Nuestro protocolo facilita la preparación de ratones modificados genéticamente de forma fácil, eficiente y rápida a partir de embriones de ratón de células individuales. Nuestro protocolo combina el uso de embriones de una célula descongelación y electroporación permitiendo la rápida generación de ratones modificados genéticamente, incluidos los ratones mutantes a alta eficiencia y bajas tasas de mosaico. Para la fertilización in vitro, comience por super ovular cuatro u ocho semanas de edad hembra C57BL/6J ratones a través de inyección intraperitoneal de 7.5 unidades internacionales de gonadotropina sérica de yegua embarazada seguida de inyección intraperitoneal de 7.5 unidades internacionales de gonadotropina coriónica humana 48 horas más tarde.
A continuación, retire el cauda epidídimo de los ratones C57BL/6J machos de tres a cinco meses de edad sexualmente maduros y use una aguja disección para extraer coágulos de espermatozoides. Luego incubar los coágulos en una caída de 200 microlitros de HTF a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante 1,5 horas para la capacitación. 16 a 18 horas después de la inyección de gonadotropina coriónica humana, recoger complejos de ovocitos cúmulos de los oviductos e incubar los complejos con 200 microlitros de HTF cubiertos con parafina líquida para una incubación no más de dos horas en la incubadora de cultivo celular.
Al final de la incubación, añadir de uno a cinco microlitros de suspensión de espermatozoides desde el límite del medio de incubación a la caída de 200 microlitros de complejos de ovocitos cúmulos y colocar el co-cultivo en la incubadora de cultivo celular durante tres horas. Al final de la incubación, lavar los ovocitos con potasio suplementado medio de optimización simplex tres veces para eliminar cualquier esperma restante y células cúmulos y utilizar un microscopio invertido para comprobar la formación pronuclear y el grado de los embriones de una célula. Para una criopreservación de embriones celulares, transfiera los embriones a una nueva caída de 200 microlitro de HTF complementada con un 20% de suero bovino fetal para una incubación de 10 minutos en la incubadora de cultivo celular.
Al final de la incubación, transfiera de 20 a 100 embriones a 50 microlitros de una solución molar de dimetil sulfóxido y transfiera hasta 100 embriones en cinco microlitros de solución al fondo de un criotubo. Enfríe los embriones durante cinco minutos a cero grados Celsius antes de agregar 45 microlitros de solución DAP213 por el lado del tubo. Después de tapar, mantenga las células durante cinco minutos adicionales a cero grados Celsius antes de almacenar rápidamente el tubo en nitrógeno líquido.
Preparar un microgramo por microlitro de ARN CRISPR y un microgramo por microlitro de tracrRNA en un medio mínimo esencial de suero reducido. Agregue seis microlitros de cada solución de ARN a 42 microlitros de tampón libre de nucleasas y coloque la mezcla en un calentador seco durante tres minutos a 95 grados centígrados. Al final de la incubación, enfríe la mezcla a temperatura ambiente durante cinco minutos y prepare un microgramo por microlitro de proteína HiFi Cas9 con un medio mínimo esencial en suero reducido.
Añada seis microlitros de la solución HiFi Cas9 diluida a la solución de ARN y transfiera hasta 100 embriones descongelados a 25 microlitros de la solución compleja de ribonucleoproteína resultante en un portaobjetos de vidrio entero. Luego incubar embriones durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Para la electroporación embrionaria, al final de la incubación, establezca los parámetros del electroporador y cargue el portaobjetos en el electroporador.
La electroporación debe realizarse dentro de una hora después de la descongelación del embrión para garantizar que la edición del genoma se produzca antes de la primera replicación del ADN y para prevenir el mosaico. Después de la electroporación, lavar los embriones tres veces con tampón modificado de bicarbonato Krebs-Ringer dos medio en dos lavados con una gota de medio de optimización simplex suplementado con potasio cubierto con parafina líquida. Luego incubar los embriones en un medio de optimización simplex suplemento de potasio fresco en la incubadora de cultivo celular durante la noche.
El uso de este método de criopreservación modificado para embriones unicelulares mejora la tasa de desarrollo de los embriones congelados a la etapa de dos células. Usando este método, todos los ratones generados en este experimento representativo eran albinos con un solo ratón de mosaico que llevaba una capa con manchas blancas y negras. Aquí se puede observar una sección representativa de un cromatograma de un ratón albino que contiene el alelo M1.
Como se ilustra, el protocolo puede generar ratones knockout y knock-in con alta eficiencia y bajas tasas de mosaico. De hecho, la descendencia F1 de la descendencia homocigota F0 son heterocigotas que contienen un alelo mutante y un alelo de tipo salvaje sin mutaciones dispares. Recuerde que el óvulo fertilizado es frágil en una etapa de una célula.
La adición de suero bovino fetal refuerza el embrión. Sin embargo, debe ser manejado cuidadosamente en cada paso. Este método puede contribuir al análisis de la función génica y la investigación en enfermedades humanas al facilitar una producción más rápida y eficiente de ratones modificados genéticamente.
