This work was supported by National Institutes of Health (NIH) Grant number: NIH P50DC00422 (H.L.); NIH R01DC12058 (H.L.). This work also benefitted from the South Carolina Clinical and Translational Research Institution (SCTR) Clinical and Translational Science Award (NIH/NCRR UL1RR029882). The funders had no role in study design, data collection, and/or analysis. The authors would like to thank Lonnie E. Brown Jr. for his artistic and graphic contributions.

Se llevaron a cabo todos los aspectos de la investigación con animales de acuerdo con las directrices del Comité Institucional Cuidado de Animales y el empleo apropiado. Todos los procedimientos experimentales con animales vertebrados descritos aquí fueron aprobados bajo los lineamientos de la Universidad Médica de Comité (MUSC) Institucional Cuidado de Animales y el empleo de Carolina del Sur (IACUC). Selección 1. Modelo <ol><li> Mantener el modelo animal en un vivero bajo ruido con cuidados de rutina por los protocolos institucionales hasta que esté listo para su uso. En la investigación animal instalaciones (FIA), mantener la estabilidad de las vibraciones, el ruido de amortiguación, la iluminación diurna, el espacio de preparación, acabados superficiales, sellado y calafateo, y ventilación que cumplen con los estándares de NIH. Nota: Institutos Nacionales de Salud (NIH) directrices para ARF y mantenimiento de un vivero bajo nivel de ruido pueden ser revisados ​​en: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/ </li><li> Para todos los experimentos, utilice la oreja derecha como el oído experimental. La oreja izquierda sirve como un control intra-animal y no se ve alterada quirúrgicamente. </li><li> Inspeccione el modelo animal antes de la cirugía para detectar signos de infección del oído medio o externo. Signos potenciales pueden incluir drenaje de líquido o pus del oído, el tejido inflamado pabellón auricular, y / o letargo del animal. Esto es inusual, pero si se ha señalado, evitar la cirugía más allá y tratar al animal adecuadamente. </li></ol> 2. Los procedimientos preoperatorios <ol><li> Anestesiar al animal de 30 min antes de la cirugía y cualquier procedimiento perioperatorias a través de la inyección intra-peritoneal (IP) de ketamina (100 mg / kg IP) y xilazina (20 mg / kg IP). Complementar la anestesia según sea necesario, como se juzga por un reflejo toe-pinch positivo, con una dosis más baja de ketamina (25 mg / kg IP) y xilazina (5 mg / kg IP). Determinar la dosificación en el cumplimiento de los protocolos institucionalmente permitidos para los ratones con la edad los ajustes apropiados de la dosis. </li><li> Compruebe completa sedation del modelo. Compruebe si hay un 3 avión etapa de anestesia para la totalidad del protocolo descrito marcada por una tasa de respiración regular, la falta de reflejo de enderezamiento (en ratones), y la falta de pedal y palpebral (toe-pinch) reflejos. Mantener el animal en este nivel de anestesia. Esto es de suma importancia para la minimización del dolor y el movimiento intraoperatoria, sangrado, y las fugas de fluidos intersticiales durante la cirugía. </li><li> Mantener la temperatura corporal del animal en 37,5 ° C con una almohadilla térmica en bucle cerrado. </li><li> Administrar analgesia a través de la inyección subcutánea de la buprenorfina. Entregar buprenorfina (0,1 mg / kg SQ una vez 30 min antes de la cirugía) como analgesia para minimizar cualquier incomodidad quirúrgica. Base de dosificación y las alternativas adecuadas para el modelo seleccionado en protocolos aprobados institucionalmente. Antibióticos uso no es necesario si una buena técnica aséptica se ha practicado. Los animales reciben analgesia postoperatoria si hay signos de dolor y angustia. </li><li> Realizar phpruebas ysiologic preoperatorio. Realización de pruebas y / o producto de distorsión pruebas de emisiones optoacústica (DPOAE), tanto antes de la cirugía y justo antes auditiva respuesta del tallo cerebral (ABR) a sacrificar el animal sirve como una medida objetiva para el efecto del agente ototóxico elegido en la audición del ratón. </li></ol> 3. Preparación quirúrgica y Posicionamiento <ol><li> Esterilice todos los instrumentos antes de la operación por las normas institucionales. Preparar instrumentos y campo quirúrgico de una manera consistente, estéril, y organizados para evitar esfuerzos innecesarios y el movimiento durante el procedimiento. Instrumentos típicos requieren incluye tijeras de disección afilados, varios pares de pinzas metálicas con puntas de joyero, una recogida otológica, una cureta otológica, y una unidad de electrocauterio bipolar (Figura 1). </li><li> Preparar y esterilizar mechas de papel hechas de labwipes adelantado cortando una pequeña pieza triangular de la toallita (~ 0,7 in x 1.25 in x 1.75 in) y girando firmemente entre el pulgar y el dedo índice de una mano (~ 1,25 in). Creación de una mecha bien trenzado, extremadamente delgada es de suma importancia para el éxito del procedimiento. Preparar un total de 15-20 mechas antes de la cirugía (Figura 2). </li><li> Use un taladro dental para perforar rápidamente el hueso de la bulla timpánica de una manera controlada. El uso de un taladro de mano dental accionado por correa con una punta de 1 o 2 mm cónica es preferible. Un microscopio operatorio es necesario para completar el protocolo. (ver Paso 4.7) </li><li> Pre-dibujar 0,2 ml de una solución acuosa que contiene el agente ototóxico seleccionado en una jeringa de 1 ml de tuberculina con una, 1/2 &#39;aguja 28 G. Típicamente 1 gota (~ 10 l) del agente es suficiente para llenar completamente el RWN ratón. Un metálico, aguja de la jeringa de punta roma facilita la administración del agente al tiempo que evita daños a estructuras subyacentes por una punta afilada en bisel. Expulsar el aire dentro de la jeringa en forma de burbujas pueden llenar inadvertidamente la RWN y / o prevenir adecuadola aplicación del agente a la propia ventana redonda. </li><li> Retire la piel de la piel de post-auricular utilizando tijeras de aseo eléctricos. Retire la piel en una zona que se extiende desde el pliegue-aurículo cefálica rostral al caudal cintura escapular. Extender la depilación de la dorsal, la línea media sagital al ángulo mandibular lateralmente. La eliminación adecuada de la piel es fundamental para el mantenimiento de un campo quirúrgico limpio y claro. Cepille suavemente recortes de la zona quirúrgica prevista. </li><li> Esterilizar la piel del área preparada por protocolos institucionales. Aplicar betadine (povidona / yodo) alternado con etanol por vía tópica de una manera circular durante 2 min. Otros agentes pueden ser sustituidos por las directrices institucionales. </li><li> Colocar el animal sobre una superficie plana para mantener la posición del cuerpo constante durante el procedimiento. Use una pequeña almohadilla de calentamiento colocado por debajo del cuerpo a la plataforma para controlar la temperatura corporal durante el procedimiento para mantener la temperatura corporal del animal a 36-38ºC. No overheat el animal ya que esto puede conducir a daños en la piel de leve a grave y / o la eutanasia temprano. <ol><li> Asegure la cabeza del animal a través de un aparato de soporte de bloque de mordida / cabeza. Utilizar un 0,5 cm por 2 cm de mordida mecanizada de latón con 2-4 mm de diámetro agujeros perforados a través de él a intervalos de 5 mm a lo largo del eje largo. Abra la boca del animal alrededor de este aparato y adaptarse a los incisivos centrales superiores en uno de los agujeros, dependiendo del tamaño del animal. Apriete suavemente una pequeña pinza sobre el dorso del hocico del animal para mantenerlo en su lugar (Figura 3). </li><li> Confirmar que el soporte del bloque / cabeza bocado está conectado rígidamente al centro de un brazo de articulación en forma de U (Figura 3). Asegure una vara de ancho de 1 cm en el brazo izquierdo de la &quot;U&quot; y el uso de la barra como una cabeza resto de la izquierda (la derecha es siempre la parte dispositiva). </li><li> Una vez firmemente asegurado en el soporte de la cabeza, gire el ratón a una posición de decúbito lateral izquierdo. Coloque el carefu cuerpoLLY en la superficie plana de operación para asegurarse de que será estable durante todo el procedimiento y evitar el estrés torsional indebida en las vértebras cervicales. </li></ol></li><li> Coloque un microscopio quirúrgico capaz de 4x, 10x, y 20x aumentos sobre el campo quirúrgico. Confirmar que el microscopio puede mantener su posición de una manera manos libres, ya que es ideal para el protocolo quirúrgico de dos manos se discute a continuación. </li><li> Coloque una unidad de cauterio bipolar habilitado con pieza de mano fina del joyero de punta en una posición que está inmediatamente disponible para la ayuda en la cauterización de pequeños vasos y la disección de tejidos. Esto también puede ser necesario debe encontró sangrado más abundante. </li></ol> 4. Enfoque Quirúrgico <ol><li> Bajo magnificación microscópica, utilice tijeras afiladas o una hoja de bisturí para crear una incisión retroauricular 1-1,5 cm, aproximadamente 6.8 mm caudal al pliegue auriculocephalic. En el ratón adulto, una incisión en la línea media dorsallateralmente a un punto cerca del ángulo de la mandíbula es adecuado. Evitar cuidadosamente cortando profundamente para preservar las estructuras vasculares subyacentes. </li><li> Llevar a cabo una cuidadosa disección roma a través de la capa de grasa subcutánea que puede ser de espesor variable. La grasa se puede quitar con seguridad si es necesario para una mejor exposición. Tome precaución cuando la disección en una dirección medial-ventral como la vena yugular externa atraviesa esta zona y el daño a esta estructura puede causar grandes cantidades de pérdida de sangre y la inundación del campo quirúrgico. Controlar cualquier sangrado excesivo con las esponjas de gelatina absorbible y / o pellets de algodón. Utilice cauterio bipolar para un sangrado más abundante. </li><li> Una vez que la capa de grasa se divide correctamente, exponer la musculatura cervical. Nota estructuras importantes incluyendo el cuerpo músculo grande de los cleidomastoideus centralmente dentro del campo quirúrgico expuesto, la vena yugular externa ventralmente, y el tejido parotídeo rostral que recubre el ángulo de la mandíbula. Un hito importante es una pequeña branc nervioh (del XI par craneal) que se envuelve alrededor del borde posterior / dorsal del cleidomastoideus extender rostral hacia el pabellón auricular (Figura 4). </li><li> Retraer con suavidad el cuerpo muscular cleidomastoideus en una dirección posterior / dorsal (Figuras 4, 5). Dividir suavemente la fascia transparente que envuelve el cuerpo muscular. De una manera similar, retraiga suavemente la parótida y la vena yugular externa en el (anterior / ventral) dirección opuesta (Figura 5). </li><li> Con una buena retracción del cuerpo muscular cleidomastoideus, la cúpula brillante del periostio bulla timpánica vendrá a la vista (Figura 6). En el aspecto caudal de la bulla, la inserción de un músculo cervical profunda, la sternomastoideus, vendrá a la vista (Figura 6). Preservar el nervio facial, que se hace visible en el aspecto dorsal y rostral de la cúpula bulla. Coloque un retractor auto-retención (de titanio estéril shaft-- incrustado en silicona desechablepegar) antes de la perforación. </li><li> Con la técnica a dos manos, dividir suavemente el periostio bulla con diatermia bipolar para exponer el hueso subyacente. El uso de fórceps o una cureta otológica, elevar suavemente y empuje el periostio en una dirección periférica para exponer ampliamente la cúpula bulla. Nota: El paso 4,6 es crítico para maximizar la vista quirúrgica del espacio del oído medio. Utilizar la manipulación de los tejidos blandos meticuloso y suave para evitar el sangrado y / o pérdida de líquido intersticial en la cavidad bulla después de la perforación. </li><li> Tras una cúpula bulla correctamente expuesta, perfore un agujero piloto de 2 mm a través del hueso bulla con un taladro quirúrgico dental entre el margen caudal de la cúpula y la línea visiblemente opaco (que representa la membrana timpánica) que se extiende a través del aspecto rostral de la ampolla (Figura 7). Tenga cuidado para perforar sólo a través del hueso de preservar las estructuras subyacentes, como la arteria estapedial. Perforar un segundo agujero piloto cercana para facilitar un-material para techos del hueso bulla (&lt;strong&gt; Figura 7). </li><li> Con un par de pinzas de punta de joyero, destape el hueso bulla en una dorsal y dirección caudal (Figura 8). Retire el hueso de una manera gradual a alta magnificación. No perfore la arteria estapedial, que se encuentra directamente debajo de la tapa de bulla, como sangrado de esta arteria puede comprometer el procedimiento. Minimizar la cantidad de hueso eliminado para evitar la entrada excesiva de líquidos en el oído medio al tiempo que permite una excelente visualización y acceso al nicho de ventana redonda (Figura 8). </li></ol> 5. Ronda Aplicación ventana del Agente ototóxicos <ol><li> Haga los ajustes rotacionales sutiles en el soporte de cabeza para llevar el RWN de lleno a la vista. La RWN se encuentra normalmente en el aspecto dorsal y caudal del espacio del oído medio y aparece como una indentación en forma de copa del hueso cápsula ótica. En la mayoría de los casos, la arteria estapedial se ejecuta 1-2 mm ventral / rostral a esto. La RWN veces puede ser tucked periféricamente bajo una angulación aguda de la cúpula bulla. En tales casos, una colocación cuidadosa de la cabeza del animal es primordial. <ol><li> El uso de las mechas de papel preparadas antes de la operación, retirar todo el líquido visible en el oído medio y RWN hasta que se visualiza el hueso seco. Nota: Este es el paso más crítico de todo el protocolo, como el ~ 10 l (1 gota) de agente ototóxico aplica a la RWN puede ser fácilmente diluida por este líquido. </li></ol></li><li> Bajo ampliación máxima, utilice una aguja de calibre fino en una jeringa de tuberculina de 1 ml para aplicar una gota (~ 10 l) de agente ototóxico directamente a la RWN, llenando por completo. Tenga cuidado de no perturbar la arteria estapedial y observar de cerca para la sustitución de una pequeña reflexión de la luz en la base de un nicho en seco con un aburrido y nebulosos menisco de fluidos como un indicador de que el nicho está llenando correctamente. <ol><li> Deje que el agente para descansar dentro del RWN durante aproximadamente 10 minutos el tiempo de exposición. Después de esto, completamente wick a cabo el agente y sustituirla por una nueva aplicación del mismo agente. Determinar repeticiones de aplicación de acuerdo con las especificaciones de agente. El tiempo total de exposición en este procedimiento varía típicamente entre 30 a 60 min. </li><li> Al final del procedimiento, completamente absorber la que el agente una última vez y aplicar agente fresca a la RWN. Deje la bulla destapado y el uso de fórceps para cerrar el tejido blando sobre el sitio quirúrgico. </li></ol></li><li> Sello de sitio quirúrgico a nivel de la piel con una de 4-0, sutura con monofilamento no absorbible. Colocar el animal en una jaula de recuperación / estación. Monitorear la condición clínica del animal con regularidad después de la operación. Mantener el animal en condiciones ambientales adecuadas, incluida la vivienda con ropa de cama suave y suplementación con alimentos blandos, para minimizar el estrés. Determinar los procedimientos futuros y condiciones postoperatorias acuerdo con los protocolos del IACUC institucionales. </li><li> Utilice protocolos IACUC institucionales para esterilizar instrumentoss antes de su uso en el siguiente animal. Va a necesitar tiempo enfriamiento adecuado entre el uso del instrumento. </li></ol> 6. Procedimientos postoperatorios y cosecha de tejidos Coclear <ol><li> Como se describe en el paso 2.5, lleve a cabo las pruebas fisiológicas de la audición después de la operación en los puntos deseados y antes del sacrificio. Realizar procedimientos postoperatorios de acuerdo a los objetivos experimentales. Sacrificar al animal en cualquier día del postoperatorio deseado. </li><li> Tras la anestesia completa a través de la inyección IP, como se requiere por los protocolos del IACUC institucionales, sacrificar al animal. Con unas tijeras afiladas, decapitar a los animales justo caudal al occipucio. Abrir bruscamente la bóveda craneal con tijeras a lo largo de la línea media dorsal y ventral y difundido ampliamente. Recoger suavemente el tejido cerebral para exponer los huesos temporales. Nota: Una serie de procedimientos para la investigación de los cambios de puestos de exposición en la cóclea puede ramificar desde este punto y se menciona en la sección de discusión. Determinar el método de investigación más relevant para los fines experimentales. Si se planea microscopía electrónica después de la cóclea se secciona, utilice el cateterismo cardíaco comprobar la validez de fijar el tejido. Esto está más allá del alcance de este debate y se ha cubierto en profundidad en otro lugar. 13 </li><li> Cortar los huesos temporales fuera de la base del cráneo con las tijeras y se coloca inmediatamente en solución fijadora. Sumergir los huesos directamente en paraformaldehído al 4% durante 1,5 h a TA. Supervisar tiempo de fijación, como mayor duración puede limitar el resultado del análisis histológico en los pasos posteriores. Descalcificar diseccionó los huesos por un período variable de tiempo a través de la inmersión en 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). </li></ol>

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	<li>Kimura, R. S., Iverson, N. A., Southard, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+lesions+of+the+vestibular+labyrinth.">Selective lesions of the vestibular labyrinth.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 97, 577-584 (1988).</li><li>Dodson, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+and+survival+of+spiral+ganglion+neurons+in+the+guinea+pig+after+intracochlear+perfusion+with+aminoglycosides.">Loss and survival of spiral ganglion neurons in the guinea pig after intracochlear perfusion with aminoglycosides.</a> Journal of neurocytology. 26, 541-556 (1997).</li><li>Wanamaker, H. H., Gruenwald, L., Damm, K. J., Ogata, Y., Slepecky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-related+vestibular+and+cochlear+effects+of+transtympanic+gentamicin.">Dose-related vestibular and cochlear effects of transtympanic gentamicin.</a> The American journal of otology. 19, 170-179 (1998).</li><li>Lee, K. S., Kimura, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ototoxic+drug+administration+to+the+endolymphatic+sac.">Effect of ototoxic drug administration to the endolymphatic sac.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 100, 355-360 (1991).</li><li>Schmiedt, R. A., Okamura, H. O., Lang, H., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ouabain+application+to+the+round+window+of+the+gerbil+cochlea:+a+model+of+auditory+neuropathy+and+apoptosis.">Ouabain application to the round window of the gerbil cochlea: a model of auditory neuropathy and apoptosis.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 3, 223-233 (2002).</li><li>Schmiedt, R. A., Lang, H., Okamura, H. O., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+furosemide+applied+chronically+to+the+round+window:+a+model+of+metabolic+presbyacusis.">Effects of furosemide applied chronically to the round window: a model of metabolic presbyacusis.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 9643-9650 (2002).</li><li>Suzuki, M., Kikuchi, T., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocochlear+potential+and+endolymphatic+K++changes+induced+by+gap+junction+blockers.">Endocochlear potential and endolymphatic K+ changes induced by gap junction blockers.</a> Acta oto-laryngologica. 124, 902-906 (2004).</li><li>Chen, Z., Mikulec, A. A., McKenna, M. J., Sewell, W. F., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+intracochlear+drug+delivery+in+the+mouse.">A method for intracochlear drug delivery in the mouse.</a> Journal of neuroscience methods. 150, 67-73 (2006).</li><li>Husmann, K. R., Morgan, A. S., Girod, D. A., Durham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+administration+of+gentamicin:+a+new+method+for+the+study+of+ototoxicity+of+cochlear+hair+cells.">Round window administration of gentamicin: a new method for the study of ototoxicity of cochlear hair cells.</a> Hearing research. 125, 109-119 (1998).</li><li>Heydt, J. L., Cunningham, L. L., Rubel, E. W., Coltrera, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+gentamicin+application:+an+inner+ear+hair+cell+damage+protocol+for+the+mouse.">Round window gentamicin application: an inner ear hair cell damage protocol for the mouse.</a> Hearing research. 162, 65-74 (2004).</li><li>Palmgren, B., Jin, Z., Ma, H., Jiao, Y., Olivius, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Bungarotoxin+application+to+the+round+window:+an+in+vivo+deafferentation+model+of+the+inner+ear.">beta-Bungarotoxin application to the round window: an in vivo deafferentation model of the inner ear.</a> Hearing research. 265, 70-76 (2010).</li><li>Lang, H., Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chronic+furosemide+treatment+and+age+on+cell+division+in+the+adult+gerbil+inner+ear.">Effects of chronic furosemide treatment and age on cell division in the adult gerbil inner ear.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 4, 164-175 (2003).</li><li>Lang, H., Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ouabain+induces+apoptotic+cell+death+in+type+I+spiral+ganglion+neurons,+but+not+type+II+neurons.">Ouabain induces apoptotic cell death in type I spiral ganglion neurons, but not type II neurons.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 6, 63-74 (2005).</li><li>Lang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+mouse+embryonic+stem+cells+into+the+cochlea+of+an+auditory-neuropathy+animal+model:+effects+of+timing+after+injury.">Transplantation of mouse embryonic stem cells into the cochlea of an auditory-neuropathy animal model: effects of timing after injury.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 9, 225-240 (2008).</li><li>Stevens, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heptanol+application+to+the+mouse+round+window:+a+model+for+studying+cochlear+lateral+wall+regeneration.">Heptanol application to the mouse round window: a model for studying cochlear lateral wall regeneration.</a> Otolaryngology--head and neck surgery : official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 150, 659-665 (2014).</li><li>Zheng, Q. Y., Johnson, K. R., Erway, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+hearing+in+80+inbred+strains+of+mice+by+ABR+threshold+analyses.">Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analyses.</a> Hearing research. 130, 94-107 (1999).</li><li>Hequembourg, S., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiral+ligament+pathology:+a+major+aspect+of+age-related+cochlear+degeneration+in+C57BL/6+mice.">Spiral ligament pathology: a major aspect of age-related cochlear degeneration in C57BL/6 mice.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 2, 118-129 (2001).</li><li>Ohlemiller, K. K., Gagnon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical-to-basal+gradients+in+age-related+cochlear+degeneration+and+their+relationship+to+'primary'+loss+of+cochlear+neurons.">Apical-to-basal gradients in age-related cochlear degeneration and their relationship to 'primary' loss of cochlear neurons.</a> The Journal of comparative neurology. 479, 103-116 (2004).</li><li>Tadros, S. F., D'Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-related+genes+change+their+expression+with+age+and+hearing+loss+in+the+mouse+cochlea.">Apoptosis-related genes change their expression with age and hearing loss in the mouse cochlea.</a> Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 13, 1303-1321 (2008).</li><li>Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+to+select+genes+from+RMA+normalized+microarray+data+using+functional+hearing+tests+in+aging+mice.">Novel approach to select genes from RMA normalized microarray data using functional hearing tests in aging mice.</a> Journal of neuroscience. 171, 279-287 (2008).</li><li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+hearing+loss:+GABA,+nicotinic+acetylcholine+and+NMDA+receptor+expression+changes+in+spiral+ganglion+neurons+of+the+mouse.">Age-related hearing loss: GABA, nicotinic acetylcholine and NMDA receptor expression changes in spiral ganglion neurons of the mouse.</a> Neuroscience. 259, 184-193 (2014).</li><li>Borkholder, D. A., Zhu, X., Frisina, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+membrane+intracochlear+drug+delivery+enhanced+by+induced+advection.">Round window membrane intracochlear drug delivery enhanced by induced advection.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 174, 171-176 (2014).</li><li>Tadros, S. F., D'Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+changes+for+antioxidants+pathways+in+the+mouse+cochlea:+relations+to+age-related+hearing+deficits.">Gene expression changes for antioxidants pathways in the mouse cochlea: relations to age-related hearing deficits.</a> PloS one. 9, e90279 (2014).</li><li>Lang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+up-regulation+and+glial+cell+proliferation+following+degeneration+of+spiral+ganglion+neurons+in+the+adult+mouse+inner+ear.">Sox2 up-regulation and glial cell proliferation following degeneration of spiral ganglion neurons in the adult mouse inner ear.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 12, 151-171 (2011).</li></ol>

No compiten intereses financieros. Los autores no tienen nada que revelar.

Los resultados de protocolo y representativas descritas anteriormente se obtuvieron en un modelo de ratón CBA / CaJ incluyendo ambos géneros. Esta cepa endogámica está bien establecido como un estándar &quot;buen oído&quot; y el modelo &quot;envejecimiento normal&quot; en la investigación de la audición. 16-23 Descripción del uso de este protocolo en otros modelos de mamíferos está más allá del alcance de este texto. El lector debe tener en cuenta, sin embargo, que la técnica de aplicación RWN ofrece varias ventajas a estudiar el oído interno de los mamíferos. De éstos, el más notable es que evita la interrupción directa de la estructura anatómica delicado y gradientes bioquímicos que existen dentro de las paredes de la cápsula ótica. Los procedimientos tales como cocleostomía e implantación de bombas de infusión tienen la propensión a violar directamente las estructuras del oído interno que conducen a cambios de umbral permanentes; un hecho que debe ser tenido en cuenta a la hora de analizar los resultados. La interrupción de estructuras de paredes laterales cocleares por metho invasivads también puede limitar el uso de agentes ototóxicos como furosemida o heptanol, cuya específica zona de efecto se limita a ese lugar. 15,24 enfoques no invasivos alternativos tales como la inyección trans-timpánica y la inyección parenteral se han plagado de resultados poco fiables y / o toxicidad sistémica para el modelo animal. Este método de aplicación ha demostrado evitar tanto de estas deficiencias, el logro de un nivel de consistencia próxima a la de los métodos más invasivos discutidos anteriormente. Otras ventajas de esta técnica incluyen es su amplia aplicabilidad a una serie de modelos animales y la viabilidad de incorporar en una infraestructura de laboratorio existente. Respecto a esto último, no hay reactivos o productos químicos especializados se requieren, aparte de los elegidos agentes ototóxicos, anestésicos, analgésicos y. Agentes ototóxicos se utilizan típicamente a una concentración fija y se mezclan en un gran volumen suficiente de solución (5 ml) para durar largos períodos de tiempo en cuentaing cada aplicación utiliza alrededor de 10 l (en ratones). Así, después de la adquisición inicial de suministros e instrumentos, los investigadores están relativamente libres de tiempo de preparación solución o reemplazo frecuente de los materiales. Esta técnica también ofrece reducciones en el tiempo operatorio, que pueden ser significativa cuando se compara con los procedimientos que implican la implantación de bombas de infusión perilinfáticos o cocleostomías. Al llegar a un nivel de competencia técnica, nuestro tiempo promedio de finalización de la incisión inicial hasta el cierre era típicamente 20 minutos a 1,5 horas en función de la duración de la exposición deseada para el agente ototóxicos. Tres o cuatro cirugías pueden realizar fácilmente en un solo día, lo que permite una mayor eficiencia y un mayor potencial para la obtención de resultados exitosos. Como se describió anteriormente, esta técnica también se puede aplicar fácilmente a una variedad de modelos de roedores incluyendo ratones, ratas, conejillos de Indias y jerbos. Las limitaciones de este método se centran en lamoderadamente empinada curva de aprendizaje necesaria para dominarlo y la disminución de los resultados esperados hasta que se alcance el dominio técnico. Como se discutirá en mayor detalle a continuación, los pequeños errores durante el abordaje quirúrgico o visualización insuficiente del campo quirúrgico se casi invariablemente conducir a un mal resultado. Hallazgos sutiles que un novato puede dejar de reconocer, como una espesa burbuja de aire que bloquea el acceso sub-milimétrica del agente a la membrana de la ventana redonda o líquido intersticial diluir el agente, se toman el tiempo para apreciar y desarrollar las habilidades psicomotoras necesarias para corregirlos. Sin embargo, con la actuación repetida del procedimiento de estos obstáculos se superan fácilmente y constituyen un desafío técnico menos desalentador para los investigadores que algunos de los métodos invasivos mencionados. Por último, esta técnica está asociado con la limitación relativa que la lesión coclear sólo puede ser inducida en un único punto en el tiempo durante la exposición quirúrgica. Esto se puede superar, hasta cierto punto, Llenando el RWN con la esponja de gelatina absorbible empapado en el agente como fue descrito por Heydt et al. 10 La esponja de gelatina absorbible se reabsorberá en el tiempo, pero puede permitir un período de exposición más largo que se puede lograr mediante la aplicación de una solución acuosa sola. Para que un investigador para darse cuenta de las ventajas de esta técnica y evitar cualquier escollo, es fundamental reconocer los dos elementos críticos de esta técnica: 1) el mantener constantemente la visualización del espacio del oído medio y RWN; y 2) la capacidad de mantener el campo quirúrgico libre de líquido y / o sangre intersticial. En la consecución de la primera de ellas, la importancia de una cabeza titular adecuada no puede dejar de enfatizarse. Fijación segura de la cabeza del animal asegura una vista estable bajo el microscopio; la importancia de que se convierte fácilmente evidente cuando la instrumentación sutil cambia drásticamente el posicionamiento de estructuras con una lupa. Un buen htitular de ead que puede girar alrededor del eje rostral-caudal del animal también facilita importantes cambios dinámicos en línea del investigador del sitio. A menudo, unos pocos milímetros de rotación alrededor de este eje pueden significar la diferencia entre la visualización de la RWN y visualización de sólo el hueso cápsula ótica. La capacidad de cambiar constantemente de vista también es de suma importancia para asegurar el fluido intersticial se elimina correctamente desde las profundidades del nicho y también que el agente ototóxicos se elimina totalmente entre las aplicaciones como se discutió en la Parte 5. En nuestra experiencia, la sangre, la condensación, o líquido intersticial que entra en el espacio del oído medio tiene la capacidad de interferir con toda experimento. Esto no es sorprendente, ya que la pequeña cantidad de agente ototóxico aplica a la ventana redonda (~ 10 l) pueden ser fácilmente diluida al entrar en contacto con incluso pequeños volúmenes de líquido extraño. Por esta razón, la disección quirúrgica meticulosa, desoperculación fragmentario de la bulla timpánica y cuidadoso preservation de la arteria estapedial es equivalente a un éxito de los resultados experimentales. Si se observan los pasos críticos anteriores y los resultados esperados aún no se logran, la resolución de problemas debe comenzar. En nuestra experiencia, a menudo es útil para realizar variaciones de prueba de dos elementos de procedimiento. El primero es modificar la frecuencia con la que el agente ototóxico se repone en la ventana redonda. Dependiendo del agente utilizado, el tiempo de exposición total es de entre 30 min y 1 h, con efecto de mecha completa y la posterior sustitución del agente de cada 10 min. Si la exposición para las duraciones más cortas, el aumento de la exposición global puede permitir que el agente más tiempo para difundirse a través de la membrana de la ventana redonda. La exposición adicional y reposición también pueden ayudar a evitar la dilución no deseada del agente ototóxico por la sangre, la condensación, o intersticial como se mencionó anteriormente. Se debe tener precaución cuando se utiliza este mantuvo enfoque, sin embargo, ya que tiende a aumentar el riesgo de inadvertidaly lesionar la arteria estapedial y / o la introducción de líquido intersticial a la RWN. Esta técnica es significativo en lo que ofrece a las investigaciones de la fisiología y la fisiopatología coclear. Esta técnica mínimamente invasiva permite el estudio detallado de los procesos bioquímicos delicados y ha sido equivalente en la promoción de nuestra investigación destinada a evaluar el potencial regenerativo coclear. 12,24 Este abordaje quirúrgico y la exposición también se reproduce a través de una variedad de otras técnicas de vástago, y los resultados exitosos de utilizar este método se han reportado en los estudios de la implantación de células madre coclear. 14 Mucho se desconoce acerca de la cóclea, sin embargo, esta técnica, junto con el arsenal más amplio a disposición de los investigadores, ayudará en la reducción de esta brecha de conocimiento.

Los investigadores han utilizado una amplia variedad de modelos animales para estudiar la función normal del sistema auditivo, así como la fisiopatología de la pérdida de audición. Estos modelos también son muy útiles para la realización de estudios de intervención en contra de diversos procesos patológicos y sirven de base para aplicaciones de traslación en sujetos humanos. Para la mayoría de la investigación con la cóclea y sus vías auditivas asociadas, algún grado de daño o interrupción debe ser introducido en el sistema. A menudo, el daño está dirigido intencionadamente para crear una lesión específica, permitiendo a los investigadores a estudiar el efecto de que la lesión en la función normal, así como la capacidad coclear para recuperarse de ella. Cuando se selecciona un modelo en particular de los animales y / o de la técnica (s) para la introducción de daños, una serie de factores deben ser considerados para lograr los mejores resultados posibles. Varios modelos animales pueden responder de forma diferente a las intervenciones, mientras que los efectos directos e indirectos de una técnica puede serenteramente perjudicial para el resultado deseado. En la mayoría de los casos, el protocolo de daño al oído interno ideal sería evitar la toxicidad sistémica, rápidamente y producir de forma fiable daños, cree una lesión precisa y consistente, y ser de supervivencia para permitir un mayor estudio de los cambios funcionales, celulares y moleculares. Idealmente, estos métodos también preservarían la microarquitectura y electroquímicos delicados gradientes de la cóclea en la mayor medida posible. Hasta la fecha, los investigadores han tenido éxito en establecer una serie de técnicas para inducir la lesión en el oído interno. La mayoría de ellas implican la exposición de la cóclea a un agente ototóxico sistémica o mediante abordaje quirúrgico. Las técnicas incluyen la inyección parenteral, inyección intraperitoneal, inyección trans-timpánica, inyección saco endolinfático y cocleostomía con perfusión perilinfática. Estas técnicas se han usado para introducir una variedad de agentes ototóxicos, tales como la furosemida, gentamicina, ouabaína, heptanol y 1-5.Mientras éxito en la creación de lesiones cocleares específicas, las técnicas anteriores también han reconocido limitaciones. Inyecciones sistémicas pueden ser altamente tóxicos para el animal y puede ser asociado con insultos cocleares no deseados y los resultados inconsistentes. Este último inconveniente también se ha asociado con las inyecciones de trans-timpánica. Técnicas como cocleostomía y la perfusión perilinfática, mientras que capaz de inducir lesiones rápidos y altamente fiables, son directamente invasiva a la estructura del oído interno y función. Muchos de los enfoques quirúrgicos también están asociados con un alto grado de dificultad técnica y pueden requerir dejar objetos extraños en el animal, como un infusor microbomba. 2-4,6-8 Ninguna técnica es libre de defectos, y los investigadores deben elegir métodos cuidadosamente para adaptarse a sus necesidades experimentales. Aquí se describe, en detalle, el nicho de ventana redonda (RWN) técnica de aplicación para la administración tópica de agentes ototóxicos en ratones adultos. Fiprimero descrito por Husmann et al en 1998 mientras se estudia el efecto de la gentamicina en sensorial degeneración de las células del cabello en un modelo aviar, esta técnica se encontró que era capaz de producir lesiones significativamente más fiables que la aplicación de gentamicina sistémica, evitando al mismo tiempo las toxicidades asociadas. 9 Desde entonces, una número de otros investigadores, incluyendo nuestro laboratorio, han utilizado esta técnica con gran éxito. En 2004, Heydt et al. adaptado a un modelo de ratón y descrito una mayor capacidad para controlar el tamaño de la lesión llenando el RWN con la esponja de gelatina absorbible empapado en concentraciones variables de gentamicina. 10 Palmgren et al., en 2010, estudiaron los efectos ototóxicos de beta-bungarotoxina, un potente elemento en el veneno de los taiwaneses bandas cajón, mediante la aplicación de una forma acuosa de la misma al RWN de ratas adultas. 11 Además, un número de estudios previos de nuestro laboratorio han utilizado el enfoque de ventana redonda para estudiar los efectos ototóxicos de furosemidae, ouabaína, y heptanol. 5,6,12-15 Los resultados de estos estudios han demostrado la importancia de fluido coclear y la homeostasis de iones en la audición normal, descubierto capacidad proliferativa de células en el ganglio espiral y la pared lateral coclear, y promovido nuestra comprensión de relacionada con la edad la pérdida de audición. El siguiente enfoque implica el acceso quirúrgicamente el oído medio a través de una incisión retroauricular y destechamiento parcial de la bulla timpánica ósea. Esto permite una excelente exposición de la RWN y la membrana a la que un agente ototóxico seleccionado puede ser aplicado directamente. El agente líquido luego piscinas en el hueco en forma de copa del RWN (o lentamente drena desde un soporte de esponja de gelatina absorbible saturada lleno en el RWN) y se difunde a través de la membrana de la ventana redonda en el espacio perilinfático del vestíbulo coclear. No cocleostomía directa se hace en este enfoque. Ventajas de esta técnica incluyen la preservación de oído interno microarquitectura, la evitaciónde toxicidad sistémica, la asignación de una oreja de control intra-animal, rápido inicio del efecto, la degeneración selectiva en ciertos tipos de células coclear (por ejemplo., tipo I espiral neuronas ganglionares con exposición ouabaína y tipo coclear II fibrocitos inducidas por el tratamiento de heptanol), y resultados reproducibles / fiables. Esta técnica se puede aplicar con pocas alteraciones entre otras especies de roedores, incluyendo ratas, cobayas, y jerbos. Las desventajas incluyen una curva de aprendizaje empinada técnica y la limitación relativa de insulto ototóxico que está limitado a un solo punto en el tiempo.

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">1-Heptanol 98%</td>
			<td rowspan="2">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2805&#160;</td>
			<td rowspan="2"><a>PubChem Substance ID 24895536</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250ML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaset Injectable&#160;</td>
			<td rowspan="2">Patterson Veterinary</td>
			<td>07-803-6637&#160;</td>
			<td>Concentrate 100mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Ketamine HCl)</td>
			<td>10ml</td>
			<td>Schedule CIII controlled substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anased Injectable</td>
			<td rowspan="2">Lloyd Laboratories</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td rowspan="2">Concentrate 20mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Xylazine)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenex Injectable&#160;</td>
			<td rowspan="2">Patterson Veterinary</td>
			<td>07-850-2280&#160;</td>
			<td>Concentrate 0.3mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Buprenorphine HCl)</td>
			<td>5 ampules per box</td>
			<td>Schedule CIII controlled substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Skin Prep Solution</td>
			<td rowspan="2">Medline</td>
			<td><a href="http://www.medline.com/sku/item/MDPMDS093941;ecomsessionid=1UZWKxhkYkuy9vK2NXBaBA__">MDS093941&#160;</a></td>
			<td rowspan="2">1 Quart screw top bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Povidone-Iodine)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sterile Saline</td>
			<td>Variable</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For mixing solutions and injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table of Equipment, Surgical Instruments, and Specific Techniques</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>32192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controlled Acoustics Environment Sound Booth</td>
			<td>Industrial Acoustics Company</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Surgical Head Holder</td>
			<td>Custom Made &#8211;&#160;</td>
			<td rowspan="2">Please see Figure 3</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical University of South Carolina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Neck Soft-Tissue Retractor (Wire Speculum, Titanium) 1.75inch</td>
			<td rowspan="3">World Precision Instruments</td>
			<td rowspan="3">555801L</td>
			<td>Maximum spread 20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedded in disposable putty to affix dynamically to head holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90N Dental Belt Driven Hand Drill&#160;</td>
			<td>Emesco</td>
			<td>N/A (Vintage Item)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle Size6</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>MEDC-011990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">#15c Stainless Steel Surgical Scalpel Blade&#160;</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td rowspan="2">SKU: 097-7215</td>
			<td rowspan="2">50 Blades/Box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Via ACE Surgical Supply Code</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Tip Jewelers Forceps&#160;</td>
			<td>Bernell</td>
			<td>MIL17304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors Curved</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="https://www.medline.com/sku/item/MDPDYND04026;ecomsessionid=ozXzkfIx-tj0MIi8FkGQ0A__">DYND04026&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors Straight</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="http://www.medline.com/sku/item/MDPDYND04025;ecomsessionid=+43JREOby+Mfz6IIgoSg5A__">DYND04025&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stevens Tenotomy Scissors Straight</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="http://www.medline.com/sku/item/MDPMDG3222111">MDG3222111&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosen Ear Needle Straight Shaft, Lightly Curved Tip</td>
			<td>MytaMed</td>
			<td>Item# 6.56.00</td>
			<td>Figure 1 demonstrates angled shaft picks. This was later substituted for the Rosen picks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosen Ear Needle Straight Shaft, Strongly Curved Tip</td>
			<td>MytaMed</td>
			<td>Item# 6.56.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Kimwipes Delicate Task Wipers&#160;</td>
			<td rowspan="2">Kimtech Science</td>
			<td rowspan="2">CODE 34155&#160;</td>
			<td rowspan="2">White, Size 4.4x8.4 Inch. Cut to triangles and rolled into fine tip wicks.</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>House Ear Curette, 6&#8221; shaft, light angle</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="https://www.medline.com/sku/item/MDPMDG0396486">MDG0396486&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam (absorbable gelatin sponge) Size 100</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="https://www.medline.com/sku/item/MDPIIS34201">IIS34201&#160;</a></td>
			<td>Substitutions may be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton pellets #3 4mm</td>
			<td>Richmond</td>
			<td>Manufacturer Code 100108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectroSurgical Unit 100 E M/M</td>
			<td>Elmed</td>
			<td>List No. 52-5770</td>
			<td>Bipolar and Monopolar Capable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc U-100 Insulin Syringe 28G, 0.5&#8221; length needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>Product Number: 329410</td>
			<td>Optional for delivery of Ototoxic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G, blunt tip, 1&#8221; length needle</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>Product Code 8881202397</td>
			<td>For controlled delivery of Ototoxic agent with less risk of damaging stapedial artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Mask</td>
			<td>U-line</td>
			<td>S-10478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exam Grade Nitrile Surgical Gloves</td>
			<td>U-line</td>
			<td><a href="http://www.uline.com/Product/Detail/S-12549/Nitrile-Gloves/Nitrile-Exam-Gloves-Powder-Free">S-12549</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Hair Clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Multiple models may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Nylon black monofilament suture on PC-1&#160;13mm 3/8 circle needle</td>
			<td>Ethilon</td>
			<td>1855G</td>
			<td>Substitutions may be made.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Instant Sealing Sterilization Pouch</td>
			<td rowspan="2">Fisher</td>
			<td rowspan="2">01-812054</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Dry Sterilizer</td>
			<td rowspan="3">ROBOZ</td>
			<td rowspan="3">Germinator TM 500</td>
			<td rowspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mouse round-window approach for ototoxic agent delivery: a rapid and reliable technique for inducing cochlear cell degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

En un reciente estudio de Stevens et al utilizar el protocolo anterior, ratones adultos CBA / CaJ de ambos sexos fueron expuestos a través de la difusión de la ventana redonda de heptanol. 15 Heptanol es una brecha de la salida un-acoplador conocidos por producir apuntado, lesión recuperable a las células del pared lateral coclear. El propósito del estudio fue producir un modelo fiable para daño coclear específica, lo que permite la investigación de la regeneración post-quirúrgica de los elementos dañados. Umbrales de audición pre-quirúrgica y post-quirúrgicos servido como un criterio de valoración funcional. Microscopía y técnicas de tinción inmunohistoquímica se utilizaron para estudiar los cambios morfológicos. Los aumentos significativos en los umbrales de ABR se observaron en los ratones tratados con heptanol (Figura 9). Los animales de control que recibieron cirugía simulada, con la entrega de la solución salina en lugar de heptanol, no demostraron cambios significativos umbral en cualquier frecuencia probadas. La inmunotinción contra un interiormente rectificarcanal de potasio (Kir) 4,1 sirvió como un método indirecto para la visualización de los daños / recuperación de estructuras cocleares. Esto demostró diferencias altamente reproducibles entre el tratamiento y control de las orejas. En general, la intensidad de tinción se redujo notablemente dentro de la estría vascular (StV) y entre los fibrocitos del ligamento espiral (SLF) 1-3 días después de la exposición heptanol, denotando grandes cantidades de daño dirigida a estas áreas. Hubo una disminución en particular en Kir intensidad 4.1 manchas en las áreas de tipo II y tipo IV SLFs (Figura 10) y STV (Figura 11). Evidencia de la integridad y la condensación nuclear interrumpido cromosómica / ampollas típicas de la apoptosis celular también fue visto en contratinciones nucleares en estas áreas cocleares (Figura 10). Zonas vacuolados de Kir 4,1 tinción resueltos marcadamente a los 7 días y estaban ausentes por completo a los 14 días. Cuando Kir 4,1 intensidad de la tinción se cuantificó en las áreas de StV, oídos tratados demostraron una inial canal seguido por un cambio significativo (p &lt;0,05) de nuevo hacia la intensidad de control de 7 días después de la exposición heptanol (Figura 12). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig1.jpg" /> Figura 1. Instrumento para este compromiso. Representación de pre-quirúrgica puesta a punto de la instrumentación. Todo el equipo debe ser de fácil acceso dentro del campo quirúrgico estéril. Instrumentación típica incluye 2 tijeras de disección, 2-3 recta y / o fórceps de joyero punta curvada con curetas oído, picos otológicos eje curvo (más tarde sustituido con Rosen recoge - no se muestra), y una unidad de electro-cauterización con unas pinzas finas de joyero punta curvada casco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53131 / 53131fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Suministros quirúrgicos. Suministros adicionales para mantener el medio ambiente RWN. Recortes labwipe esterilizados para la formación de mecha de papel (izquierda), papel firmemente formada mechas hechas de toallitas esterilizadas laboratorio (centro), y 4 bolitas mm algodón (derecha) se utilizan para limpiar el exceso de líquido y las inundaciones de sangre en el nicho de ventana redonda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic en aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig3.jpg" /> Figura 3. soporte de cabeza de animal. Imagen que representa el soporte de la cabeza y el bloque de mordida. Los agujeros en el bloque en forma y asegurar los incisivos centrales superiores. Una abrazadera se aprieta suavemente sobre el hocico dorsal para asegurar el animal en su lugar. El uso de un soporte para la cabeza es fundamental para OUTC quirúrgica exitosaome. Idealmente, esto debería ser capaz de girar en torno al eje rostral-caudal del animal para optimizar vistas quirúrgicos de la bulla durante el procedimiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig4.jpg" /> Figura 4. Cleidomastoideus m.. Gráfico esquemático que representa la anatomía básica de la musculatura cervical roedor y su asociación con la vena yugular externa. El músculo cleidomastoideus es el músculo más fácilmente identificados durante el abordaje quirúrgico. La liberación de la fascia envolvente seguido de retracción posterior / dorsal del cuerpo muscular dirigirá disección quirúrgica hacia la bulla timpánica (círculo negro). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver al</a>Versión Arger de esta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig5.jpg" /> Figura 5. Área de la exposición quirúrgica. Representa la exposición después de la disección a través de las capas de grasa cutáneos y subcutáneos. Puntos de referencia estructurales de la nota incluyen una rama de la XI par craneal que recubre el músculo cleidomastoideus (A), la vena yugular externa (B), y el tejido parótida expuesta (C). La rama XI par craneal se asocia a menudo con una pequeña embarcación y debe dividirse antes de continuar. De derecha a izquierda en la imagen corresponde al eje rostral-caudal del animal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig6.jpg" /> Figura 6. La exposición de la bulla. La exposición de la bulla timpánica después de la retracción de la cleidomastoideus y las estructuras circundantes. Hitos notables incluyen el cuerpo muscular cleidomastoideus (A) refleja posterior / dorsal, el nervio facial (B), y la cúpula brillante del periostio bulla timpánica (C). También, tenga en cuenta la inserción del músculo sternomastoideus en la cara caudal izquierda de la bulla timpánica (asterisco). La presencia del nervio facial en la cara dorsal y rostral de la bulla es un punto de referencia fundamental para la verdadera identificación de la bulla. De derecha a izquierda en la imagen corresponde al eje rostral-caudal del animal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig7.jpg" /> Figura 7. La exposición de nicho de ventana redonda I. Imagen que representa la tympanic bulla totalmente expuesta después de la disección del periostio suprayacente. El agujero piloto es el mejor situado en el punto medio entre el borde caudal de la cúpula de bulla y una línea opaca sutil visualizado dentro del aspecto rostral la bulla (en representación de la membrana timpánica). Un segundo agujero, piloto adyacente puede facilitar más fácil un-material para techos del hueso bulla. Evitar la perforación profunda se debe tomar para no lesionar la arteria estapedial subyacente. El objeto metálico oscuro en la parte inferior de la imagen es el retractor de tejido blando de titanio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig7large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig8.jpg" /> Figura 8. La exposición de nicho de ventana redonda II. Bulla timpánica destapado con la exposición del nicho de ventana redonda (flecha) y la arteria estapedial (estructura roja1-2 mm lateral al nicho), como se observa bajo 20 aumentos. El nicho menudo pone en una posición escondido bajo el ángulo agudo formado por la cúpula bulla con la cápsula ótica en la cara caudal de la cúpula. Es imperativo que la visualización completa del nicho lograrse antes de la aplicación del agente ototóxico o con efecto de mecha. Eliminación de hueso excesiva durante destapar también debe ser evitado como líquido intersticial / la sangre tiende a inundar la cavidad cuando se crearon grandes agujeros. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig8large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig9.jpg" /> Figura 9. Los resultados representativos -. Heptanol pérdida de audición inducida y recuperación media la respuesta auditiva del tronco cerebral (ABR) umbrales (dB SPL) trazan en función del tono pipfrecuencia. Las medidas se agrupan en función de pre-exposición (Negro-Control) y el día después de la operación (POD) 1, 7 y 14 (rojo). Las barras de error representan SEM. La figura fue re-trazado de Stevens et al. 2014. 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig9large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig10.jpg" /> Figura 10. Los resultados representativos - Targeted daño coclear después de la exposición heptanol parte I. Los cambios en potasio rectificador interno (Kir) Canal 4.1 tinción dentro de la estría vascular (STV) de los oídos tratados con heptanol y controlar los oídos. (A) normal Kir 4,1 tinción típica de los oídos de control con una fuerte afinidad de células strial de Kir 4.1 (verde). (B) del oído Tratamiento en POD1. Grandes zonas vacuolized de decraliviado Kir 4,1 afinidad son vistos dentro del StV (puntas de flecha), junto con una disminución global de StV Kir 4,1 intensidad de la tinción. Los núcleos se contratiñeron con yoduro de propidio (rojo) (B). La barra de escala = 15 micras. La figura fue re-trazado de Stevens et al, 2014. 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig10large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig11.jpg" /> Figura 11. Los resultados representativos - Targeted daño coclear después de la exposición heptanol parte II Los cambios en el ligamento espiral (SL) de la oreja tratada heptanol comparación con el control auditivo.. (A) normal Kir 4.1 tinción (verde) dentro de la SL típica de la oreja de control con tipo de apariencia normal II fibrocitos ligamento espiral (II). (B) Heptanol toreja reated con marcada disminución de la intensidad de Kir 4,1 tinción en el área de tipo II fibrocitos del ligamento espiral, interrupción nuclear y condensación cromosómica / ampollas en consonancia con la apoptosis (flechas). Los núcleos se contratiñeron con yoduro de propidio (rojo). La barra de escala = 15 micras. La figura fue re-trazado de Stevens et al, 2014. 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig11large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 12" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig12.jpg" /> Figura 12. Los resultados representativos. - Recuperación de la intensidad de la tinción coclear después de la exposición heptanol La media de luminancia relativa de Kir 4.1 tinción representa como una función de días post-exposición. Luminancia relativa se calcula como Kir 4,1 intensidad reflexiva bajo microscopía confocal en tratar heptanoloídos ed tomados como un porcentaje de la misma en los oídos de control. Nota POD14-28 datos se agrupan como un solo punto de la curva. Los círculos sólidos representan los valores medios, mientras que las barras de error representan el error estándar de la media. Una recuperación significativa de luminancia relativa se demostró entre POD 7 y las fechas posteriores (prueba de la t de Student p &lt;0,05, asterisco). La figura fue re-trazado de Stevens et al., 2014. 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig12large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

El Enfoque del ratón Ronda-ventana para ototóxicos Agente de entrega: Una rápida y técnica fiable para la inducción de degeneración de las células cocleares

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

the-mouse-round-window-approach-for-ototoxic-agent-delivery-rapid

Research

JoVE Journal

Medicine

17.0K vistas.  Medical University of South Carolina. Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible. 

Video: The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

El estrés social Trier Protocolo de prueba para la inducción de estrés psicológico

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Investigación

Medicina

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time and temperature restrictions, technical sophistication, and cost of reagents, in particular monoclonal antibodies to measure CD4 on blood cells, the only currently acceptable method. A commonly used cost-saving and time-saving laboratory strategy is to calculate, rather than measure certain blood values. For example, LDL levels are calculated using the measured levels of total cholesterol, HDL, and triglycerides1. Thus, identification of cell-free correlates that directly regulate the number of CD4+ T cells could provide an accurate method for calculating CD4 counts due to the physiological relevance of the correlates.
The number of stem cells that enter blood and are destined to become circulating CD4+ T cells is determined by the chemokine CXCL12 and its receptor CXCR4 due to their influence on locomotion2. The process of stem cell locomotion into blood is additionally regulated by cell surface human leukocyte elastase (HLECS) and the HLECS-reactive active &alpha;1proteinase inhibitor (&alpha;1PI, &alpha;1antitrypsin, SerpinA1)3. In HIV-1 disease, &alpha;1PI is inactivated due to disease processes 4. In the early asymptomatic categories of HIV-1 disease, active &alpha;1PI was found to be below normal in 100% of untreated HIV-1 patients (median=12 &mu;M, and to achieve normal levels during the symptomatic categories4, 5. This pattern has been attributed to immune inactivation, not to insufficient synthesis, proteolytic inactivation, or oxygenation. We observed that in HIV-1 subjects with &gt;220 CD4 cells/&mu;l, CD4 counts were correlated with serum levels of active &alpha;1PI (r2=0.93, p&lt;0.0001, n=26) and inactive &alpha;1PI (r2=0.91, p&lt;0.0001, n=26) 5. Administration of &alpha;1PI to HIV-1 infected and uninfected subjects resulted in dramatic increases in CD4 counts suggesting &alpha;1PI participates in regulating the number of CD4+ T cells in blood 3.
With stimulation, whole saliva contains sufficient serous exudate (plasma containing proteinaceous material that passes through blood vessel walls into saliva) to allow measurement of active &alpha;1PI and the correlation of this measurement is evidence that it is an accurate method for calculating CD4 counts. Briefly, sialogogues such as chewing gum or citric acid stimulate the exudation of serum into whole mouth saliva. After stimulating serum exudation, the activity of serum &alpha;1PI in saliva is measured by its capacity to inhibit elastase activity. Porcine pancreatic elastase (PPE) is a readily available inexpensive source of elastase. PPE binds to &alpha;1PI forming a one-to-one complex that prevents PPE from cleaving its specific substrates, one of which is the colorimetric peptide, succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA3NA). Incubating saliva with a saturating concentration of PPE for 10 min at room temperature allows the binding of PPE to all the active &alpha;1PI in saliva. The resulting inhibition of PPE by active &alpha;1PI can be measured by adding the PPE substrate SA3NA. (Figure 1). Although CD4 counts are measured in terms of blood volume (CD4 cells/&mu;l), the concentration of &alpha;1PI in saliva is related to the concentration of serum in saliva, not to volume of saliva since volume can vary considerably during the day and person to person6. However, virtually all the protein in saliva is due to serum content, and the protein content of saliva is measurable7. Thus, active &alpha;1PI in saliva is calculated as a ratio to saliva protein content and is termed the &alpha;1PI Index. Results presented herein demonstrate that the &alpha;1PI Index provides an accurate and precise physiologic method for calculating CD4 counts.

The &amp;#945;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

A CD4 enumeration method, the &#x03B1;-test, is described which uses whole saliva to provide rapid and accurate CD4 counts. The &alpha;-test costs pennies and eliminates the need for technical training, costly reagents such as monoclonal antibodies, instrumentation, refrigeration, transport of samples, as well as collection and handling of blood.

El α-test: Rapid libre de células CD4 enumeración utilizando toda la saliva

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Alto rendimiento caracterización de células madre adultas de ingeniería para la entrega de los factores terapéuticos de estrategias neuroprotectoras

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Las técnicas para Ojos Procesamiento implantados con una retina Prótesis para análisis histopatológico localizado: Parte 2 Epirretinal Implantes de retina con tachuelas

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

A Surgical Procedure for Resecting the Mouse Rib: A Model for Large-Scale Long Bone Repair

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation of the animal for surgery, opening the thoracic body wall, exposing the desired rib from the surrounding intercostal muscles, excising the desired section of rib without inducing a pneumothorax, and closing the incisions. Compared to the bones of the appendicular skeleton, the ribs are highly accessible. In addition, no internal or external fixator is necessary since the adjacent ribs provide a natural fixation. The surgery uses commercially available supplies, is straightforward to learn, and well-tolerated by the animal. The procedure can be carried out with or without removing the surrounding periosteum, and therefore the contribution of the periosteum to repair can be assessed. Results indicate that if the periosteum is retained, robust repair occurs in 1 - 2 months. We expect that use of this protocol will stimulate research into rib repair and that the findings will facilitate the development of new ways to stimulate bone repair in other locations around the body.

The overall goal of this procedure is to successfully resect a portion of bone from the rib of a mouse. The procedure was developed as a model to study large-scale long bone repair.

Un procedimiento quirúrgico para resecar la costilla del ratón: un modelo a gran escala Reparación huesos largos

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation ...

Busulfan as a Myelosuppressive Agent for Generating Stable High-level Bone Marrow Chimerism in Mice

Bone marrow transplantation (BMT) is often used to replace the bone marrow (BM) compartment of recipient mice with BM cells expressing a distinct biomarker isolated from donor mice. This technique allows for identification of donor-derived hematopoietic cells within the recipient mice, and can be used to isolate and characterize donor cells using various biochemical techniques. BMT typically relies on myeloablative conditioning with total body irradiation to generate niche space within the BM compartment of recipient mice for donor cell engraftment. The protocol we describe here uses myelosuppressive conditioning with the chemotherapeutic agent busulfan. Unlike irradiation, which requires the use of specialized facilities, busulfan conditioning is performed using intraperitoneal injections of 20 mg/kg busulfan until a total dose of 60-100 mg/kg has been administered. Moreover, myeloablative irradiation can have toxic side effects and requires successful engraftment of donor cells for survival of recipient mice. In contrast, busulfan conditioning using these doses is generally well tolerated and mice survive without donor cell support. Donor BM cells are isolated from the femurs and tibiae of mice ubiquitously expressing green fluorescent protein (GFP), and injected into the lateral tail vein of conditioned recipient mice. BM chimerism is estimated by quantifying the number of GFP+ cells within the peripheral blood following BMT. Levels of chimerism&nbsp;>80% are typically observed in the peripheral blood 3-4 weeks post-transplant and remain established for at least 1 year. As with irradiation, conditioning with busulfan and BMT allows for the accumulation of donor BM-derived cells within the central nervous system (CNS), particularly in mouse models of neurodegeneration. This busulfan-mediated CNS accumulation may be more physiological than total body irradiation, as the busulfan treatment is less toxic and CNS inflammation appears to be less extensive. We hypothesize that these cells can be genetically engineered to deliver therapeutics to the CNS.

We describe a protocol whereby busulfan conditioning permits the bone marrow of a recipient mouse to be replaced with bone marrow cells from donor mice ubiquitously expressing green fluorescent protein, in the absence of irradiation. This technique is useful to study bone marrow cell accumulation in the central nervous system.

El busulfán como agente mielosupresor para Generación estable de alto nivel de Médula Ósea quimerismo en ratones

Bone marrow transplantation (BMT) is often used to replace the bone marrow (BM) compartment of recipient mice with BM cells expressing a distinct ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

This protocol describes the induction of an ischemia-reperfusion (IR) model on mouse ear skin using magnet clamping. Using a custom-built intravital imaging model, we study in vivo inflammatory responses post-reperfusion. The rationale behind the development of this technique is to extend the understanding of how leukocytes respond to skin IR injury.

La inducción de la lesión por isquemia-reperfusión en la piel de la oreja del ratón para intravital n fotones de imágenes de la respuesta inmune

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of inner ear gene therapy is to find a delivery method which results in consistent transduction efficiency of targeted cell types while minimizing hearing loss. In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a viable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear. The easy anatomic identification of the posterior semicircular canal, as well as minimal manipulation of the temporal bone required, make this surgical approach an attractive option for inner ear gene delivery.

In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a reliable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear.

Enfoque del Canal Semicircular posterior para la entrega del Gene de oído interno en ratón Neonatal

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

Updated Technique for Reliable, Easy, and Tolerated Transcranial Electrical Stimulation Including Transcranial Direct Current Stimulation

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive method of neuromodulation using low-intensity direct electrical currents. This method of brain stimulation presents several potential advantages compared to other techniques, as it is noninvasive, cost-effective, broadly deployable, and well-tolerated provided proper equipment and protocols are administered. Even though tDCS is apparently simple to perform, correct administration of the tDCS session, especially the electrode positioning and preparation, is vital for ensuring reproducibility and tolerability. The electrode positioning and preparation steps are traditionally also the most time consuming and error-prone. To address these challenges, modern tDCS techniques, using fixed-position headgear and pre-assembled sponge electrodes, reduce complexity and setup time while also ensuring that the electrodes are consistently placed as intended. These modern tDCS methods present advantages for research, clinic, and remote-supervised (at home) settings. This article provides a comprehensive step-by-step guide for administering a tDCS session using fixed-position headgear and pre-assembled sponge electrodes. This guide demonstrates tDCS using commonly applied montages intended for motor cortex and dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC) stimulation. As described, selection of the head size and montage-specific headgear automates electrode positioning. Fully assembled pre-saturated snap-electrodes are simply affixed to the set position snap-connectors on the headgear. The modern tDCS method is shown to reduce setup time and reduce errors for both novice and expert operators. The methods outlined in this article can be adapted to different applications of tDCS as well as other forms of transcranial electrical stimulation (tES) such as transcranial alternating current stimulation (tACS) and transcranial random noise stimulation (tRNS). However, since tES is application specific, as appropriate, any methods recipe is customized to accommodate subject, indication, environment, and outcome specific features.

When administering transcranial direct current stimulation (tDCS), reproducible electrode preparation and placement are vital for a tolerated and effective session. The purpose of this article is to demonstrate updated modern setup procedures for the administration of tDCS and related transcranial electrical stimulation techniques, such as transcranial alternating current stimulation (tACS).

Técnica actualizada para la estimulación eléctrica transcraneal confiable, fácil y tolerada, incluida la estimulación de corriente directa transcraneal

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive method of neuromodulation using low-intensity direct electrical currents. This method of ...

A Revised Method for Inducing Secondary Lymphedema in the Hindlimb of Mice

Animal models are of paramount importance in the research of lymphedema in order to understand the pathophysiology of the disease but also to explore potential treatment options. This mouse model allows researchers to induce significant lymphedema lasting at least 8 weeks. Lymphedema is induced using a combination of fractioned radiotherapy and surgical ablation of lymphatics. This model requires that the mice get a dose of 10 Gray (Gy) radiation before and after surgery. The surgical part of the model involves ligation of three lymph vessels and extraction of two lymph nodes from the mouse hindlimb. Having access to microsurgical tools and a microscope is essential, due to the small anatomical structures of mice. The advantage of this model is that it results in statistically significant lymphedema, which provides a good basis for evaluating different treatment options. It is also a great and easily available option for microsurgical training. The limitation of this model is that the procedure can be time consuming, especially if not practiced in advance. The model results in objectively quantifiable lymphedema in mice, without causing severe morbidity and has been tested in three separate projects.

This animal model enables researchers to induce statistically significant secondary lymphedema in the hindlimb of mice, lasting at least 8 weeks. The model can be used to study the pathophysiology of lymphedema and to investigate novel treatment options.

Un método revisado para inducir el linfedema secundario en la extremidad posterior de los ratones

Animal models are of paramount importance in the research of lymphedema in order to understand the pathophysiology of the disease but also to explore ...