Este es un método alternativo y fácil de usar para entregar genes de interés a los huevos de ratón fertilizados a través de la perforación láser de la zona pellucida y la entrega de genes lentivirales. La perforación asistida por láser del procedimiento de donante de ratón también puede aplicarse a los óvulos fertilizados de otras especies para facilitar la entrada de otros tipos de virus o reactivos de transfección. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere habilidades especializadas para la micromanipulación y microinyección de los huevos de ratón fertilizados.
Demostrar el procedimiento de aislamiento de óvulos de ratón fertilizado será Page Myers, un científico de investigación de la rama de Medicina Comparada en el NIEHS. 16 a 24 horas después del apareamiento, aislar los ovarios y ovucetos de ratones hembra con tapones vaginales, de acuerdo con los protocolos estándar. Cuando se hayan recogido todos los tejidos, desgarra la ampolla de cada ovario y libera los óvulos fertilizados, rodeados de células cumulous, y transfiere los huevos en células cumulous a un plato de 35 milímetros que contiene una x hialuronidasa en medio M2 fresco, para una incubación de tres a cinco minutos a temperatura ambiente.
Pipetear los huevos un par de veces para liberar las células cumulous, y transferir los huevos a un nuevo plato de 35 milímetros que contenga el medio M2, con pipeteo para lavar la enzima. A continuación, transfiera los huevos lavados a un plato de 35 milímetros que contenga un medio optimizado para potasio simplex, o KSOM, y la pipeta para lavar el medio M2 restante y la hialuronidasa. Luego, transfiera los huevos a placas tratadas de cultivo de tejido de 35 milímetros sembradas con 50 microlitros de KSOM y dos mililitros de dimetilpolisiloxano para un equilibrio de dos horas a 37 grados centígrados, 5% dióxido de carbono y oxígeno, y 90%nitrógeno.
Mientras los huevos están en la incubadora, configurar y calibrar el láser XYClone, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Cuando los huevos estén listos, coloque la primera placa de gota en la etapa del microscopio láser y enfoque manualmente la zona pellucida. Después de confirmar que la luz LED láser es visible a través del objetivo, mueva la etapa del microscopio para apuntar a la zona con el láser LED, y utilice el software de la computadora para establecer el láser XYClone en 250 microsegundos.
Ajuste el tamaño de la luz LED a las dimensiones adecuadas y perfore la zona pellucida de cada huevo tres veces con el láser para producir tres agujeros de 10 micrómetros. Es fundamental realizar la perforación rápidamente, pero con cuidado, ya que los óvulos fertilizados no pueden mantenerse fuera de la incubadora durante más de 15 minutos. Luego, devuelva los huevos perforados a la incubadora durante otras dos horas.
Al final de la segunda incubación, tratar la caída de 50 microlitros KSOM con dos microlitros de lentivirus concentrado sin mezclar. Y devolver los huevos a la incubadora durante cuatro días. Cuando los óvulos se hayan convertido en blastocistos, utilice un dispositivo de transferencia de embriones no quirúrgicos para depositar aproximadamente 10-15 embriones en unos dos microlitros de KSOM.
17 días después de la transferencia del embrión, permitir que el ratón embarazada dé a luz naturalmente o recoger los neonatos por cesárea según sea necesario. Luego, recoger el tejido de los cachorros para el genotipado, para determinar la tasa de transgénesis. El desarrollo de óvulos aislados y transducidos fertilizados con ratón se puede comprobar diariamente bajo el microscopio.
Entre el 60 y el 70% de los embriones sanos y no tratados se convierten en blastocistos en un plazo de tres a cuatro días. Mientras que alrededor del 47% de los embriones transducidos perforados con láser se convierten en blastocistos, de los cuales el 85% expresan el gen de interés tranducido. Apuntar al láser a adelgazar la zona, en lugar de crear un agujero, permite que los embriones en desarrollo se beneficien de una zona pellucida intacta, encapsulando sin dejar de ser permisiva a la transducción lentiviral.
La transducción con un lentivirus recombinante, expresando copepod GFP de un promotor de factor de alargamiento 1A induce múltiples integraciones lentivirales, y una alta expresión de GFP bajo una lámpara LED azul. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que, si bien la capacidad de los lentivirus para integrarse en el genoma del huésped los convierte en una poderosa herramienta para la entrega estable de genes, pero la integración aleatoria también puede introducir mutaciones de inserción. Esta técnica podría permitir a los investigadores en el campo de la genética desarrollar rápidamente modelos animales transgénicos para el estudio de la enfermedad para la producción de proteínas in vivo, o para estudios genéticos funcionales.
Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunohistoquímica en muestras de tejido aislado de cachorros transducidos para responder preguntas adicionales sobre la ubicación y el alcance de la expresión génica en diversos tejidos de interés. No olvide que trabajar con lentivirus puede ser extremadamente peligroso. Por lo tanto, siga sus pautas institucionales para trabajar con lentivirus.
Use ropa protectora personal y descontamine todos los residuos antes de su eliminación.
