Jusqu&#39;à 50% des personnes exposées à M. la tuberculose sont soupçonnés d&#39;être en mesure d&#39;éliminer l&#39;infection par la réponse immunitaire innée 4. Autres conséquences de l&#39;infection sont un dégagement de la système immunitaire adaptatif à un stade ultérieur, l&#39;infection latente ou dans le pire des cas, la maladie chronique active 5. Auparavant, il n&#39;y a pas eu de modèles in vitro de tissus pour les études de la tuberculose humaine. Des cultures de cellules uniques de macrophages humains ou d&#39;autres cellules du sang périphérique ont souvent été utilisés 6,7. L&#39;inconvénient de cette approche est qu&#39;ils ne peuvent pas tenir compte de la dynamique de différents types de cellules qui fonctionnent ensemble dans un tissu pulmonaire exposé à M. tuberculose </em&gt;. Ainsi, il existe un besoin d&#39;un modèle in vitro pour être en mesure d&#39;effectuer des études mécanistiques et fonctionnels sur la tuberculose. Le modèle en tissu pulmonaire humain in vitro décrit ici à base de cellules a été initialement créé par notre groupe d&#39;études sur les fonctions de cellules dendritiques 8. Nous avons adapté cette méthode pour l&#39;étude de la tuberculose. Le modèle de tissu pulmonaire humain présenté ici est constitué de cellules épithéliales et les fibroblastes 8 spécifiques d&#39;un tissu. Ces cellules sont cultivées dans une matrice de collagène sur le dessus d&#39;une membrane poreuse dans un insert Transwell et des structures de forme ressemblant à un tissu de poumon humain normal (figure 1). Lorsqu&#39;il est exposé à l&#39;air, les cellules commencent à sécréter du mucus sur le côté apical 8. En implantant des macrophages primaires humains infectés par M. la tuberculose au modèle, nous avons observé comment les cellules immunitaires migrent dans le tissu et forment premiers stades de granulomes tuberculeux 9. Ceci est la première descr modèle de tissu humainibed pour la tuberculose et elle pose un outil prometteur pour étudier les réponses immunitaires innées à la tuberculose et d&#39;autres maladies du poumon. À ce jour, nous avons utilisé seulement monocytes et les macrophages en cellules immunitaires dans le modèle, mais le niveau de complexité peut être augmentée par l&#39;inclusion d&#39;autres types de cellules pertinentes. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig1.jpg" /> Figure 1. Représentation schématique du modèle de tissu pulmonaire. (A) Le modèle est composé de cellules épithéliales pulmonaires humaines spécifiques, M. tuberculose infectés par l macrophages primaires et le colorant rouge monocytes marqués collagène ensemencés sur des fibroblastes préparés embarqué sur un filtre Transwell. L&#39;exposition du modèle de tissu à l&#39;air initie la production de protéines de la matrice extra-cellulaire, la sécrétion de mucus et de stratification par l&#39;épithélium. Le modèle de tissu 3D ainsi développé est un outil utile pour étudier M. l&#39;infection tuberculeuse dans un environnement qui closely ressemble à un poumon humain. (B) des images microscopiques représentatifs des différentes étapes de la préparation du modèle de tissu. (C) de la structure complète de la section de modèle de tissu du poumon. Scale -. 100 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC-5 cells, lung fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATCC#CCL-171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16HBE cells, lung epithelial cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco, USA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 x Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (5 x DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-082</td>
			<td>Made from powder but add 5 times less water. Adjust pH to 7.3 and filter it using a 0.2 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium with glucose (DMEM) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM) 1x with Earle&#8217;s salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids Solution, 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3 (71.2 mg/ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Heat inactivated for 30 min, 56 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes buffer solution 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (Pen Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield</td>
			<td>7801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure 0.5 M EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Collagen PA treated (500 ml)</td>
			<td>Organogenesis</td>
			<td>200-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure col purified Bovine Collagen solution (100 ml)</td>
			<td>Advanced biomatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix protein, Fibronectin (1 mg)</td>
			<td>BD</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human monocytes/macrophages</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Isolated from human whole blood or buffy coats.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red fluorescent cell linker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MINI26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37Rv expressing green fluorescent protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M. tuberculosis H37Rv wild type was transformed with the pFPV2 plasmid constitutively expressing GFP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 medium&#160;</td>
			<td>Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook ADC Enrichment</td>
			<td>BBL</td>
			<td>211887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin B sulfate (20 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold anti=-fade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMaris Scientific 3D/4D image processing software, version 7.6.8</td>
			<td>Bitplane AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3d human lung tissue model for functional studies on mycobacterium tuberculosis infection

La tuberculose (TB) détient toujours une menace majeure pour la santé des personnes dans le monde, et il ya un besoin de modèles de coût-efficacité, mais fiables pour nous aider à comprendre les mécanismes de la maladie et de promouvoir les découvertes de nouvelles options de traitement. Cultures in vitro de cellules de monocouches ou co-cultures ont pas la (3D) environnement tridimensionnel et réponses tissulaires. Ici, nous décrivons un innovant modèle in vitro d&#39;un tissu pulmonaire humain, qui tient promesse d&#39;être un outil efficace pour étudier les événements complexes qui se produisent lors de l&#39;infection par Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). Le modèle de tissu 3D est constitué de cellules épithéliales et les fibroblastes spécifiques d&#39;un tissu, qui sont cultivées dans une matrice de collagène sur le dessus d&#39;une membrane poreuse. Lors de l&#39;exposition de l&#39;air, les cellules épithéliales de stratifier et sécrètent le mucus au côté apical. En introduisant les macrophages primaires humains infectés par M. tuberculose au mode de tissul, nous avons montré que les cellules immunitaires migrer dans le tissu infecté, et forment des premiers stades de la tuberculose granulome. Ces structures récapitulent la caractéristique distincte de la tuberculose humaine, le granulome, qui est fondamentalement différent ou non couramment observé dans des modèles animaux expérimentaux largement utilisés. Cette méthode de culture organotypique permet la visualisation 3D et l&#39;analyse quantitative robuste qui fournit des informations clé sur les caractéristiques spatiales et temporelles des interactions cellulaires hôtes-pathogènes. Pris ensemble, le modèle de tissu pulmonaire fournit un tissu micro-environnement physiologiquement pertinente pour les études sur la tuberculose. Ainsi, le modèle de tissu pulmonaire a des implications potentielles pour les deux études mécanistiques et appliquées de base. Fait important, le modèle permet l&#39;ajout ou la manipulation de types de cellules individuelles, ce qui élargit ainsi son utilisation pour la modélisation d&#39;une variété de maladies infectieuses qui affectent les poumons.

Un modèle de tissu 3D pour la tuberculose pulmonaire humain peut être utilisé efficacement pour étudier les interactions hôte-pathogène dans M. l&#39;infection de la tuberculose. Les étapes de base de cette méthode, les images microscopiques représentatives des différentes étapes et une structure microscopique d&#39;ensemble d&#39;une section de tissu sont présenté sur la figure 1. Le modèle comporte plusieurs éléments de tissu pulmonaire humain, y compris des fibroblastes de poumon, des cellules epitheliales bronchiques et les monocytes primaires / macrophages intégré dans l&#39;environnement de tissu 3D. Outre l&#39;incorporation des composants de tissu pulmonaire humain, le modèle ressemble à savoir stratification des conditions physiologiques de l&#39;épithélium et la sécrétion de mucus. Un exemple de l&#39;utilisation du modèle de tissu pulmonaire dans la surveillance d&#39;une infection par la tuberculose est présentée en figure 2. Pour visualiser l&#39;M. la tuberculose migration cellulaire -immune et l&#39;interaction, nous avons introduit des macrophages infectés par M. la tuberculose qui expriment la GFP(vert) avec les monocytes fraîchement isolés de PKH26 marqué (rouge) dans le modèle de tissu (bleu, DAPI colore les noyaux de). Au jour 7 plus de poste de M. tuberculose cellules infectées par au modèle de tissu, la microscopie confocale révèle regroupement des monocytes rouges sur le site de l&#39;infection (vert) (Figure 2), qui imite les lésions de cachet de la tuberculose humaine 9. Une série d&#39;images représentatives pour la visualisation 3D de M. la tuberculose infectés par l modèle de tissu et la quantification des amas de cellules est représenté en figure 3. La visualisation 3D donne la flexibilité de l&#39;utilisateur d&#39;interagir, d&#39;examiner et de quantifier plusieurs caractéristiques dans une image 3D. La disposition spatiale des bactéries vertes et rouges grappes de monocytes peut être vu à partir de la vue apicale, et de rotation latérale, comme illustré sur la figure 3B, ce qui révèle le regroupement des monocytes au niveau du site de M. la tuberculose. Les groupes ne sont pas observi dans les tissus non infectés (figure 3A). Nous avons quantifié la taille et le nombre de grappes de cellules monocytes et constaté que la taille (volume) des amas de cellules est améliorée (p &lt;0,001), tandis que le nombre de monocytes individuelles a diminué (p &lt;0,01) dans M. la tuberculose infecte les tissus par rapport aux modèles de tissus non infectés (figure 3C et 3D). Ces données valide notre constatation précédente de la formation de granulomes tôt M. l&#39;infection tuberculeuse observée dans les modèles de tissu pulmonaire analysés dans des coupes de tissus 2D 9. Nos données suggèrent que le modèle de tissus fournit un habitat 3D naturel pour enquêter sur l&#39;hôte complexe Cell-M. Réseau de communication de la tuberculose. Nous avons également constaté que la visualisation 3D et l&#39;analyse quantitative sont de meilleurs outils pour étudier les caractéristiques dans le modèle de tissu (Figure 3). Quantification d&#39;un amas de cellules (granulome par exemple) souvent stretch<html> hes à plusieurs couches de cellules et peuvent être complètement capturées par une analyse quantitative 3D. En outre, la visualisation des caractéristiques exactes spatiales et temporelles des cellules individuelles ou des bactéries dans le modèle permet études live-imagerie, de migration et de suivi dans un laboratoire désigné. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig2.jpg" /> Figure 2. monocytes dans le groupe de modèle de tissu autour virulente M. la tuberculose. des images confocales représentatifs de non infecté et M. modèle de tissus infectés de tuberculose est présentée. Panneaux de couleur verte (GFP M. tuberculosis-), rouge (monocytes PKH26-marqué), DAPI (noyaux bleus colorés) et les canaux fusionnés montrent le recrutement des monocytes dans les tissus infectés par rapport aux tissus non infectés. Scale - 100 um.large.jpg &quot;style =&quot; font-size: 14px; line-height: 28px; &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig3.jpg" /> Figure 3. visualisation 3D et l&#39;analyse quantitative d&#39;un modèle de tissu fournissent des informations utiles. Représentatifs de visualisation des images 3D de l&#39;ensemble du modèle de tissu (A) de tissu non infecté, (B) infectées par M. la tuberculose, par sectionnement optique utilisant Zeiss LSM700 microscope confocal et l&#39;analyse quantitative par Imaris logiciel de traitement d&#39;image (version 7.6.8). Ces images ont été acquises à un grossissement de 20x, 14 z-piles couvrant une épaisseur de tissu de 19,5 um à 1,5 um intervalle, permettant la visualisation de apicale, horizontal de rotation, vue verticale et latérale de rotation (A et B). (C) Catntitative analyse des amas de cellules monocytes révèlent améliorée (p &lt;0,0001) taille des grappes début de granulome après M. l&#39;infection tuberculeuse par rapport à l&#39;absence d&#39;infection. (D) de quantification de nombre de monocytes a montré un déclin (p ​​&lt;0,01) dans les tissus infectés par comparaison à un tissu non infecté, réitérant plusieurs grappes dans le tissu infecté. Vert - M. GFP de la tuberculose, Rouge - monocytes PKH26-étiquetés, Bleu - noyaux cellulaires, Scale -. 100 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Un modèle de tissu 3D Poumon humain pour les études fonctionnelles sur<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

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JoVE Journal

Immunology and Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

18.7K vues.  Linköping University. Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.