El objetivo general de este procedimiento es demostrar parálisis inducida por la natación o SWIP, un ensayo conductual para evaluar la señalización de dopamina en C.elegans. SWIP permite la identificación rápida de genes dentro o relacionados con la sinapsis dopaminérgica. Este método permite la investigación de los efectos producidos por un exceso de dopamina extracelular que es causada por ejemplo por fármacos o por mutaciones en el transportador de dopamina.
Para garantizar que todos los gusanos analizados durante el ensayo naden durante la misma cantidad de tiempo, los animales deben ser transferidos rápidamente a la solución. Demostrando el procedimiento serán Sirisha Kudumala y Serene Sossi. Ambos trabajan en mi laboratorio.
Para configurar cultivos de arranque de gusanos, utilice una espátula estéril para cortar pequeños trozos de agar de un plato que contenga C.elegans bien alimentados y transfiera las piezas de agar a placas individuales de NA22 E.coli. Después de incubar las placas a 20 grados celsius durante tres a cuatro días, confirme visualmente la presencia de adultos gravid bajo un microscopio estéreo. Para obtener una población sincronizada de gusanos, chorro de agua sobre un plato lleno de adultos gravid.
Revuelva suavemente la placa para desalojar los gusanos y utilice una pipeta de eliminación para transferir los gusanos a un tubo cónico de poliestireno de 15 mililitros. Después de tirar de los gusanos de una segunda placa en el tubo, recoger los gusanos por centrifugación para tres lavados en 15 mililitros de agua autoclave por lavado. El agua debe aparecer clara después del último lavado.
Después de la última centrifugación, añadir cinco mililitros de una solución de hidróxido de sodio de hipocloruro de sodio recién preparada a los gusanos y mezclar rápidamente con un vórtice. Incubar el tubo en un balancín, colocar una gota de solución de gusano en un portaobjetos de microscopio de vidrio y comprobar si hay lysis de gusano debajo de un estereoscopio cada dos minutos durante cuatro a ocho minutos. Cuando alrededor del 70% de los gusanos han sido sometidos y los huevos habían sido liberados, detenga inmediatamente la lelisis con la adición de tampón de huevo.
A continuación, centrifugar los embriones y las canales de gusano cuatro veces resuspendiendo el pellet con tampón de huevo fresco entre los lavados para eliminar cualquier lejía restante. Después del último lavado, el pellet debe aparecer blanco. Resuspender el pellet en cinco mililitros de agua autoclavada y cinco mililitros de 60% sacarosa para separar los embriones de las canales por centrifugación.
Retire el tubo cuidadosamente de la centrífuga después de la separación del gradiente de densidad y utilice una pipeta Pasteur de vidrio para transferir de tres a cuatro mililitros de los embriones que flotan en el menisco superior a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Lavar los embriones tres veces con agua autoclaveda para eliminar la sacarosa seguida de tres lavados en tampón M9. Después del último lavado, incubar los embriones en una coctelera durante la noche en 10 mililitros de tampón M9 fresco para permitir que los huevos eclosionen y permanezcan en la etapa larval L1.
Después de no más de 14 horas en la coctelera, lave las larvas L1 tres veces con el agua autoclaveda para eliminar las feromonas liberadas por las larvas y resuspend el pellet larval en un mililitro de agua. Diluir una alícuota de gusanos a una proporción de uno a 10 y añadir 1:10 microlitro gota en un portaobjetos de vidrio y contar los gusanos bajo el microscopio estéreo. Repita para obtener un número medio de gusanos.
Utilice una pipeta para añadir suficientes gotas de la solución de gusano en una placa NA22 a temperatura ambiente para sembrar aproximadamente una vez 10 a los terceros gusanos para el cultivo y dejar la placa medio abierta hasta que las gotas se sequen. Luego incubar la placa cubierta y al revés a 20 grados Celsius durante aproximadamente 44 a 48 horas o hasta que los gusanos lleguen a la etapa L4 tardía como se confirma visualmente bajo un microscopio estéreo. Para la evaluación manual de SWIP, agregue 40 microlitros de solución de control con o sin 0,5 anfetaminas milimolares en una placa plana de vidrio.
Bajo un estereoscopio, elija de ocho a 10 gusanos de etapa L4 tardíos con una selección de pestañas y sumerja la selección en el pozo que contiene la solución hasta que los gusanos se muevan de la selección y nadan en la solución. Inicie el temporizador. Tenga en cuenta el número de gusanos liberados en el pozo y observe y registre el número de gusanos que exhiben SWIP en cada marca de minutos durante un total de 10 minutos.
Al final del procedimiento, copie los datos sin procesar en una hoja de cálculo y calcule el porcentaje de gusanos paralizado dividiendo el número de gusanos paralizado en cada minuto por el número total de gusanos probados a lo largo del ensayo y multiplicándose por 100. Copie los valores de porcentaje en cualquier software gráfico y estadístico y trace los datos con valores de porcentaje de SWIP en el eje Y y el tiempo en el eje X utilizando el formato de gráfico XY. Se puede realizar un análisis estadístico entre los grupos de control y tratamientos con anfetaminas y el tiempo del tratamiento, por ejemplo mediante el uso de ANOVA bidireccional y análisis post hoc.
Para el análisis automatizado de la parálisis inducida por la natación, configure la cámara, el software de seguimiento de gusanos y el script para ejecutar el análisis del software de seguimiento y utilice una selección de pestañas para colocar un solo gusano L4 de etapa tardía en una placa de punto de vidrio como se muestra anteriormente. A continuación, grabe vídeos de natación de un gusano a la vez y utilice el software de seguimiento de gusanos para calcular la frecuencia de las curvas corporales, siguiendo el script proporcionado con el software de seguimiento para obtener la frecuencia de golpeo del gusano, y para generar mapas de calor a partir de los datos de golpeo de gusano. La mayoría de los gusanos probados en la solución de control nadan continuamente durante al menos 10 minutos.
Los gusanos expuestos a control o anfetamina no muestran SWIP en el primer minuto de observación. Sin embargo, mientras que los gusanos tratados con la solución de control continúan nadando durante 10 minutos, los gusanos tratados con anfetamina comienzan a exhibir SWIP después de dos minutos de tratamiento. Y después de 10 minutos, el 66% de los animales muestran SWIP.
Aquí se muestran ejemplos de mapas de calor de animales expuestos al control o a la anfetamina con un aumento considerable esperado de la parálisis observado en los animales tratados con anfetaminas. Antes de intentar este ensayo, uno debe estar bien familiarizado con la selección y la puesta en escena del desarrollo de C.elegans. La participación del sistema dopaminérgico en el comportamiento SWIP debe confirmarse utilizando animales que carecen de la expresión de proteínas dopaminérgicas o por el agotamiento de las vesículas de dopamina con Reserpina.
SWIP puede ser fundamental en la identificación de nuevas proteínas implicadas en el mecanismo de acción de los fármacos que actúan en la sinapsis dopaminérgica.
