The authors thank Drs. Steven Chu and Joe W. Gray for helpful discussions, Henry Marr for his initial work on the BiFC-PALM project, and Alexis Shoemaker for her technical assistance. This work is supported by startup funds to X.N. from OHSU. Research in the Nan laboratory was also supported by NIH 5U54CA143836-05, the Damon Runyon Cancer Research Foundation, the M. J. Murdock Charitable Trust, and the FEI company.

<ol>
	<li>Braun, P., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+protein-protein+interactions:+From+egg-white+to+complex+networks.">History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks.</a> Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).</li><li>Lasserre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raft+nanodomains+contribute+to+Akt/PKB+plasma+membrane+recruitment+and+activation.">Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation.</a> Nat. Chem. Biol. 4 (9), 538-547 (2008).</li><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol. Cell. 9 (4), 789-798 (2002).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+analysis+as+a+probe+of+protein+interactions+in+living+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells.</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC):+a+5-year+update+and+future+perspectives.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives.</a> Biotechniques. 53, 285-298 (2012).</li><li>Lingwood, D., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Rafts+As+a+Membrane-Organizing+Principle.">Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle.</a> Science. 327 (5961), 46-50 (2009).</li><li>Tian, T., Harding, A., Inder, K., Plowman, S., Parton, R. G., Hancock, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+nanoswitches+generate+high-fidelity+Ras+signal+transduction.">Plasma membrane nanoswitches generate high-fidelity Ras signal transduction.</a> Nat. Cell Biol. 9 (8), 905-914 (2007).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+Localization+Microscopy+with+Bimolecular+Fluorescence+Complementation+(BiFC-PALM)+for+Nanoscale+Imaging+of+Protein-Protein+Interactions+in+Cells.">Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for Nanoscale Imaging of Protein-Protein Interactions in Cells.</a> PloS one. 9 (6), e100589 (2014).</li><li>Manley, S., Gillette, J. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+photoactivated+localization+microscopy+for+mapping+single-molecule+dynamics.">Single-particle tracking photoactivated localization microscopy for mapping single-molecule dynamics.</a> Methods Enzymol. 475, 109-120 (2010).</li><li>Shyu, Y. J., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+complementation:+an+emerging+tool+for+biological+research.">Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research.</a> Trends Biotechnol. 26 (11), 622-630 (2008).</li><li>Fan, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+mCherry+as+a+new+red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+for+visualizing+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (1), 47-53 (2008).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells.">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li><li>Gomez-Martinez, M., Schmitz, D., Hergovich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+human+cell+lines+with+Tetracycline-inducible+(Tet-on)+shRNA+or+cDNA+expression.">Generation of stable human cell lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA expression.</a> J. Vis. Exp. March. (73), e50171 (2013).</li><li>Robida, A. M., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+of+inducible+protein+interactions:+effects+of+factors+affecting+protein+folding+on+fluorescent+protein+fragment+association.">Bimolecular fluorescence complementation analysis of inducible protein interactions: effects of factors affecting protein folding on fluorescent protein fragment association.</a> J. Mol. Biol. 394 (3), 391-409 (2009).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+biosensors+based+on+dimerization-dependent+fluorescent+protein+exchange.">Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange.</a> Nat. Methods. 12 (3), (2015).</li><li>Seidman, C. E., Struhl, K., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+plasmid+DNA+into+cells.">Introduction of plasmid DNA into cells.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Appendix 4, 4D (2001).</li><li>Morrison, S. L., Coligan, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+frozen+bacterial+stocks.">Preparing frozen bacterial stocks.</a> Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3, Appendix 3M (2001).</li><li>Campeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+viral+system+for+expression+and+depletion+of+proteins+in+mammalian+cells.">A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells.</a> PloS One. 4 (8), e6529 (2009).</li><li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+deletion,+insertion,+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnol. 8 (91), (2008).</li><li>Deschout, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precisely+and+accurately+localizing+single+emitters+in+fluorescence+microscopy.">Precisely and accurately localizing single emitters in fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 11 (3), 253-266 (2014).</li><li>Nan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+superresolution+imaging+allows+quantitative+analysis+of+RAF+multimer+formation+and+signaling.">Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (46), 18519-18524 (2013).</li><li>Chenouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+comparison+of+particle+tracking+methods.">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat. Methods. 11 (3), 281-289 (2014).</li><li>Persson, F., Lind&#233;n, M., Unoson, C., Elf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+intracellular+diffusive+states+and+transition+rates+from+single-molecule+tracking+data.">Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data.</a> Nat. Methods. 10 (3), 265-269 (2013).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+and+tracking+of+protein&#8211;protein+interactions+in+sub-diffraction+cellular+space.">Super-resolution imaging and tracking of protein&#8211;protein interactions in sub-diffraction cellular space.</a> Nat. Commun. 5, 1-8 (2014).</li><li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+reveals+structural+features+of+EB1+in+microtubule+plus-end+tracking.">Super-resolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking.</a> Mol. Biol. Cell. 25 (25), 4166-4173 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

BiFC est une technique couramment utilisée pour détecter et visualiser les cellules dans les IPP, alors que PALM est une technique de microscopie récent seule molécule à hyper-résolution nanométrique qui permet l&#39;imagerie d&#39;échantillons biologiques intacts. La combinaison de BiFC avec PALM atteint imagerie sélective des IPP dans une cellule avec une résolution spatiale de nanomètre et sensibilité unique molécule. BiFC-PALM étend l&#39;utilité de ces deux techniques, et comme l&#39;a démontré dan...

Interactions protéine-protéine (IPP) sont fondamentales pour la biologie 1 et sont strictement réglementés par des mécanismes spatio-temporelles dans de nombreuses échelles de temps et de longueur. Des études sur la signalisation sur la membrane cellulaire cellule, par exemple, ont mis en évidence des compartiments spatiales dynamiques, à l&#39;échelle nanométrique qui facilitent IPP processus cellulaires spécifiques et 2. Par conséquent, la capacité de sonder IPP dans les systèmes biologiques avec des résolutions suffisantes spatiales et temporelles, haute spécificité et une sensibilité élevée est essentielle pour parvenir à une compréhension des mécanismes de la biologie. Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) est l&#39;un des rares outils existants pour visualiser IPP dans une cellule avec une résolution subcellulaire et la compatibilité des cellules vivantes 3 ​​- 5. La technique est relativement simple et implique le fractionnement d&#39;une protéine de fluorescence en deux fragments non fluorescents; lorsque génétiquement marqués à deux protéines interagissant etamené à proximité, les fragments peuvent reconstituer pour former une protéine fluorescente complet, ce qui donne le signal fluorescent. Lorsqu&#39;il est correctement conçu, sondes BiFC ne devraient pas reconstituer spontanément en l&#39;absence des IPP. En tant que tel, le signal de fluorescence dans un essai BiFC ne se posera que dans la présence d&#39;IPP, ce qui permet la visualisation directe des IPP avec une spécificité élevée. Les avantages supplémentaires de l&#39;utilisation de la fluorescence que la lecture sont une haute sensibilité, une résolution subcellulaire, et la compatibilité avec un débit élevé et contenu dosages élevés de dépistage, entre autres. Pour ces avantages, un certain nombre de sondes BiFC basés sur différentes protéines fluorescentes parent ont été développés. Comme dans toutes les autres techniques de détection basées sur la microscopie optique classique, cependant, la résolution spatiale est limitée à BiFC ~ 250 nm par la diffraction de la lumière. Cela en fait un défi pour étudier la régulation des IPP à l&#39;échelle nanométrique, qui, comme évoqué plus haut et illustré par des radeaux lipidiques 6 unee nanoclusters Ras 7, est une échelle de longueur essentielle à la compréhension de nombreux processus cellulaires tels que la signalisation. BiFC a été combinée avec Microscopie Palm (PALM) 8,9 à surmonter cette limite de résolution spatiale pour former une image 10 IPP. PALM est une technique de microscopie à hyper-résolution récente qui contourne la limite de diffraction dans l&#39;imagerie de fluorescence par l&#39;activation et la localisation stochastique subdiffractive de molécules fluorescentes simples. Dans chaque cycle d&#39;activation, une molécule fluorescente émet de quelques centaines à quelques milliers de photons et donnent lieu à une seule image molécule sur le détecteur. Bien que cette image est limité par diffraction (~ 250 nm de large), son centre de gravité peut être déterminée avec une précision beaucoup plus élevée, typiquement de l&#39;ordre de 10 à 50 nm en fonction du nombre de photons détectés. En activant et la localisation de chaque molécule fluorescente dans l&#39;échantillon, une image haute résolution peut être reconstruit. Performed sur les cellules vivantes, seule molécule de suivi (SMT) PALM permet en outre l&#39;acquisition de milliers de trajectoires de diffusion de la protéine d&#39;une cellule unique 11. Surtout, PALM utilise des sondes fluorescentes spécialisées telles que les protéines fluorescentes photoactivables (PA-MF) pour obtenir l&#39;activation stochastique. Depuis deux BiFC et des protéines fluorescentes utilisation PALM, ils ont été combinés en fractionnant PAmCherry1, un PA-FP couramment utilisé pour PALM, en deux fragments entre les acides aminés 159 et 160. Le système basé sur PAmCherry1 BiFC partagé affiche faible signal de fond à partir de la reconstitution spontanée des deux fragments. Lorsque génétiquement marqués à une paire de protéines en interaction, les deux fragments (RN = 1 à 159 résidus de distillation; RC = Met + résidus 160-236) reconstitué de manière efficace pour former des protéines complètes PAmCherry1 même à 37 ° C et sans incubation à des températures plus basses, ce qui est pas le cas pour d&#39;autres paires BiFC 12 comme le parent mCherry 13. Furthermore, la protéine de PAmCherry1 reconstitué conservé les propriétés photophysiques du PAmCherry1 mère, comme rapport de contraste élevé, rendement photonique moyen et photoactivation rapide, entre autres, qui sont essentiels pour la précision de localisation de la molécule unique et PALM imagerie à haute résolution. Dans ce protocole, l&#39;utilisation de BiFC-PALM pour imager interactions Ras-Raf dans des cellules en utilisant U2OS scission PAmCherry1 (figure 1A) est décrite. La première étape consiste à concevoir des constructions pour l&#39;expression de protéines de fusion entre des fragments PAmCherry1 (c.-à-RN et RC) et les protéines d&#39;intérêt. En théorie, pour chaque paire de protéines candidates (A et B), il y a huit paires de protéines de fusion à tester: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; et A-RC / B-RN. Ce processus peut souvent être simplifié en prenant en compte les propriétés structurales ou biochimiques des protéines candidates. Dans le cas de Ras, la protéine estmodifiée après traduction à la boîte CAAX C-terminal (C = Cys; A = aliphatique; X = y en a), après quoi le motif de AAX est clivé. Par conséquent, RN ou RC ne peuvent être fusionnés à l&#39;extrémité N-terminale de Ras; ce qui réduit le nombre de paires de protéines de fusion à quatre (figure 1B). Pour Raf, le domaine Ras-contraignant (RBD; résidus 51-131) sont utilisées et peuvent être étiquetés à chaque extrémité. Ces quatre configurations de fusion ont été générés: RN-KRAS / RC-Raf RBD; RN-KRAS / Raf-RBD RC; RC-KRAS / RN-Raf RBD; et RC-KRAS / Raf RBD-RN. En outre, l&#39;agent de liaison entre les fragments et les protéines d&#39;intérêt devra prendre en compte. Un lieur flexible d&#39;environ dix acides aminés est souvent utilisé car il offre une liberté suffisante pour la complémentation de se produire. Une telle liaison est (GGGGS) x2, mais il ya beaucoup d&#39;autres qui ont été appliquées avec succès, y compris des séquences aléatoires générées à partir d&#39;un site de clonage multiple (MCS) 14. La longueur des segments de liaison peut avoir besoin d&#39;être optimisé depending sur la taille des protéines d&#39;intérêt et leurs orientations lors de l&#39;interaction. Les fragments de PAmCherry1 sont contenues dans une petite épine dorsale de clonage avec accompagnement PMM (voir liste des matières). Les gènes d&#39;intérêt peut être inséré via les sites de restriction ou avec un procédé de ligature indépendante. Après vérification de la séquence et le clonage, la cassette d&#39;expression est transféré dans un vecteur d&#39;expression en utilisant une réaction de recombinase, un procédé de clonage avec une grande fidélité et une grande efficacité. Ensuite, les constructions d&#39;expression résultants sont transfectés dans la lignée cellulaire cible ou, si une lignée cellulaire stable est souhaitée, conditionné dans des lentivirus pour infecter la lignée cellulaire cible. Transfection transitoire permet de valider rapidement les configurations BiFC, mais les problèmes potentiels doit être noté. Transfection en utilisant des produits chimiques souvent souligne les cellules, entraînant une forte auto-fluorescence; tandis que l&#39;utilisation totale de la fluorescence à réflexion interne (FRBR) microscopy peut atténuer ce signal de fond en limitant le volume de l&#39;éclairage, la FRBR idéal lorsque les IPP ont lieu sur la membrane cellulaire. En outre, des transfections transitoires conduisent souvent à des niveaux élevés d&#39;expression de protéines, dépassant de loin celles des protéines endogènes, qui peuvent causer des artefacts à détecter les IPP. Par conséquent, il est recommandé que les lignées cellulaires stables sont établies après une configuration BiFC appropriée a été déterminée par l&#39;essai initial. Des lignées cellulaires stables ont également le potentiel pour l&#39;expression accordable par induction 15 doxycycline. Après l&#39;infection, les cellules sont sélectionnées avec des antibiotiques, typiquement la puromycine et à la néomycine, une pour chaque construction. Les étapes suivantes de préparation de l&#39;échantillon, l&#39;acquisition de l&#39;image, et l&#39;analyse des données vont être décrits en détail dans les protocoles. Avec cette approche, la formation de grappes à l&#39;échelle nanométrique en images BiFC-paume de Ras-Raf RBD sont régulièrement observé (figure 2A &lt;/ strong&gt;). Constamment, les trajectoires SMT-paume de Ras-Raf RBD montrent une distribution hétérogène dans les Etats de diffusion (figure 2B-D). Ces résultats suggèrent que les complexes de Ras-Raf existent dans de multiples états sur la membrane cellulaire, probablement en tant que monomères et des grappes, avec des conséquences biologiques potentiels. Ce travail démontre la puissance de BiFC-PALM en imagerie sélective des IPP dans les cellules avec une résolution spatiale de nanomètre et sensibilité unique molécule, ce qui serait difficile à obtenir avec BiFC conventionnelle, la fluorescence co-localisation, ou le transfert d&#39;énergie de résonance de fluorescence (FRET). Lors de la conception des expériences BiFC et interpréter les résultats, il est important de garder à l&#39;esprit que le processus est irréversible BiFC dans la plupart des cas, y compris PAmCherry1 scission. Une fois que les deux fragments se combinent et forment une protéine de PAmCherry1 complet, la liaison entre les deux fragments, et donc l&#39;IPP devient permanente. Ceci limite l&#39;utilisation de BiFC et BiFC-PALM pour la surveillance de la dynamique des IPP (c.-à-cinétique de liaison et pas la dynamique de diffusion du complexe protéique fois qu&#39;il est formé) et parfois pourrait même conduire à une mauvaise localisation des complexes de PPI. Un autre facteur à considérer lors de la conception des expériences BiFC-Palm est le retard dans la maturation chromophore qui est inhérente à des protéines fluorescentes. Une fois que deux protéines interagissent et les fragments de PF se réunissent, ils replient généralement de l&#39;ordre de secondes (à mi-temps de 60 sec pour EYFP 3). Toutefois, après maturation chromophore fluorescent et se développent sur le signal de l&#39;ordre de minutes. Alors que la fluorescence peut être détectable dans les 10 min après reconstitution du split-Vénus, une variante rapide pliage YFP, la mi-temps pour la maturation en général est souvent autour de 60 min 16. Split-PAmCherry1 a été observé que des taux similaires. Par conséquent, BiFC et BiFC-PALM sont des choix actuellement pauvres pour le suivi cinétique de PPI en temps réel; autre methodes, comme FRET et une dimérisation récemment développé la protéine fluorescente dépendante 17, peut être plus adapté à cet effet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TIRF Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561 nm dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>&#160;Di01-R405/488/561/635-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561 nm filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-525/45-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405/561 nm notch filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>NF01-405/488/568-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature and CO2 controlled stage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.2-DEST</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12489-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLenti-DEST</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>http://www.addgene.org/Eric_Campeau/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F-531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion HD Cloning</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>639649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR Clonase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vira Power Lentivirus Packaging</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K497500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE Transfection Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>13873800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tek II Chambered Coverglass</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td>#1.5 glass bottom dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U2OS cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T/17 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with phenol red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM no phenol red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovit&#39;s L-15, no phenol red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral concentrator</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retroviral concentrator</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm culture dish</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-418</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>345812</td>
			<td>Neomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycyline</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 nm gold particles</td>
			<td>BBI Solutions</td>
			<td>EM.GC100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midiprep kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL&#160; polypropylene round-bottom tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL polypropylene round-bottom tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>C-3328-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>244610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Competent cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photoactivated localization microscopy with bimolecular fluorescence complementation (bifc-palm)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 &#176;C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

L&#39;exemple BiFC-PALM est montré KRAS mutant G12D interagir avec les Ras domaine de liaison (RBD) du CRAF (figure 1A). Comme on le verra, le RN ou fragments sont marqués RC à l&#39;extrémité C-terminale de Ras, car il perturberait la localisation membranaire et donc l&#39;activité biologique de Ras. Cela réduit les combinaisons possibles de huit à quatre (figure 1B). Chacune de ces quatre combinaisons a été introduit dans des cellules en utilisant U2OS infection lentivirale....

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Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Photoactivés Localisation Microscopie avec Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

9.8K vues.  Oregon Health and Science University. Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes. 