Por lo tanto, es difícil separar el papel de las influencias hormonales uterinas y ováricas en el establecimiento del embarazo, ya que ambas están íntimamente vinculadas. Así que este protocolo nos permite examinar directamente las contribuciones uterinas. Si bien algunas de estas técnicas, como la ovariectomía, son bastante invasivas, son relativamente simples de realizar después de la práctica y el entrenamiento, lo que las hace adecuadas para los investigadores que son nuevos en modelos de ratón.
Por lo tanto, este método se puede utilizar para comprender la regulación más amplia del eje HPG, ya que tanto los ovarios como el útero desempeñan un papel importante en la regulación de este eje. Si nunca ha realizado estas técnicas antes, consulte con el equipo veterinario de su instituto para obtener capacitación y apoyo. Para comenzar, aplique lubricante para los ojos generosamente a un ratón anestesiado frotándolo suavemente en el ojo después de afeitarse un área pequeña en la abolladura debajo de la corazonada de la columna vertebral.
Inyecte 0.1 mililitros de carprofeno por vía subcutánea en el cuello. Pruebe si el animal está anestesiado pellizcando su dedo trasero y verificando si hay un reflejo. A continuación, aplique Betadine en el sitio quirúrgico.
Luego cúbralo con una cortina quirúrgica. Usando pinzas con dientes de rata, retire la piel en la corazonada hacia arriba y haga una incisión longitudinal de cinco milímetros. Luego, usando fórceps romos, diseccione la piel lejos de la capa muscular subyacente hacia un lado hacia el riñón.
Identifique el riñón, el ovario y la almohadilla de grasa ovárica a través de la pared muscular. Agarre y levante la capa muscular con los fórceps. Luego, usando tijeras, haga una incisión de 0.5 a un centímetro de largo y tire de la almohadilla ovárica a través de la incisión con un par de pinzas romas.
Luego, usando un soporte de aguja curvo, sujete debajo del ovario y el oviducto en el extremo distal del cuerno uterino y extirpe el ovario con tijeras. Después de 30 segundos, retire la abrazadera y aplique con una gasa estéril. Para cerrar la incisión de la pared muscular, levante la parte superior de la incisión con fórceps.
Luego ate la incisión con el nudo de un cirujano usando suturas de seda. Aplique tópicamente unas gotas de bupivacaína con una jeringa de un mililitro sin accesorio de aguja, y aplique el exceso con una gasa estéril. Después de realizar de manera similar la ovariectomía en el otro lado, cierre la incisión de la piel presionando los dos lados de la piel juntos y aplicando un par de clips quirúrgicos de siete milímetros, dejando espacio para la hinchazón de la herida.
Coloque todo el equipo requerido en una lámina dentro de una campana de bioseguridad de flujo laminar o Clase II y esterilice UV durante 20 minutos. Lave el tubo silástico en 100% desinol y deje que se seque al aire dentro de la campana. Una vez seco, corte el tubo en segmentos de un centímetro de largo con un bisturí.
A continuación, exprima aproximadamente 200 microlitros de sellador en una jeringa sin émbolo. Reemplace el émbolo y empuje una pequeña cantidad de sellador. Aplique el sellador a un extremo del tubo, alisándolo con un dedo enguantado.
Y deje que el sellador se seque durante la noche o bajo luz UV durante 30 minutos en la campana. A continuación, vierta el polvo de progesterona en una placa de Petri esterilizada. Coloque el polvo en gránulos con la ayuda de fórceps.
Golpee el extremo sellado del pellet por la superficie de la campana para condensar el polvo. Luego selle el extremo abierto con el sellador. Envuelva la placa de Petri que contiene los gránulos en papel de aluminio para protegerlos de la luz.
Aproximadamente 72 horas antes de la inserción subcutánea, active los gránulos incubándolos en FCS con tiras de carbón. Fiona Cousins, una científica investigadora de carrera temprana del Instituto Hudson de Investigación Médica. Después de preparar a los animales con inyecciones subcutáneas de estradiol, prepare a los animales con gránulos de progesterona subcutánea dos días antes de la decidualización artificial.
Antes de la cirugía, anestesia al ratón y pruebe la profundidad de la anestesia verificando el reflejo de pellizco del dedo del pie. Luego coloque el mouse en posición prona, levante la cola e inserte lentamente un espéculo de seis milímetros en su vagina. Coloque la parte inferior del cuerpo del ratón entre los dos primeros dedos de la mano no dominante.
Luego, usando el dedo índice, empuje suavemente la cola hacia arriba para permitir una mejor accesibilidad vaginal. Transfiera 20 microlitros de aceite de sésamo a una punta de transferencia de embriones no quirúrgica e inserte la punta a través de la vagina y el cuello uterino en el cuerno uterino. Expulsar lentamente el aceite.
Una vez hecho esto, retire el espéculo de la vagina. En este estudio, el 80% de los ratones se sometieron a una decidualización exitosa, mientras que el 20% no lo hizo. Por lo tanto, es importante mantener todo su equipo quirúrgico y áreas de trabajo estériles y tener pacientes al insertar el dispositivo AINE a través del cuello uterino en el cuerno uterino del ratón.
Después de inducir la decidualización artificial, el paladar de progesterona se puede eliminar para imitar la menstruación y estudiar la descomposición endometrial. Usando este método, podemos estudiar la biología uterina y la regulación independiente de la influencia de los ovarios. Esto es realmente emocionante en el área de la fertilidad y la salud de la mujer en general.
