The authors acknowledge the Microscopy core facility at the Faculty of Health Sciences, Link&#246;ping University for providing access to advanced imaging systems; Karl-Eric Magnusson (Emeritus Scientist) at the Dept. of Clinical and Experimental Medicine, Link&#246;ping University for providing access to Imaris 3D/4D image processing software (Bitplane, Switzerland); and S. Braian for his help with the lung model cartoon. This work was supported by funds from the Swedish Research Council (Alternatives to animal research, 2012-1951) and Swedish Research Council (2012-3349) to M.L. and Swedish Foundation for Strategic Research to S.B. S.B. receive grants from the Karolinska Institutet, Swedish Research Council, the Swedish International Development Cooperation Agency (Sida) and the Swedish Civil Contingencies Agency (MSB), and the Swedish Heart and Lung Foundation (HLF). M.S. received grants from the Karolinska Institutet and Stockholm County Council.

Nota: sangue periférico humano de dadores de sangue saudáveis ​​anónimos comprados no banco de sangue do Hospital Universitário de Linköping, na Suécia foi usado como fonte de células do sistema imunológico para este estudo. Este protocolo é concebido para inserções 24 mm de placa de 6 poços. Adaptação direta para outros formatos assim não é recomendada uma vez que os contratos-tipo de tecido vertical e horizontalmente durante o desenvolvimento. 1. Preparação de Materiais, Mídia e Cultura de Bactérias / Linhas Celulares <ol><li> Cultura de bactérias: <ol><li> Crescer a estirpe micobacteriana M. tuberculosis H37Rv portadora do plasmídeo pFPV2 para expressar constitutivamente proteína fluorescente verde (GFP), em meio Middlebrook 7H9 contendo 0,05% de Tween-80, 0,5% de glicerol, canamicina (20 ug / ml), e suplementado com Middlebrook albumina, dextrose e catalase enriquecimento ( Middlebrook ADC), a 37 ° C com 5% de CO 2, durante 7-10 dias. Nota: Todos etapa experimentals envolvendo vivo virulenta M. estirpes de tuberculose deve ser realizado numa instalação de NBS-3. </li></ol></li><li> Prepare Meio de Eagle Modificado (DMEM) completo de 1x Dulbecco (suplementado com piruvato a 1 mM de sódio, 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, HEPES 10 mM, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais e 10 % de calor-inactivado soro fetal de bovino (FBS)). Prepare também DMEM meio completo antibiótico-livre. </li><li> Prepare 1x Medium (MEM), meio completo Essencial Mínimo (piruvato de sódio 1 mM, 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 10 mM de HEPES, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais e 10% de calor inactivado soro fetal bovino (FBS)). </li><li> Preparação de fibronectina / frascos revestidos com colagénio (total de 10 ml): <ol><li> Pipetar 8,8 ml de fosfato de 1x estéril soro fisiológico tamponado (PBS) para um tubo limpo. Adicionar 1 ml de albumina de soro bovino (1 mg / ml), 100 ul de tipo I bovino colagénio (3 mg / ml) e 100 ul recombinante Huhomem fibronectina (1 mg / mL). </li><li> Misture a solução, rodando o tubo de cabeça para baixo 5 vezes. Os frascos são revestidos com uma solução de fibronectina / colagénio (1 ml para um T-25 e 2 ml para um frasco T-75). Deixe-O / N a 37 ° C. Após a incubação, a solução de remover e armazenar os frascos revestidos à TA. Nota: A solução recolhida pode ser armazenada a 4 ° C e reutilizada por três vezes. Armazenamento por mais de 2 semanas, pode fazer com que o líquido a ficar acastanhada (formação de cristais), em que sobre ela deve ser descartada. </li></ol></li><li> Cultura de fibroblastos: <ol><li> Crescer e manter células MRC-5 (uma linha de células de fibroblasto de pulmão humano derivadas de tecido pulmonar normal de 14 semanas de idade feto masculino), em DMEM completo em 5% de CO2 a 37 ° C. Use os fibroblastos em passagens 24-26 e crescer até 70-80% confluentes. Nota: MRC-5 na linha de células de passagem&gt; 30 tendem a perder a morfologia e não é recomendado para utilização no modelo de tecido. </li></ol></li><li> Cultura de células epiteliais:<ol><li> Obter 16HBE14o- (16HBE), uma linha celular imortalizada humana brônquica epitelial que mantém a morfologia diferenciada e função do epitélio das vias aéreas normais humana, (este foi um presente do Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, da Universidade da Califórnia, em San Fransisco , EUA. 10). Cultura de células em fibronectina 16HBE / frascos revestidos com colagénio e manter as células em meio MEM completo em 5% de CO2 a 37 ° C. </li></ol></li><li> Preparação de 5x DMEM <ol><li> Prepare 5x DMEM por dissolução de 13,4 g de DMEM em pó e 3,7 g de bicarbonato de sódio em 150 ml de água destilada estéril. Ajustar o pH do meio para 7,3, perfazer o volume de 200 ml e filtrá-la usando 0,22 um filtro de membrana. Recolhe-se o meio filtrado em um recipiente estéril e armazenado até à sua utilização, à TA. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de colagénio fibroblastos embebidos- <ol><li> Alíquotas congeladas Thaw de FBS e L-glutamina em um 37 ° C banho de água.Após descongelação manter as amostras em gelo. Coloque bicarbonato de sódio (71,2 mg / mL) e gentamicina (50 mg / ml) a 4 ° C. Pré-cool 50 ml de tubos de centrífuga de 10 ml e pipetas estéreis a 4 ° C. Nota: Todos os materiais utilizados (excepto o 5x DMEM) são arrefecidas em gelo antes do uso e todos os passos são realizados em gelo. O colagénio bovino tipo I (1,1 mg / mL) deve ser mantido frio, tal como este evita a solidificação de colagénio. </li><li> Preparar as células de fibroblasto: <ol><li> Tripsina quente em um banho de água ° C e incubar 37 quantidade suficiente com fibroblastos de pulmão (MRC-5), as células durante 10 min a 5% de CO2 a 37 ° C. Neutraliza-se a tripsina por adição de 1x DMEM completo. Aspirar a suspensão celular e centrifugue a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 2,3 x 10 5 células / ml em DMEM completo. Colocar as células em gelo até pronto para ser utilizado. </li></ol></li><li> Prepara-se o pré-mistura: <ol><li> Adicionar o seguinte a um tubo rotulado &quot;pré-mistura&quot;; 395ul de 5x de DMEM, 40 mL de L-Glutamina, 120 uL de NaHCO3 (71,2 mg / ml), 440 ul de FBS, 5 uL de gentamicina (50 mg / ml), Volume total de 1.000 ul, em seguida, agita-se o pré-misturar bem e colocar gelo. Nota: Os volumes indicados são para um 24 de mm de 6 poços inserção de cultura. Calcule os valores específicos necessários para o número total de inserções mas adicionar um extra para ter certeza, o suficiente de pré-mistura é preparada. </li></ol></li><li> Prepare a mistura de colágeno acelular: <ol><li> Para cada cultura adicionar 1 ml de mistura de colágeno acelular. Adicione o seguinte para um tubo cônico de 50 ml no gelo na ordem dada; 686 ul de 1,1 mg / ml de colagénio, 250 ul de pré-mistura e 64 ul de 1x DMEM completo para um volume total de 1000 ul. Misture a solução assim garantir a ausência de bolhas de ar. Trabalho rápido e adicionar o colagénio na parede do tubo para evitar bolhas de ar. </li><li> Adicionar 1 ml da mistura da camada acelular para o inserto colocado na placa de 6 poços. Não adicione qualquer meio para o bem do lado de fora da inserção. DentroCubate durante 30 minutos num banho a 37 ° C incubadora. Certifique-se a mistura acelular cobre toda a inserção sem quaisquer bolhas de ar. </li></ol></li><li> Prepare a mistura de colagénio celular: <ol><li> Misture os componentes da camada celular em um tubo de 50 ml mantido em gelo na seguinte ordem; 2 ml de colágeno, 615 mL de pré-mistura, 58 ul de 1x DMEM completo e 327 ul de suspensão de células de fibroblastos de pulmão (MRC-5) para compensar o volume total de 3.000 l. Cada cultura requer 3 ml de mistura de colagénio celular. Passo crítico: Certifique-se de misturar o colágeno e pré-mistura cuidadosamente antes da adição da suspensão celular. Isto irá neutralizar o pH do colagénio para evitar efeitos tóxicos sobre os fibroblastos. </li><li> Adicionar a camada celular (3 ml) no topo da camada de colagénio acelular e incubar durante 2 horas num banho a 37 ° C incubadora. Trabalho rápido e adicionar o colagénio na parede do tubo para evitar bolhas de ar. </li><li> Na sequência de polimerização, adicionar 2 ml de DMEM completo para tele parte inferior da placa de 6 poços (sob a inserção) e incuba-se durante 24 h. NOTA: Se não ocorreu polimerização, descartar as inserções placa contendo a matriz de colagénio e fibroblastos-start-outra vez. A causa mais provável é um erro na adição ou volume incorrecta de um dos reagentes acima mencionados. </li></ol></li></ol> 3. Cultura contínua da Matriz de fibroblastos de colágeno- <ol><li> Levantar cuidadosamente a inserção utilizando um fórceps limpas e aspirar o meio de cultura a partir do fundo do poço. Adicionar 2 ml de DMEM completo para o fundo do poço, seguido por 2 ml de DMEM completo no interior da inserção. Evitar a introdução de bolhas de ar sob a inserção, porque isso vai impedir a difusão de nutrientes entre as câmaras exteriores e interiores. Remova as bolhas de ar com uma ponta de micropipeta. </li><li> Alterar o meio de cultura (dentro e abaixo da inserção) a cada dois dias e cultura para cerca de 5-7 dias. Tome cuidado ao remover a mídia a partir da inserção. Para evitar Contact com a matriz de fibroblastos-colágeno, incline levemente a inserção utilizando uma limpa de fórceps e aspirar a mídia a partir das paredes de inserção. Passo crítico: Os fibroblastos na matriz de colágeno deve obter um fenótipo alongada e remodelar o colágeno, que então contratos. Em cerca de 5-7 dias, a matriz contraiu para formar uma plataforma (10-14 mm de diâmetro) no centro do inserto. A matriz é contraído pronto para utilização no passo seguinte. Para obter uma contracção uniforme da matriz é essencial que os fibroblastos são bem misturados com o colagénio antes da sementeira (Passo 2.6.1). </li></ol> 4. Sementeira de células imunes (Infected Uninfected monócitos-macrófagos Mistura /) Nota: Os seguintes passos experimentais envolvem micobactérias virulentas e, portanto, deve ser realizada em uma facilidade BSL-3. <ol><li> Preparação de monócitos e macrófagos primários: <ol><li> Isolar monócitos do sangue periférico a partir de sangue de doadores utilizando um estabederramado protocolo. Isolar monitos no mesmo dia que a configuração do modelo de cultura de tecidos e diferenciá-los e em macrófagos durante aproximadamente 7 dias antes da infecção com M. tuberculose. NOTA: Isso irá garantir tanto os macrófagos e a matriz de colagénio de fibroblastos-contratados estão disponíveis após 7 dias. Também isolar monócitos frescos que serão adicionados em conjunto com os macrófagos infectados. </li></ol></li><li> Preparação de M. tuberculose infectados por macrófagos <ol><li> Colher as bactérias cultivadas, lava-se com 1x de PBS contendo 0,05% de Tween-80, ressuspender em DMEM completo antibiótico livre, passar através de uma estéril truncada agulha G 27 para dispersar aglomerados bacterianas e medir a densidade óptica. Nota: Pré-determinar a M. tuberculose colónia formando unidades equivalentes de densidade óptica no laboratório. Isto irá dar uma estimativa do número de bactérias a ser utilizado para a infecção. </li><li> Incubar os macrófagos durante 4 horas com &lt;em&gt; M. tuberculose, a multiplicidade de infecção (MOI) de 10). Após a infecção, lavar 3x com 1x PBS para remover as bactérias extracelulares. Use macrófagos não infectados cultivadas na mesma maneira mas sem M. tuberculose, como controlos. </li><li> Separar os macrófagos da placa de cultura por tratamento com EDTA a 2 mM durante 10 min a 37 ° C e ressuspenderam-se as células em meio isento de antibiótico DMEM completo. </li></ol></li><li> Rotulagem de monócitos Nota: Isolamento e rotulagem de monócitos pode ser realizada na BSL-2 bancada e, em seguida, tomado em BSL-3 instalações para processamento adicional. <ol><li> Mancha monócitos preparados de fresco (2 x 10 7 células) com uma concentração final de 2 fiM PKH26 corante vermelho durante 5 min, de acordo com as instruções do fabricante. Lavar 3x e ressuspender as células com DMEM isento de antibiótico completo a uma densidade de 1 x 10 7 células / ml. </li></ol></li><li> A adição de células do sistema imunológico para fibroblastos-Matriz de Colagénio <ol><li> UMAepois de 5-7 dias de cultura da matriz de fibroblastos-colágeno, aspirar o meio de cultura das câmaras exteriores e interiores e adicionar 1,5 ml de DMEM fresco antibiótico-livre completo para a câmara exterior. </li><li> Prepara-se uma monócitos-macrófagos marcado (infectados não infectados /) mistura com um rácio de MO: MQ (5: 1) em 50 ul de DMEM completo. Para 50.000 macrófagos, monócitos tomar 250.000 rotulados. </li><li> Adicionar 50 ul MO: MQ mistura com a matriz de colagénio e fibroblastos-incubar durante 1 hora em 5% de CO2 a 37 ° C. Após a incubação, adicionar cuidadosamente 2 ml de meio de cultura para a inserção e incubar durante mais 24 horas adicionais em 5% de CO2 a 37 ° C. Nota: medida que as células são adicionadas frouxamente ligado, além dos meios de comunicação deve ser lento, adicionando suavemente sobre as paredes da inserção. </li></ol></li></ol> 5. Plantio de pulmão células epiteliais (16HBE) Nota: As seguintes etapas devem ser executadas em uma facilidade BSL-3. <ol><li> Semente de pulmão ecélulas pithelial (16HBE) em cima do MO:-MQ-de fibroblastos de colágeno camada. Para realizar isto, primeiro dissociar 16HBE células a partir do balão por tratamento com tripsina (como em 2.2.1.) E ressuspender a 4 x 10 6 células / ml em DMEM isento de antibiótico. </li><li> Aspirar o meio de cultura dentro e fora da inserção. Em seguida, adicionar 1,5 ml de DMEM isento de antibiótico completa no fundo do poço do lado de fora do inserto. </li><li> Adicionar 50 ul de 16HBE no topo da matriz de colagénio imune celular de fibroblastos. Deixar durante 2 min na tampa e incubar durante 1 h em 37 ° C incubadora com 5% de CO 2. Após a incubação, adicionar suavemente 2 ml de DMEM isento de antibiótico completa no interior da inserção e cultura a 37 ° C durante 3 dias. O passo de cultura facilita a proliferação de células epiteliais no tecido modelo. Nota: Como as células adicionados são frouxamente ligados, além dos meios de comunicação deve ser lenta e suave, deslizando pelas paredes da inserção. </li></ol> 6. Air-exposição do Pulmão 3DModelo Nota: Depois de 5 dias após a adição de macrófagos infectados, os modelos de tecido são expostos ao ar e as seguintes etapas devem ser executadas em uma facilidade BSL-3. <ol><li> Aspirar o meio de cultura dentro e fora da inserção. Nota: Neste passo sobrenadantes podem ser recolhidos para a detecção de factores secretados. Centrífuga, estéril-filtro e armazenar sobrenadantes a -70 ° C. </li><li> Adicionar 1,8 ml de DMEM isento de antibiótico completas na câmara exterior e incubar em 5% de CO2 a 37 ° C incubadora durante 2 dias. Não adicione mídia de cultura dentro da inserção. NOTA: Ar-levantamento do modelo de tecido facilita a formação de epitélio estratificado e a secreção de muco, que fornece a força para o tecido e semelhança fisiológica para tecido pulmonar humano. </li></ol> 7. Colheita e Montagem do modelo de tecido pulmonar 3D Nota: As seguintes etapas devem ser executadas em uma facilidade BSL-3.<ol><li> No dia 7 pós-implantação de macrófagos infectados, os modelos de tecido estão prontos para a colheita. Retire os meios de cultura inteiramente a partir do modelo de tecido. Corrigir o modelo de tecido com 4% de paraformaldeído durante 30 min no escuro à temperatura ambiente. Este passo mata as bactérias e fixa a morfologia do tecido / célula para processamento adicional. </li><li> Utilizando um escalpelo, separar a membrana do poço de inserção. Transferir a membrana contendo o tecido a um poço contendo 1x PBS. </li><li> Cortar e remover os lados do modelo de tecido usando um bisturi limpa. Em seguida, corte o modelo de tecido em 4 pedaços quadrados aproximadamente iguais. Transferir uma peça de tecido para uma lâmina de vidro SuperFrost. Armazenar os pedaços de tecido em 1x PBS a 4 ° C. </li><li> Seque o tecido para 5 min e montar usando prolongar Ouro antifade com DAPI e lamela. Deixe os slides sem perturbar no escuro à temperatura ambiente até secar. Nota: A espessura do tecido pode variar entre o centro e a periferia, causando ligeira tilting da lamela. Para evitar isto, um espaçador (por exemplo parafilme) pode ser colocado no canto da lâmina de cobertura. </li><li> Aplique unha polonês para as bordas da lamela e deixe-a secar. Mergulhe as lâminas em etanol a 70% para torná-las seguras para trazer para fora das instalações BSL-3. </li></ol> 8. Visualization, Aquisição e Análise Quantitativa 3D <ol><li> Visualizar as lâminas de tecido, utilizando um sistema de microscópio confocal com laser emitindo a 488 nm para a excitação de GFP (canal verde), 420 nm para DAPI (azul) e 555 nm para os monócitos marcados PKH26 (vermelho), respectivamente. </li><li> Adquirir imagens 3D em uma resolução 512x512 com Z-stacks cobrindo com um mínimo de espessura de 20 mm e com 1-1,5 mm separação entre pilhas. Adquirir 5-10 campos diferentes que abrangem toda a peça de tecido. Nota: Use a configuração, como Nyqvist para ajustes ideais de resolução óptica (comprimento de onda, laser poder / exposição, tamanho do pixel e zoom). Evite under ou mais de saturação de pixels. </li><li> Analisar as imagens confocal com software de processamento de imagem em 3D. Para a quantificação 3D de agrupamentos de células, os passos que se seguem são recomendados para análise óptima. </li><li> Abra o software de processamento de imagem 3D e carregar a imagem. Medem-se as dimensões dos objectos a serem analisados ​​na imagem, por exemplo, do tamanho de um núcleo, monócitos individual e bactérias individuais. Estas observações são úteis para a definição ou filtrando os objectos. </li><li> Usando uma ferramenta de ajuste de exposição, otimizar renderização de volume, ajustando cada canal para o contraste da imagem, brilho e opacidade misturar. Este passo é o de minimizar a interferência de ruído no processamento de volume. Nota: correção Gamma pode levar à manipulação de imagens e, portanto, deve ser evitado. </li><li> Criar superfícies por escolher o canal vermelho (monócitos) e definir o limite (seleção automática ou manual). Se necessário, usar filtros para restringir a selecção de monócitos vermelhos ou excluir a background. Da mesma forma, criar superfícies para verde (M. tuberculosis) e azul (núcleos) canais como descrito acima. </li><li> Exportar os dados para arquivos do MS-Excel. É possível exportar um parâmetro específico ou todos os dados. Os parâmetros que são relevantes para a análise de agrupamento de células são em volume, intensidade, número de objetos, número de voxels e esfericidade. </li><li> Salvar e exportar as imagens em um formato de imagem adequado, de preferência TIFF. NOTA: As animações também podem ser feitas usando o menu de animação e salva como um arquivo de mídia. </li><li> Salve as configurações de análise de cada canal usando a opção Add parâmetros e pode ser recuperada posteriormente usando a função Rebuild. Simultaneamente analisar mais arquivos usando a ferramenta de processamento em lote. Nota: Todas as imagens a serem comparados devem ser adquiridos, processadas e analisadas do mesmo modo. Por exemplo uma imagem de 8 bits (256 integer) não devem ser comparados de uma imagem de 12 bits (4096 inteiro) com. </li></ol>

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+neutralization+results+in+disseminated+disease+in+acute+and+latent+Mycobacterium+tuberculosis+infection+with+normal+granuloma+structure+in+a+cynomolgus+macaque+model.">Tumor necrosis factor neutralization results in disseminated disease in acute and latent Mycobacterium tuberculosis infection with normal granuloma structure in a cynomolgus macaque model.</a> Arthritis Rheum. 62, 340-350 (2010).</li><li>Rahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+immune+responses+in+human+tuberculosis:+few+CD8++effector+T+cells+but+elevated+levels+of+FoxP3++regulatory+t+cells+in+the+granulomatous+lesions.">Compartmentalization of immune responses in human tuberculosis: few CD8+ effector T cells but elevated levels of FoxP3+ regulatory t cells in the granulomatous lesions.</a> Am J Pathol. 174, 2211-2224 (2009).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

The ability to recruit and form organized cell clusters at the site of infection is the hallmark of human TB 11. These dynamic structures known as tubercle granulomas primarily consist of immune cells (macrophages, monocytes, T-cells and B-cells) and multi-nucleated giant cells surrounding M. tuberculosis. The role of the granuloma has long been considered to wall off the infection, preventing local spread of bacteria. However, more recent studies show that granuloma formation is critical for early bacterial survival, growth and dissemination 12. A strategy of new studies is to identify molecules or pathways that could efficiently be targeted to inhibit the cellular migration in granuloma formation and/or TB dissemination. 
A caveat for novel studies on TB is the lack of models that recapitulate human TB. The most widely used experimental animals do not form true granuloma upon M. tuberculosis infection, and are therefore not appropriate choices for studies of TB 13-16. Non-human primates have the closest resemblance to human TB 17, but are not the preferred choice owing to high operational costs and ethical issues. Human TB is a complex immunological process and is difficult to model in vitro. Cell cultures of monolayers or co-cultures lack the 3D environment and tissue responses. Therefore, we have developed an innovative lung tissue model based on human primary immune cells and human lung-specific cell lines 8,9. The model displays characteristic features of human lung tissue, including epithelia with evenly integrated macrophages, formation of extracellular matrix, stratified epithelia and mucus secretion 9. 
The 3D human lung tissue model has several benefits over the in vitro single or co-cultures seeded on tissue culture plates or transwell inserts. First, the human lung-specific cells (fibroblasts and epithelial cells) are not commonly included in the in vitro single or co-cultures. Second, the immune cells and lung-specific cells are embedded in a 3D physiological context (collagen rich extra-cellular matrix products). The response of cells to a stimulus/infection and the migratory behaviour of cells, for instance formation of a granuloma, differ significantly between a 2D and 3D environment. Furthermore, the described method enables the 3D visualization and robust 3D quantitative analysis that provides pivotal information on spatial distribution and intricate cellular interactions. 
Experimental infection in the model tissue with M. tuberculosis resulted in clustering of macrophages at the site of infection, reminiscent of early TB granuloma (Figure 2 and 3). We have recently demonstrated that mutant strains defective in the ability to secrete the virulence factor ESAT-6 or Mycobacterium bovis BCG that lacks ESAT-6 did not induce the clustering of monocytes (no early granuloma), in contrast to the virulent M. tuberculosis 9. These data are consistent with the observations made from Mycobacterium marinum-infected zebrafish embryos, whose transparency allows for elegant live imaging of granuloma formation 12. As there is no gold-standard model for TB, we took advantage of the surgically resected tissue biopsies from TB patients for validation of the method 9. Our in vitro tissue model shares several characteristics with the lung and lymph node biopsies from TB patients, including the aggregation of macrophages in granuloma, the presence of both intra- and extracellular bacteria 18 and induction of necrosis 11. 
Although the described model has physiological relevance to human TB and has several advantages over other in vitro models, it has some limitations. For instance, out of more than 20 collagen proteins identified in humans, only type I is included to the model to mimic the extra-cellular matrix. However, type I collagen is a complex mixture of extra-cellular matrix products and is the most abundant collagen in the human body. Further, we have demonstrated the presence of collagen IV and several extra-cellular matrix proteins such as tropoelastin, vimentin and laminin, which are produced by the epithelial cells and fibroblasts in the tissue model, indicating the synthesis of new collagen 8. Presently, the lung tissue model only has monocytes and macrophages, besides lung-specific cells. It lacks neutrophils and lymphocytes that are also known to be present in the granuloma. Remarkably the model is not limited to the introduction of additional immune cells and is of interest to explore how they contribute to the complex cellular interactions in human TB. Implantation of primary alveolar macrophages, skin-specific cells and lung carcinoma cells has already been tested in the model. Since our objective was to use a model that closely resembles human TB, introduction of mouse cells have not been attempted.
In summary, the lung tissue model has implications for both basic mechanistic and applied studies. Potential applications of the lung model include the study of innate immunity, investigating mechanistic aspects of host defences such as phagosomal maturation, autophagy, production of cytokines, chemokines and anti-microbial peptides, and functional characterization of individual cell types. Strikingly, the in vitro tissue model allows manipulation of one or more cells types and provides a relevant tissue micro-environment, not only for studies on TB, but for a variety of infectious and non-infectious diseases that affect the lungs.

Nos seres humanos, as respostas à infecção, inflamação do tecido, recrutamento celular, remodelamento tecidual e regulação da homeostase do tecido são eventos complexos que envolvem diferentes tipos de células. Assim, estes processos são melhor estudada no ambiente de tecido local. Anteriormente, esta tem sido possível principalmente em modelos animais experimentais. No entanto, os animais experimentais utilizados conter muitos limites como respondem frequentemente de agentes patogénicos de um modo diferente do que os seres humanos e também exibir um curso diferente da doença 1. Um modelo humano in vitro tecido pulmonar mantém a possibilidade de estudar as respostas imunitárias específicas do pulmão humano. Infecção por tuberculose humana (TB) é uma doença que afecta principalmente os pulmões. Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), o agente causador da tuberculose, atinge o pulmão através de gotículas de aerossol que são transportadas para o espaço alveolar, onde as bactérias são engolidos por dendri pulmonarcélulas de tiques e macrófagos alveolares como parte da resposta imune inata a infecção 2,3. Fagocitose do patógeno leva à compartimentação do bug dentro de um phagosome e, idealmente, resulta na neutralização e assassinato do patógeno pelo fagócitos. Até 50% de indivíduos expostos a M. tuberculose são acreditados para ser capaz de eliminar a infecção por meio da resposta imune inata 4. Outros resultados de infecção são apuramento pelo sistema imunológico adaptativo, numa fase posterior, a infecção latente ou no pior dos casos doença crónica activa 5. Anteriormente, não houve modelos in vitro de tecidos para estudos de tuberculose humana. Culturas de células individuais de macrófagos humanos ou outras células de sangue periférico foram frequentemente utilizados 6,7. A desvantagem desta abordagem é que eles não podem reflectir a dinâmica de diferentes tipos de células que operam em conjunto num tecido pulmonar exposto a M. tuberculose </em&gt;. Assim, existe uma necessidade para um modelo in vitro para ser capaz de realizar estudos funcionais e mecanísticos sobre a tuberculose. O modelo in vitro de tecido de pulmão humano aqui descrita com base nas células foi originalmente criada pelo nosso grupo de estudos sobre as funções das células dendríticas 8. Temos adaptado este método para o estudo dos TB. O modelo de tecido de pulmão humano aqui apresentada é constituída por células epiteliais e fibroblastos 8 específicos de tecidos. Estas células são cultivadas numa matriz de colagénio no topo de uma membrana porosa Transwell em uma inserção de estruturas e formas semelhantes tecido de pulmão humano normal (Figura 1). Quando exposto ao ar as células começam a segregar muco no lado apical 8. Através da implantação de macrófagos primários humanos infectados com M. tuberculose com o modelo, observou-se a forma como as células do sistema imunológico migrar no tecido e formam fases iniciais de granulomas 9 TB. Este é o primeiro modelo de tecido humano described para TB e representa uma ferramenta promissora para o estudo da resposta imune inata a TB e outras doenças do pulmão. Até à data, utilizou-se apenas monócitos e macrófagos como células do sistema imunológico no modelo, mas o nível de complexidade pode ser aumentada por inclusão de tipos de células relevantes adicionais. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama esquemático do contorno modelo de tecido de pulmão. (A) O modelo é composto de células epiteliais pulmonares humanas específicas do, M. tuberculose infectados com macrófagos primários e corante vermelho monócitos marcados semeados em colágeno incorporado fibroblastos preparado com um filtro transwell. Exposição do modelo de tecido de ar inicia a produção de proteínas da matriz extra-celular, a secreção de muco e estratificação pelo epitélio. O modelo de tecido 3D assim desenvolvido é uma ferramenta útil para estudar M. infecção por tuberculose em um ambiente que closely se assemelha a um pulmão humano. (B) imagens microscópicas representativas das diferentes etapas na preparação do modelo de tecido. (C) estrutura completa da secção de tecido do modelo de pulmão. Scale -. 100 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC-5 cells, lung fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATCC#CCL-171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16HBE cells, lung epithelial cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco, USA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 x Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (5 x DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-082</td>
			<td>Made from powder but add 5 times less water. Adjust pH to 7.3 and filter it using a 0.2 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium with glucose (DMEM) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM) 1x with Earle&#8217;s salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids Solution, 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3 (71.2 mg/ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Heat inactivated for 30 min, 56 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes buffer solution 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (Pen Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield</td>
			<td>7801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure 0.5 M EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Collagen PA treated (500 ml)</td>
			<td>Organogenesis</td>
			<td>200-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure col purified Bovine Collagen solution (100 ml)</td>
			<td>Advanced biomatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix protein, Fibronectin (1 mg)</td>
			<td>BD</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human monocytes/macrophages</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Isolated from human whole blood or buffy coats.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red fluorescent cell linker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MINI26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37Rv expressing green fluorescent protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M. tuberculosis H37Rv wild type was transformed with the pFPV2 plasmid constitutively expressing GFP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 medium&#160;</td>
			<td>Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook ADC Enrichment</td>
			<td>BBL</td>
			<td>211887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin B sulfate (20 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold anti=-fade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMaris Scientific 3D/4D image processing software, version 7.6.8</td>
			<td>Bitplane AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3d human lung tissue model for functional studies on mycobacterium tuberculosis infection

A tuberculose (TB) ainda mantém uma grande ameaça para a saúde das pessoas em todo o mundo, e há uma necessidade de modelos de custo-eficiente, mas de confiança para nos ajudar a compreender os mecanismos da doença e avançar as descobertas de novas opções de tratamento. Culturas celulares in vitro de monocamadas ou co-culturas falta o ambiente tridimensional (3D) e as respostas dos tecidos. Descrevemos um inovador modelo in vitro de um tecido de pulmão humano, o que é uma promessa para ser uma ferramenta eficaz para o estudo dos complexos eventos que ocorrem durante a infecção com Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). O modelo de tecido 3D consiste em células epiteliais e fibroblastos específicos de tecido, que são cultivadas numa matriz de colagénio no topo de uma membrana porosa. Após a exposição ao ar, as células epiteliais estratificar e secretam muco no lado apical. Com a introdução de macrófagos primários humanos infectados com M. tuberculose para o modo de tecidol, que têm demonstrado que as células imunes migram para o tecido infectado e formar fases iniciais de granuloma TB. Estas estruturas recapitular a característica distinta da tuberculose humana, o granuloma, que é fundamentalmente diferente ou não comummente observadas em modelos animais experimentais utilizados. Este método de cultura organotípicas permite a visualização 3D e análise quantitativa robusta que fornece informação fundamental sobre as características espaciais e temporais de interações celulares patógeno-hospedeiro. Tomados em conjunto, o modelo de tecido de pulmão proporciona um micro-ambiente fisiologicamente relevante tecidos para estudos sobre a tuberculose. Assim, o modelo de tecido pulmonar tem implicações potenciais para ambos os estudos mecanicistas e aplicadas básicas. Mais importante, o modelo permite a adição ou a manipulação de tipos de células individuais, que, assim, alarga o seu uso para modelar uma variedade de doenças infecciosas que afectam os pulmões.

Um modelo de tecido pulmonar 3D para TB humano pode ser efetivamente usado para estudar as interações patógeno-hospedeiro em M. infecção por tuberculose. Os passos básicos do presente método, imagens representativas microscópicas de diferentes etapas e uma estrutura microscópica geral de uma secção de tecido são apresentadas na Figura 1. O modelo tem vários componentes de tecido de pulmão humano, incluindo os fibroblastos de pulmão, células epiteliais brônquicas e monócitos primários / macróf agos incorporados no ambiente de tecido 3D. Além disso a incorporação de componentes de tecido de pulmão humano, o modelo se assemelha condições fisiológicas ou seja, a estratificação de epitélios e secreção de muco. Um exemplo para a utilização do modelo de tecido pulmonar no controlo de uma infecção de tuberculose é apresentado na Figura 2. Para visualizar a M. tuberculose migração celular -immune e interação, introduzimos macrófagos infectados com M. tuberculose que expressam GFP(verde), juntamente com os monócitos marcados com PKH26 isoladas de fresco (vermelho) para o modelo de tecido (azul, DAPI coradas para núcleos). No dia 7 pós adição de M. células infectadas com tuberculose para o modelo de tecido, microscopia confocal revela agregação de monócitos vermelhos no local da infecção (verde) (Figura 2), que imita as lesões da indicação de tuberculose humana 9. Uma série de imagens representativas para visualização 3D de M. tuberculose infectados pelo modelo de tecido e quantificação de grupos de células é mostrada na Figura 3. A visualização 3D proporciona a flexibilidade do usuário para interagir, analisar e quantificar vários recursos em uma imagem 3D. O arranjo espacial de bactérias verdes e vermelhas aglomerados de monócitos pode ser visto a partir do plano apical, rotacional e lateral tal como ilustrado na Figura 3B, o que revela a agregação de monócitos no local da M. Os aglomerados de tuberculose. não foram observido em tecidos não infectados (Figura 3A). Foram quantificados o tamanho e número de aglomerados de células de monócitos e descobriram que o tamanho (volume) de agrupamentos de células é aumentada (p &lt;0,001), enquanto o número de monócitos individuais diminuiu (P &lt;0,01) em M. tuberculose tecidos infectados em comparação com tecidos não infectados modelos (Figura 3C e 3D). Estes dados valida a nossa conclusão anterior de formação de granulomas no início M. infecção tuberculose observada em modelos de tecido pulmonar analisados ​​em secções de tecido 2D 9. Nossos dados sugerem que o modelo de tecido proporciona um habitat natural 3D para investigar o anfitrião complexo CÉLULA M. rede de comunicação tuberculose. Descobrimos também que a visualização 3D e análise quantitativa são as melhores ferramentas para estudar as características do modelo de tecido (Figura 3). Quantificação de um conjunto de células (granuloma por exemplo) muitas vezes stretc<html> hes a várias camadas de células e pode ser completamente capturado por uma análise quantitativa 3D. Além disso, a visualização de recursos espaciais e temporais exatas de células individuais ou bactérias no modelo permitem live-imagiologia, de migração e de rastreamento de estudos em um laboratório designado. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig2.jpg" /> Figura 2. Monocyte no cluster modelo de tecido em torno virulenta M. tuberculose. imagens confocal representativos de não infectado e M. tuberculose modelo de tecido infectado é apresentado. Painéis de verde (GFP M. a tuberculose), vermelho (monócitos marcados com PKH26), azul (núcleos corados DAPI) e canais fundidos mostrar o recrutamento de monócitos no tecido infectado, em comparação com tecidos não infectados. Escala - 100 um.large.jpg &quot;style =&quot; font-size: 14px; line-height: 28px; &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig3.jpg" /> Figura 3. visualização 3D e análise quantitativa do modelo de tecido de fornecer informações úteis. Imagens representativas de visualização 3D do modelo de tecido inteiro (A) de tecido não infectadas, (B) infectadas com M. tuberculose, através de seccionamento óptico usando Zeiss LSM700 microscópio confocal e análise quantitativa por software de processamento de imagem Imaris (versão 7.6.8). Estas imagens foram adquiridas com ampliação de 20x, 14 z-pilhas que cobrem uma espessura do tecido de 19,5 um, com 1,5 um intervalo, permitindo a visualização de apical, horizontal de rotação, vista de rotação vertical e lateral (A e B). (C) melhoanálise ntitative de grupos de células de monócitos revelam melhorado (p &lt;0,0001) o tamanho dos clusters granuloma cedo depois M. infecção por tuberculose, quando comparado com a ausência de infecção. (D) Quantificação do número de monócitos mostraram um declínio (p &lt;0,01) em tecidos infectados em comparação com tecido não infectado, repetindo mais clusters no tecido infectado. Green - M. -GFP tuberculose, Red - monócitos PKH26 marcados, azul - núcleos celulares, Scale -. 100 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Um modelo de tecido Pulmão humano 3D para estudos funcionais em<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infecção

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

18.8K visualizações.  Linköping University. Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

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Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Preparação de amostras de<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extractos para Estudos Nucleares metabolômica Ressonância Magnética

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Imunologia e Infecção

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Crescimento de Mycobacterium tuberculosis Biofilmes

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Isolamento de citometria de fluxo de células primárias Murino Tipo II epiteliais alveolares de Estudos funcionais e Molecular

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Um modelo experimental para estudar a Tuberculose-Malária Coinfection sobre Transmissão Natural de Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Demonstrando um multi-resistente<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Ampliação Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

Uma nova abordagem para Microdissecção Recuperando<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; transcritos específicos de formalina fixo Parafina incorporado Lung granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Análise de 18FDG PET-CT Imaging como uma ferramenta para estudar infecção por Mycobacterium tuberculosis e tratamento em primatas não-humanos

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Mycobacterium tuberculosis em camundongos com fluorescência de enzima do repórter de imagem

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Modelagem de tuberculose no Zebrafish adulto infectado de Mycobacterium marinum

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...