The authors thank Drs. Steven Chu and Joe W. Gray for helpful discussions, Henry Marr for his initial work on the BiFC-PALM project, and Alexis Shoemaker for her technical assistance. This work is supported by startup funds to X.N. from OHSU. Research in the Nan laboratory was also supported by NIH 5U54CA143836-05, the Damon Runyon Cancer Research Foundation, the M. J. Murdock Charitable Trust, and the FEI company.

<ol>
	<li>Braun, P., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+protein-protein+interactions:+From+egg-white+to+complex+networks.">History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks.</a> Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).</li><li>Lasserre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raft+nanodomains+contribute+to+Akt/PKB+plasma+membrane+recruitment+and+activation.">Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation.</a> Nat. Chem. Biol. 4 (9), 538-547 (2008).</li><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol. Cell. 9 (4), 789-798 (2002).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+analysis+as+a+probe+of+protein+interactions+in+living+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells.</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC):+a+5-year+update+and+future+perspectives.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives.</a> Biotechniques. 53, 285-298 (2012).</li><li>Lingwood, D., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Rafts+As+a+Membrane-Organizing+Principle.">Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle.</a> Science. 327 (5961), 46-50 (2009).</li><li>Tian, T., Harding, A., Inder, K., Plowman, S., Parton, R. G., Hancock, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+nanoswitches+generate+high-fidelity+Ras+signal+transduction.">Plasma membrane nanoswitches generate high-fidelity Ras signal transduction.</a> Nat. Cell Biol. 9 (8), 905-914 (2007).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+Localization+Microscopy+with+Bimolecular+Fluorescence+Complementation+(BiFC-PALM)+for+Nanoscale+Imaging+of+Protein-Protein+Interactions+in+Cells.">Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for Nanoscale Imaging of Protein-Protein Interactions in Cells.</a> PloS one. 9 (6), e100589 (2014).</li><li>Manley, S., Gillette, J. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+photoactivated+localization+microscopy+for+mapping+single-molecule+dynamics.">Single-particle tracking photoactivated localization microscopy for mapping single-molecule dynamics.</a> Methods Enzymol. 475, 109-120 (2010).</li><li>Shyu, Y. J., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+complementation:+an+emerging+tool+for+biological+research.">Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research.</a> Trends Biotechnol. 26 (11), 622-630 (2008).</li><li>Fan, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+mCherry+as+a+new+red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+for+visualizing+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (1), 47-53 (2008).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells.">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li><li>Gomez-Martinez, M., Schmitz, D., Hergovich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+human+cell+lines+with+Tetracycline-inducible+(Tet-on)+shRNA+or+cDNA+expression.">Generation of stable human cell lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA expression.</a> J. Vis. Exp. March. (73), e50171 (2013).</li><li>Robida, A. M., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+of+inducible+protein+interactions:+effects+of+factors+affecting+protein+folding+on+fluorescent+protein+fragment+association.">Bimolecular fluorescence complementation analysis of inducible protein interactions: effects of factors affecting protein folding on fluorescent protein fragment association.</a> J. Mol. Biol. 394 (3), 391-409 (2009).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+biosensors+based+on+dimerization-dependent+fluorescent+protein+exchange.">Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange.</a> Nat. Methods. 12 (3), (2015).</li><li>Seidman, C. E., Struhl, K., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+plasmid+DNA+into+cells.">Introduction of plasmid DNA into cells.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Appendix 4, 4D (2001).</li><li>Morrison, S. L., Coligan, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+frozen+bacterial+stocks.">Preparing frozen bacterial stocks.</a> Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3, Appendix 3M (2001).</li><li>Campeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+viral+system+for+expression+and+depletion+of+proteins+in+mammalian+cells.">A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells.</a> PloS One. 4 (8), e6529 (2009).</li><li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+deletion,+insertion,+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnol. 8 (91), (2008).</li><li>Deschout, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precisely+and+accurately+localizing+single+emitters+in+fluorescence+microscopy.">Precisely and accurately localizing single emitters in fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 11 (3), 253-266 (2014).</li><li>Nan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+superresolution+imaging+allows+quantitative+analysis+of+RAF+multimer+formation+and+signaling.">Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (46), 18519-18524 (2013).</li><li>Chenouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+comparison+of+particle+tracking+methods.">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat. Methods. 11 (3), 281-289 (2014).</li><li>Persson, F., Lind&#233;n, M., Unoson, C., Elf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+intracellular+diffusive+states+and+transition+rates+from+single-molecule+tracking+data.">Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data.</a> Nat. Methods. 10 (3), 265-269 (2013).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+and+tracking+of+protein&#8211;protein+interactions+in+sub-diffraction+cellular+space.">Super-resolution imaging and tracking of protein&#8211;protein interactions in sub-diffraction cellular space.</a> Nat. Commun. 5, 1-8 (2014).</li><li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+reveals+structural+features+of+EB1+in+microtubule+plus-end+tracking.">Super-resolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking.</a> Mol. Biol. Cell. 25 (25), 4166-4173 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

BiFC ha sido una técnica comúnmente utilizada para la detección y la visualización de los IBP en las células, mientras que PALM es una técnica de microscopía reciente sola molécula de super-resolución que permite formación de imágenes a nanoescala de muestras biológicas intactas. La combinación de BiFC con PALM logra imagen selectiva de los IBP en el interior de una celda con nanómetros resolución espacial y sensibilidad única molécula. BiFC-PALM extiende la utilidad de ambas técnicas, y como se demues...

Las interacciones proteína-proteína (IBP) son fundamentales para la biología 1 y están estrictamente regulados por mecanismos espacio-temporales en muchas escalas de tiempo y longitud. Los estudios sobre la señalización celular en la membrana celular, por ejemplo, han puesto de manifiesto compartimentos espaciales dinámicas, a nanoescala que facilitan IBP específicos y procesos celulares 2. Por lo tanto, la capacidad para sondear los IBP en los sistemas biológicos con suficientes resoluciones espaciales y temporales, una alta especificidad y alta sensibilidad es clave para lograr una comprensión mecanicista de la biología. Bimolecular complementación de fluorescencia (BiFC) es una de las pocas herramientas existentes para la visualización de los IBP en una celda con resolución subcelular y la compatibilidad de las células vivir 3-5. La técnica es relativamente sencilla y consiste en la división de una proteína de fluorescencia en dos fragmentos no fluorescentes; cuando etiquetados genéticamente para dos proteínas que interactúan ypuesto en proximidad, los fragmentos pueden reconstituir para formar una proteína fluorescente completa, dando señal fluorescente. Cuando se diseñan adecuadamente, sondas BiFC no deben reconstituir de forma espontánea en ausencia de IBP. Como tal, la señal de fluorescencia en un ensayo de BiFC sólo surgir en la presencia de los IBP, que permite la visualización directa de los IBP con alta especificidad. Beneficios adicionales de utilizar la fluorescencia como la lectura son de alta sensibilidad, resolución subcelular, y la compatibilidad con un alto rendimiento y ensayos de cribado de alto contenido, entre otros. Para estos beneficios, una serie de sondas BiFC basados ​​en diferentes proteínas fluorescentes padres se han desarrollado. Como en todas las otras técnicas de detección basados ​​en microscopía de luz convencional, sin embargo, la resolución espacial de BiFC se limita a ~ 250 nm por la difracción de la luz. Esto hace que sea un reto para estudiar la regulación de los IBP en la nanoescala, que, como se aludió antes y ejemplificado por las balsas de lípidos 6and nanoclusters Ras 7, es una escala de longitud crítica para la comprensión de muchos procesos celulares como la señalización. BiFC se ha combinado con microscopía de localización fotoactivado (PALM) 8,9 para superar este límite de la resolución espacial para obtener imágenes de los IBP 10. PALM es una técnica de microscopía de super-resolución reciente que elude el límite de difracción en imágenes de fluorescencia a través de la activación estocástico y localización subdiffractive de moléculas fluorescentes individuales. En cada ciclo de activación, una molécula fluorescente emite unos pocos cientos a unos pocos miles de fotones y da lugar a una sola imagen molécula en el detector. Mientras que la imagen es de difracción limitada (~ 250 nm de anchura), su centroide se puede determinar con precisión mucho mayor, típicamente del orden de un 10-50 nm en función del número de fotones detectados. Mediante la activación y localización de cada molécula fluorescente en la muestra, una imagen de alta resolución puede ser reconstruido. Performed en las células vivas, sola molécula de seguimiento (SMT-) PALM permite además adquisición de miles de trayectorias de difusión proteína a partir de una sola célula 11. Es importante destacar que, PALM utiliza sondas fluorescentes especializados tales como proteínas fluorescentes fotoactivables (PA-PM) para lograr la activación estocástico. Dado que tanto BiFC y proteínas fluorescentes uso PALM, que se combinaron mediante el fraccionamiento de PAmCherry1, un PA-FP comúnmente utilizado para PALM, en dos fragmentos entre los aminoácidos 159 y 160. El sistema basado en PAmCherry1 BiFC dividida muestra una baja señal de fondo de la reconstitución espontánea de los dos fragmentos. Cuando etiquetado genéticamente a un par de proteínas que interactúan, los dos fragmentos (RN = residuos 1 a 159; RC = Met + residuos 160-236) reconstituido de manera eficiente para formar proteínas completas PAmCherry1 incluso a 37 ° C y sin incubación a temperaturas más bajas, lo cual No es el caso de otros pares BiFC 12 como el padre mCherry 13. Furthermore, la proteína PAmCherry1 reconstituido conserva las propiedades fotofísicas del PAmCherry1 padres, tales como alta relación de contraste, rendimiento de fotones medio y fotoactivación rápida, entre otros, que son fundamentales para la exacta localización sola molécula y de imágenes PALM alta resolución. En este protocolo, se describe el uso de BiFC-PALM para obtener imágenes de las interacciones Ras-Raf en células U2OS utilizando dividida PAmCherry1 (Figura 1). El primer paso es el diseño de las construcciones para la expresión de proteínas de fusión entre los fragmentos PAmCherry1 (es decir, RN y RC) y las proteínas de interés. En teoría, para cada par de proteínas candidatas (A y B), hay ocho pares de proteínas de fusión a ensayar: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; y A-RC / B-RN. Este proceso a menudo se puede simplificar teniendo en cuenta las propiedades estructurales o bioquímicas de las proteínas candidatas. En el caso de Ras, la proteína esdespués de la traducción modificado el cuadro de CAAX C-terminal (C = Cys; A = alifático; X = cualquier), después de lo cual el motivo AAX se escinde. Por lo tanto, RN o RC sólo pueden ser fusionados con el extremo N-terminal de Ras; esto reduce el número de pares de proteína de fusión a cuatro (Figura 1B). Para Raf, los dominios Ras vinculante (RBD; residuos 51-131) se utiliza y se pueden etiquetar en cada extremo. Se generaron Estas cuatro configuraciones de fusión: RN-KRas / RC-Raf RBD; RN-KRas / Raf RBD-RC; RC-KRas / RN-Raf RBD; y RC-KRas / Raf RBD-RN. Además, tendrá que ser considerado el enlazador entre los fragmentos y las proteínas de interés. Un enlazador flexible de aproximadamente diez aminoácidos se utiliza a menudo, ya que proporciona la suficiente libertad para la complementación que se produzca. Uno de estos es enlazador (GGGGS) x2, aunque hay muchos otros que se han aplicado con éxito, incluyendo secuencias aleatorias generadas a partir de un sitio de clonación múltiple (MCS) 14. La longitud de los enlazadores puede necesitar ser optimizado depending del tamaño de las proteínas de interés y sus orientaciones cuando interactúan. Los fragmentos PAmCherry1 están contenidos en una pequeña columna vertebral de la clonación con flanqueando MCSs (ver Lista de Materiales). Los genes de interés se pueden insertar a través de los sitios de restricción o con un método de ligadura independiente. Después de la clonación y la secuencia de verificación, el casete de expresión se transfiere a un vector de expresión usando una reacción de recombinasa, un proceso de clonación con alta fidelidad y alta eficiencia. A continuación, las construcciones de expresión resultantes se transfectaron en la línea de célula diana o, si se desea una línea celular estable, empaquetado en lentivirus para infectar la línea celular objetivo. La transfección transitoria permite la validación rápida de las configuraciones BiFC, pero los problemas potenciales debe tenerse en cuenta. La transfección utilizando productos químicos a menudo hace hincapié en las células, lo que resulta en alta autofluorescencia; mientras que el uso del total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopy puede mitigar esta señal de fondo mediante la limitación del volumen de la iluminación, TIRF ideal cuando los IBP tienen lugar en la membrana celular. Además, las transfecciones transitorias a menudo conducen a altos niveles de expresión de proteínas, muy por encima de los de las proteínas endógenas, que pueden causar artefactos en la detección de los IBP. Por lo tanto, se recomienda que se establezcan líneas celulares estables después de una configuración apropiada BiFC se ha determinado a través de pruebas inicial. Las líneas celulares estables también tienen el potencial para la expresión sintonizable mediante doxiciclina inducción 15. Después de la infección, las células se seleccionan con antibióticos, por lo general puromycin y neomicina, uno para cada constructo. Los pasos subsiguientes para la preparación de muestras, la adquisición de imágenes y análisis de datos se describen en detalle en los protocolos. Con este enfoque, la formación de agrupaciones de nanoescala en imágenes BiFC-palma de Ras-Raf RBD se observan rutinariamente (Figura 2A &lt;/ strong&gt;). Consistentemente, trayectorias smt-palma de Ras-Raf RBD muestran una distribución heterogénea en los estados de difusión (Figura 2B-D). Estos resultados sugieren que existen complejos de Ras-Raf en varios estados en la membrana celular, presumiblemente como monómeros y clusters, con potenciales implicaciones biológicas. Este trabajo demuestra el poder de BiFC-PALM en imagen selectiva de los IBP en células con nanómetros resolución espacial y sensibilidad única molécula, que sería difícil de obtener con BiFC convencional, fluorescencia co-localización, o transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET). En el diseño de experimentos BiFC e interpretación de los resultados, es importante tener en cuenta que el proceso BiFC es irreversible en la mayoría de casos, incluyendo PAmCherry1 dividida. Una vez que los dos fragmentos se combinan y forman una proteína PAmCherry1 completa, el enlace entre los dos fragmentos, y por lo tanto el PPI se convierte en permanente. Esto limita el uso de BiFC y BiFC-PALM para el seguimiento de la dinámica de los IBP (es decir, la cinética de unión y no la dinámica de difusión del complejo de proteínas, una vez que se forma) y, a veces incluso podría conducir a mislocalization de los complejos de PPI. Un factor adicional a tener en cuenta en el diseño de experimentos BiFC-PALM es el retraso en la maduración cromóforo que es inherente a las proteínas fluorescentes. Una vez que dos proteínas interactúan y los fragmentos de PF se unen, por lo general refold del orden de segundos (tiempo-medio de 60 seg para EYFP 3). Sin embargo, la maduración cromóforo subsiguiente y la señal fluorescente se desarrollan en el orden de minutos. Mientras que la fluorescencia puede ser detectable en 10 minutos después de la reconstitución de la fracción de Venus, una variante de rápido plegado YFP, el tiempo medio para la maduración en general es a menudo alrededor de 60 min 16. Split-PAmCherry1 se observó a tener tasas similares. Por lo tanto, BiFC y BiFC-PALM son opciones actualmente pobres para el seguimiento de la cinética de PPI en tiempo real; otro yothods, tales como FRET y una proteína fluorescente dependiente de la dimerización recientemente desarrollado 17, pueden ser más adecuados para este propósito.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TIRF Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561 nm dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>&#160;Di01-R405/488/561/635-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561 nm filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-525/45-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405/561 nm notch filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>NF01-405/488/568-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature and CO2 controlled stage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.2-DEST</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12489-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLenti-DEST</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>http://www.addgene.org/Eric_Campeau/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F-531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion HD Cloning</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>639649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR Clonase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vira Power Lentivirus Packaging</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K497500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE Transfection Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>13873800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tek II Chambered Coverglass</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td>#1.5 glass bottom dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U2OS cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T/17 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with phenol red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM no phenol red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovit&#39;s L-15, no phenol red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral concentrator</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retroviral concentrator</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm culture dish</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-418</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>345812</td>
			<td>Neomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycyline</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 nm gold particles</td>
			<td>BBI Solutions</td>
			<td>EM.GC100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midiprep kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL&#160; polypropylene round-bottom tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL polypropylene round-bottom tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>C-3328-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>244610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Competent cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photoactivated localization microscopy with bimolecular fluorescence complementation (bifc-palm)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 &#176;C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

El ejemplo BiFC-PALM mostrado es KRas G12D mutante interactuar con los Ras vinculante dominio (RBD) de FARC (Figura 1). Como se ha discutido, la RN o fragmentos de RC no se marcaron a la C-terminal de Ras, ya que perturbaría la localización de la membrana y por lo tanto la actividad biológica de Ras. Esto reduce las posibles combinaciones de ocho a cuatro (Figura 1B). Cada una de estas cuatro combinaciones se introdujo en células U2OS utilizando la infección lentiviral. Las célula...

Watch this Scientific Journal Video about Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM at JoVE.com

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Fotoactivado Localización Microscopía con bimolecular fluorescencia Complementación (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

photoactivated-localization-microscopy-with-bimolecular-fluorescence

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

9.8K vistas.  Oregon Health and Science University. Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes. 