Los autores agradecen la Fundación Leducq (mitral) y la Agence Nationale pour la Recherche (ANR conceder Specistem) para la financiación de esta investigación.

1. Preparación Animal procedimientos Obtener la aprobación de un comité ético de los animales y seguir las directrices institucionales para el trabajo con virus, HuESC y / o de IPSC (cuando corresponda), así como el manejo del ratón, la obtención de embriones de ratón, y la realización de la cirugía de ratón. Para apareamientos programados, el día de la clavija es considerado el día embrionario (E) 0,5 / 0,5 días post-coito. <ol><li> Agujas de microinyección: Para ex utero microinyección, tire de pipetas de vidrio (1,2 mm tubos capilares de borosilicato de diámetro externo) con un extractor de pipeta / beveller conseguir un m diámetro de la punta interna 1 o 10 y una forma cónica y punta afilada para inyectar ADN o células, respectivamente. Para las inyecciones de ultrasonido mediada, un uso personalizado agujas estériles, que tienen un diámetro exterior / interior (OD / ID) de 1,14 mm/0.53 mm, con una punta de 50/35 micras OD / ID. </li><li> Placas de Petri llenas-Silicio: Preparar de silicio como se describe en el manual. Llenarun vaso limpio 60 mm de diámetro placa de Petri con una capa de elastómero de ~ 1 cm. Evite las burbujas de aire. </li><li> Instrumentos: Mantenga todos los instrumentos quirúrgicos estériles, antes y durante el procedimiento. </li><li> Preparación de ADN: Añadir 3 g de ADN y 12 l de Opti-MEM en un solo tubo. Añadir 3 l Lipofectamine 2000 y 12 l de Opti-MEM en otro tubo. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente y mezclar ambas soluciones. Utilizar inmediatamente. </li><li> Preparación de las células: Preparar una suspensión de 10 6 células / ml DMEM (Dulbecco medio Eagle, alta glucosa y 50% de suero de rata). 50 l de la suspensión celular final es suficiente para 8-10 embriones. </li><li> Teñir el preparado: Utilice el verde fluorescente CDCFDA-SE a 25 mg / ml de DMSO. Preparar 20 ml de alícuotas y se almacena a -20 ° C. Diluir 1:100 / 1:200 en solución salina estéril o PBS antes de su uso. </li><li> Preparación de virus: Utilice una PGK-GFP-expresando lentivirus comercial de 3 ª generación con un título de ~ 10 9 -10 10 transducing unidades / ml de DMEM. Para la preparación de los lentivirus, ver Tiscornia et al. 14 Llevar equipo de protección personal y de usar y disponer de los virus de forma segura. </li></ol> 2. Colección de E9.5 y E10.5 embriones para ex vivo Inyección <ol><li> La eutanasia a un ratón embarazadas en el día embrionario 9.5 o 10.5. </li><li> Esterilizar el pecho y el abdomen del ratón con etanol al 70%. </li><li> Se practica una incisión en la línea media ventral para abrir el abdomen y recuperar el cuerno uterino a TA en PBS y transferirlo después de dos lavados con PBS a una placa de Petri de silicona llena con medio M16. </li><li> Pin el cuerno uterino con los pins de insectos a la capa de silicona de manera que el lado vascularizado del útero es en la parte inferior. </li><li> Cortar la superficie del útero con unas pinzas finas, y una tapa de la decidua a 1 mm por debajo de la superficie. </li><li> Recuperar suavemente el embrión en el saco vitelino mediante la difusión de las paredes de la decidua. </li><li> Guarde los embriones a los 37 °; C en M16 medio antes de la inyección de células. Para la inyección, cada embrión se transfiere al plato de silicona rellena con medio M16 pre-calentado a 37 ° C. </li></ol> 3. ADN o la inyección de células bajo un estereomicroscopio <ol><li> Llene la pipeta de vidrio de la parte posterior con una jeringa Hamilton y agite la pipeta para eliminar las burbujas en la punta. </li><li> Establezca la pipeta en el soporte de la microinyección; ajustar la presión de mantenimiento a 50 (ADN) o 30 (células) hPa, y la presión de inyección a 150 (ADN) a 300 (células) hPa. Establezca el tiempo de inyección de 0,2 seg (ADN) o 0,5 segundos (células). Estas configuraciones pueden variar según el tipo de microinyector y pipeta. </li><li> Pin el embrión a la parte inferior de silicona a través del saco vitelino sin tocar el propio embrión. Ver la región del corazón y abrir el saco justo por encima de esta región. </li><li> Añadir 4 pins de todo el embrión para evitar cualquier movimiento durante la inyección de células. </li><li> Usando el micromanipulador (establecido en manual), slowlposición y la punta de la pipeta en un ángulo de 45 ° por encima del pericardio, justo por encima de la región del corazón que se va a inyectar (Figura 1). </li><li> Mover la pipeta en la región de interés y desencadenar la inyección. Sacar la pipeta lo más rápido posible. Asegúrese de que el corazón está latiendo apropiadamente después de la inyección de ADN / célula. </li></ol> 4. Embryo, Aislado Corazón y explante cultura <ol><li> Cultura los embriones E9.5 en 25% M2 medio y 75% de suero de rata, suplementado con penicilina / estreptomicina, pre-calentado a 37 ° C y oxigenada con 40% de O 2. </li><li> Añadir 2 ml de medio de cultivo en un tubo de vidrio de 25 ml, añadir suavemente el embrión, y de compuestos oxigenados con 40% de O 2 antes de atornillar la tapa en el tubo. Incubar hasta 36 horas a 37 ° C, mientras que la rotación o agitación (30 rotaciones / min). </li><li> En el punto de tiempo deseado (por ejemplo, 24 horas), diseccionar los corazones cuidadosamente con unas pinzas finas, sin tocar los corazones, por primera decapitating los embriones; el corazón es fácil especiales tirando de él con el tracto de salida distal. </li><li> Cultura del corazón aislado para otro 36-48 h en DMEM con 50% de FCS en un inserto recubierto Matrigel situado en una placa de 12 pocillos. Ver Dyer y Patterson (2013) para un protocolo mejorado de la cultura del corazón 15. </li><li> Haga cualquier explante de la región de interés. A modo de ejemplo, diseccionar el canal aurículo-ventricular (AVC) y la cultura que durante 48 horas en el colágeno tipo 1 gel 16. </li></ol> 5. Inyección guiada por ultrasonido en el corazón de I n utero <ol><li> Configuración de la máquina de ultrasonido y microinyector: <ol><li> Utilice el sistema de ultrasonido de alta resolución con un transductor de 40 MHz y configuración microinyección en un carril. </li><li> Ajuste el volumen de inyección en el microinyector a 69 nl por inyección. Consulte el manual de la microinyección del fabricante para la programación de la microinyector. </li></ol></li><li> Preparación de la microiconfiguración njection e inyección: <ol><li> Coloque una micropipeta de vidrio en el microinyector. Para asegurar la eficiente inyección, primera capa de la parte interior de la pipeta con aceite mineral mediante la aspiración de hasta el volumen máximo. Luego extraiga el aceite nuevo, dejando 1-2 mm de aceite dentro de la aguja. </li><li> Aspirar el inyectado hasta que se alcanza el volumen máximo. Tenga cuidado de no tocar ninguna superficie con la punta de la aguja, ya que esto embotar la punta y hacer que la inyección sea más difícil. </li><li> Para estabilizar el cuerno uterino que contiene los embriones durante la inyección, utilice un plato de Petri modificado con un agujero en el medio (2.5 cm de diámetro), cubierto por una membrana delgada de silicona con un pequeño corte de la abertura en el centro, y coloque por encima de la zona de la incisión . Estabilizar la placa de Petri en la tabla de gestión de ratón mediante la colocación de 3-4 grupos de arcilla debajo de los bordes del plato. </li></ol></li><li> Procedimiento de inyección: <ol><li> Afeitar el abdomen de una embarazada ratón (en la fase embrionaria se desea) antes de la anestesiasia para eliminar el vello. Tratar el abdomen con un agente de eliminación de pelo química para eliminar el vello residual y esterilizar con etanol al 70%. </li><li> Anestesie un ratón embarazadas con oxígeno / isoflurano a través de una máscara facial. Utilice 3-5% de isoflurano en oxígeno al 100% para la anestesia inicial, seguido de 1-1,5% durante el resto del procedimiento. Asegúrese de que el ratón está adecuadamente anestesiado pellizcando suavemente sus patas y / o la cola. </li><li> Coloque el ratón en decúbito supino sobre la mesa el manejo del ratón (puesto a calentar a 37 ° C) y cubrir los ojos con lubricante para evitar la deshidratación de la córnea. </li><li> Aplique el gel de electrodos en los electrodos y la cinta de las patas a los electrodos para controlar la frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria, y ECG. Coloque un termómetro rectal para monitorear la temperatura corporal. </li><li> Verifique primero que el ratón está embarazada de visualizar y contar los embriones por ecografía. Aplique el gel de ultrasonido en el abdomen y la posición de la cabeza de la exploración por encima de la vejiga. Para mantener la coherencia, visualizar la vejiga primero,y contar los embriones en la izquierda y derecha cuernos uterinos, partiendo de la posición de la vejiga. Asegúrese de que los corazones de embriones están latiendo normalmente. </li><li> Si el ratón está embarazada, coloque la placa de Petri por encima del futuro sitio de la incisión con arcilla. Presione el plato ligeramente en el abdomen para que el plato está en contacto directo. </li><li> Quite el plato y esterilizar el abdomen de nuevo. Hacer un 1.5-2 cm de incisión de línea media ventral, aproximadamente 0,75-1 cm por encima de la vagina, para abrir el abdomen y el peritoneo. Evite lesiones en los órganos internos. </li><li> Exteriorizar la izquierda o la trompa uterina derecha con pinzas, tire de él a través de la membrana de silicio de la placa, y estabilizar el plato en la arcilla de nuevo. Prevenir extensa tracción o manipulación, ya que esto puede causar sangrado de los vasos uterinos y la muerte prematura de la hembra y / o embriones. </li><li> Cuente los embriones de nuevo para garantizar el mantenimiento de registros adecuados de los cuales se inyectaron embriones. </li><li> Aplique el gel de ultrasonido en la ucuernos terine a la imagen del corazón y para prevenir la deshidratación. </li><li> Imagen de la primera embrión a inyectar. Compruebe latido normal del corazón embrionario y llevar un registro de la orientación-cráneo-caudal y de izquierda a derecha del embrión. Si es necesario, vuelva a colocar el cuerno uterino ligeramente para asegurar la orientación correcta. Si esto resulta difícil, pasar a la siguiente embrión. </li><li> Perforar el útero cuidadosamente con la aguja de microinyección para colocar la aguja en un ángulo de 45 ° por encima del embrión, ligeramente fuera del pericardio (Figura 3). Para el marcaje de las células epicárdicas, la imagen del corazón de una de cuatro cámaras y la posición de la aguja de manera que apunte hacia la ranura aurículo-ventricular (Figura 3). Si el ángulo es necesario ajustar, retirar la aguja, y la posición. No ajuste el ángulo con la aguja dentro del útero, ya que esto podría romper la aguja. Evite perforar otros tejidos, tales como los miembros o de la placenta. </li><li> Mueva la agujasobre la pared pericárdica y pincharla con un movimiento suave, pero rápida. En general, habrá un poco de resistencia, pero moviendo la aguja demasiado rápido puede causar que la punta de la aguja para perforar el corazón mismo. La punta debe terminar en el espacio pericárdico del surco aurículo-ventricular. En el caso de una hemorragia pericárdica, las células sanguíneas serán visibles como un patrón similar a la nieve blanca. Si este es el caso, dejar de inyectarse el embrión y pasar a otro embrión. </li><li> Se inyecta la sustancia inyectada. Inyectar como máximo 700 nl en el espacio pericárdico para evitar efectos adversos sobre el desarrollo de los corazones. Supervisar la correcta inyección por una ligera inflamación, temporal del saco pericárdico. </li><li> Después de la inyección, retire la aguja y confirmar que inyectado todavía se puede expulsar a asegurarse de que la aguja no estaba atascado por fragmentos de tejido. </li><li> Vuelva a colocar la tabla de gestión de la imagen y se inyecta la siguiente embrión. Mantener el número de embriones inyectados a máxima 3-4 (en un cuerno uterino) para evitaranestesia prolongada, para permitir el control de embriones en el cuerno uterino opuesto, y para garantizar que el procedimiento no perturbó el desarrollo embrionario. </li><li> Después de inyectar el número deseado de embriones, eliminar el exceso de gel de ultrasonido y coloque suavemente el cuerno uterino en el abdomen en su posición correcta. </li><li> Cierre el abdomen materno mediante el uso de una capa de sutura para el peritoneo y los músculos abdominales, y una segunda capa de sutura para la piel. </li><li> Inyectar el ratón con la primera dosis de la medicación para el dolor. Utilice una inyección de 0,05-0,1 mg / kg de buprenorfina 15 minutos antes de poner fin a la anestesia y tres inyecciones adicionales con intervalos de 12 h. </li><li> Deje de anestesia y vigilar el ratón para la recuperación adecuada del procedimiento. Casa del ratón embarazada en una jaula individual para la duración deseada de seguimiento. </li></ol></li></ol>

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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tools+for+the+developmental+biologist:+ultrasound+biomicroscopy+of+mouse+embryonic+development.">Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development.</a> Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).</li><li>Dyer, L. 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Los autores no tienen nada que revelar.

Los in vivo protocolos intra-cardíacos ex inyección descritos anteriormente están diseñados para preservar la función miocárdica durante al menos 48 horas a mediados de la etapa (E9.5-E11.5 embriones de ratón). Estos enfoques de inyección permiten para inyección espacialmente selectiva de ADN o células. Los pocos ejemplos que se muestran en las figuras 1-3 proporcionan una prueba de concepto para delinear ex vivo e in vivo los mecanismos moleculares de los p...

Hace más de una década, las células madre embrionarias humanas (HuESCs) se han derivado de blastocistos humanos 1. Desde entonces, estas células han sido objeto de un importante campo de investigación que se ocupa de las cuestiones no cubiertas en la biología del desarrollo humano. HuESCs han proporcionado, además, las esperanzas en la medicina regenerativa. En los últimos años, las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs humanos) se han generado a partir de células somáticas específicas del paciente, proporcionando modelos de enfermedad genética 2. Muchos en los protocolos in vitro para la diferenciación de células madre embrionarias pluripotentes inducidas o hacia diferentes linajes de células, incluyendo los linajes del corazón 3, han sido reportados. Las células diferenciadas son a menudo fenotipados por análisis de ARN y la expresión de proteínas, inmunotinción, y / o en las pruebas funcionales in vitro. Sin embargo, los derivados de células madre pluripotentes tienen que ser colocados en un entorno embrionario adecuado con el fin de probar si adquieren plenamente la CELl destino de su contraparte embrionario y si recapitulan la función genuina en vivo en respuesta a las señales regionales. Mientras que la ingeniería de tejidos es prometedor, aún no ofrece todas las señales conocidas y desconocidas de la adecuada in vivo el tejido embrionario en desarrollo 4,5. Etiquetado celular con tintes o vectores retrovirales en los embriones, incluyendo embriones de ratón, han traído información importante sobre el origen embrionario de los linajes de células durante el desarrollo cardíaco 6. Por ejemplo, la inyección de colorante en el espacio pericárdico de embriones de ratón ex vivo, seguido por cultivo in vitro de corazones aislados, se utilizó para marcar las células epicárdicas y sus descendientes 7. Sin embargo, el tinte y el etiquetado de células retroviral se han aplicado sobre todo a los embriones tempranos de ratón con órganos aún poco desarrolladas, o embriones de pollo, que son de más fácil acceso 8. Una excepción es el cerebro, que es más fácil de apuntar en la direcciónmbryos 9,10. Este enfoque aún no se ha aplicado a la superando corazón embrionario de ratón. Para complementar el marcaje directo con tintes o virus y para realizar el seguimiento en el linaje más avanzados embriones de ratón de la etapa y ratones adultos, el mecanismo de etiquetado de células se ha combinado con el análisis de los ratones transgénicos usando la tecnología Cre / Lox. El enfoque de Cre / Lox 11 sin embargo ofrece algunas limitaciones debido a la especificidad espacio-temporal de las regiones reguladoras genómicas utilizadas para dirigir la expresión de la recombinasa, y la eficiencia de la recombinación Cre / Lox 12. Además, este enfoque no aborda completamente las preguntas específicas de la adquisición de la migración impulsada por células de destino de la célula, ya que sólo puede etiquetar un precursor después de la activación de la región reguladora utilizada para conducir la expresión de Cre. También no se puede aplicar a los embriones humanos para cuestiones éticas obvias. Teniendo en cuenta estas limitaciones, hemos diseñado una serie de nuevos protocolos para inyectar una variedad de agentes de marcaje de células, tales como colorantes fluorescentes, virus, moduladores de expresión de genes tales como shRNAs y vectores de etiquetado de células basadas en el ADN, o células en el embrión de ratón en E9.5 y etapas posteriores del desarrollo en regiones seleccionadas de la corazón. Las inyecciones de ADN / celulares utilizan un microscopio estereoscópico y un dispositivo de microinyección sencillo con ex vivo el cultivo de embriones de hasta 48 horas, o el corazón aislado o cultivo de explantes de embriones de 48 a 72 h. Nos informan también un protocolo de microinyección por ultrasonidos mediado en ratón corazones embrionarios en el útero. Esta técnica permite monitorear el desarrollo de los embriones de 13 y permite un seguimiento a largo plazo de los injectates y / o células marcadas. Hemos encontrado que estos enfoques preservar la función del órgano y proporcionan un entorno más representativo que las pruebas in vitro de potencial de células madre. También proporciona la oportunidad de seguir la migraciónde la etiqueta y / o inyectado células para controlar su destino. En última instancia, esto debería producir una mejor comprensión de los patrones de tejido regional y los procesos biológicos clave.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="986">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Setups / Hardware</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:411px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">40 MHz Transducer</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td>MS550S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microinjector</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td>5242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td>5171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>required to pressurize the injector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Rail system</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">rotator</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>to rotate glass tube with embryos inside the incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Standard incubator</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>5% CO2, 37 C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:175px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;">Discovery. V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Vevo 2100</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microinjection</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">borosilicate capillary tubes</td>
			<td style="width:175px;">World Precision Instrument</td>
			<td style="width:104px;">KTW-120-6</td>
			<td>1.2 mm external diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pipette puller&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sutter</td>
			<td style="width:104px;">Model P87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">microinjection needles</td>
			<td>Origio-Humagen&#160;</td>
			<td>C060609</td>
			<td>OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hamilton syringes&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Petridishes</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Silicon membrane</td>
			<td style="width:175px;">Visualsonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>4.3x4.3 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Play-Doh</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:175px;">Vet One</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hair removal agent&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Nair</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:297px;">eye lubricant</td>
			<td style="width:175px;">Optixcare</td>
			<td>31779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Electrode gel (Signa)</td>
			<td style="width:175px;">Parker</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Suture</td>
			<td style="width:175px;">Sofsilk 5-0</td>
			<td style="width:104px;">S1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ultrasound gel</td>
			<td style="width:175px;">Aquasonic</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride)</td>
			<td style="width:175px;">Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.</td>
			<td style="width:104px;">NDC 12496-0757-1</td>
			<td>0.05-0.1 mg/kg in saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glass petridishes</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>60mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">insect pins&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Media and culture reagents</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optimem medium</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">51985026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M2 medium&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Eagle Medium</td>
			<td style="width:175px;">Lonza</td>
			<td style="width:104px;">BE12-640F</td>
			<td>high glucose and 50% rat serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M16 medium&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">M7292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">rat serum</td>
			<td style="width:175px;">Janvier</td>
			<td style="width:104px;">ODI 7158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pennicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">15140-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">oxygen 40%</td>
			<td style="width:175px;">Air liquid</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>required to oxygenate the embryo culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:104px;">RVJ35882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">matrigel</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">collagen type I</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">354236</td>
			<td>to coat culture dishes for explant culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">culture dishes</td>
			<td style="width:175px;">Dutcher /Orange</td>
			<td style="width:104px;">131020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Injectates</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDCFDA-SE&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Molecular Probes&#160;</td>
			<td>C1165</td>
			<td>25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PGK-GFP-expressing lentivirus&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>~8E9 transducing units/ml DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell labeling and injection in developing embryonic mouse hearts

Probando el destino de la célula de vástago derivados embrionarios o pluripotentes en protocolos in vitro ha conducido a resultados controvertidos que no reflejan necesariamente su potencial in vivo. Preferiblemente, estas células deben ser colocados en un entorno embrionario adecuado con el fin de adquirir su fenotipo definido. Por otra parte, el linaje celular rastreo estudios en el ratón después de etiquetar las células con colorantes o vectores retrovirales se ha mantenido mayormente limitada a los embriones de ratón en fase inicial con los órganos todavía poco desarrollados. Para superar estas limitaciones, hemos diseñado protocolos de microinyección estándar y de ultrasonido mediada para inyectar diversos agentes en regiones específicas del corazón en embriones de ratón en E9.5 y etapas posteriores del desarrollo. Explante embrionarias o embriones se cultivan o hacia la izquierda para seguir desarrollando en el útero. Estos agentes incluyen los tintes fluorescentes, virus, shRNAs, o las células madre derivadas de células progenitoras. Nuestros enfoques permiten la preservación de la funciones del órgano mientras se monitorea la migración y el destino de las células marcadas y / o inyectados. Estas tecnologías pueden extenderse a otros órganos y va a ser muy útil para hacer frente a cuestiones biológicas fundamentales en la biología del desarrollo.

El uso de los protocolos de inyección descritos anteriormente, las células pueden ser etiquetados y / o inyectados en el corazón embrionario de ratón. Como prueba de concepto, se muestran varios ejemplos en los que el protocolo de inyección y el vivo explante ex AVC, aislado del corazón, o el cultivo de embriones entera se combinaron (Figura 1). La Figura 1 muestra la preparación del embrión antes de la inyección de células. El em...

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Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Se describe una serie de métodos para inyectar colorantes, vectores de ADN, virus, y células con el fin de supervisar tanto el destino celular y el fenotipo de las células endógenas y injertados derivados de células embrionarias o pluripotentes dentro de embriones de ratón en el día embrionario (E) 9,5 y etapas posteriores de desarrollo.

Etiquetado de la célula y de inyección en Desarrollo de embriones de ratón Corazones

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.1K vistas.  Aix-Marseille University.  Se describe una serie de métodos para inyectar colorantes, vectores de ADN, virus, y células con el fin de supervisar tanto el destino celular y el fenotipo de las células endógenas y injertados derivados de células embrionarias o pluripotentes dentro de embriones de ratón en el día embrionario (E) 9,5 y etapas posteriores de desarrollo. 

Video: Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

La medición de la exocitosis en las neuronas de un etiquetado FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Investigación

Biología

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

La electroporación in vivo sola célula en el cerebro intacto desarrollo

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

En el etiquetado in vitro de células estaminales embrionarias humanas de Resonancia Magnética

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparación de embriones para Microscopía Electrónica de la Drosophila Tubo cardíaco embrionario

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

El aislamiento y la derivación de células embrionarias de ratón Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Retro-orbital de inyección en adultos de pez cebra

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Una sola célula grabaciones de succión de los conos del ratón

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Vídeo Bioinformática Análisis de Crecimiento Humano Colonia células madre embrionarias

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

En vivo de imágenes y tratamientos terapéuticos en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

La separación de Ratón Facial ectodermo embrionario y mesénquima

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...