Damos las gracias a Tzlil Rozenblat, Bello Alexandra y Karl Spuhler de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por el Vassar College Pregrado Investigación Instituto de Verano (URSI), Lucy Maynard Fondo de Investigación del salmón y el premio de la NASA # NX09AU90A, National Science Foundation Center for Excelencia en Investigación en Ciencia y Tecnología (NSF-CREST) ​​# 0630388 concesión y la NSF premio # 1058385.

1. C. elegans Preparación de Análisis de Vídeo <ol><li> Mueva 10-20 nematodos adultos grávidas a nuevos NGM llenos de agar placas de Petri con un pico delgado, aplanado alambre de platino. Las placas Petri llenas con el agar NGM contener una pequeña mancha circular de E. coli (una cepa de crecimiento limitado, OP50, da los mejores resultados) para los nematodos para comer. Permita que los nematodos para poner sus huevos durante 3-5 horas y luego retire los adultos, estableciendo así una pequeña cultura, de desarrollo sincronizado de 50-150 nematodos. Permitir que los nematodos a crecer a la edad adulta temprana mediante la incubación de las placas Petri a 20 ° C durante 4-5 días. Estos métodos de cultivo se basan en procedimientos establecidos (Stiernagle 2006). 5 </li><li> En el día del análisis de vídeo, lavar una placa de nematodos adultos jóvenes con 1 ml de agua desionizada, destilada, por lo tanto recoger 50-150 gusanos del cultivo sincronizado. Una solución tampón de PBS como M9 o también se puede utilizar. Utilice una microcentrífuga para hacer girar la wORM a la parte inferior del tubo, o permitir que se asienten por gravedad durante aproximadamente 15 min. Eliminar la mayor parte del agua desde el tubo y reemplazarlo con 1 ml de agua desionizada, destilada con el fin de lavar las bacterias adheridas a partir de los nematodos. </li><li> Transferir los nematodos en agua o tampón a una cubeta de cuarzo con una micropipeta. Es importante trabajar con un pequeño número, sobre los nematodos 5-10 en total en una vez o incluso menos de modo que uno de nematodos a la vez es probable que sea iluminada por el láser. Si el número de los nematodos en las placas de cultivo es demasiado grande, diluir los gusanos en agua o tampón hasta una densidad deseada. También es posible recoger los nematodos individuales a una gota de agua o de tampón en una placa de agar fresco para lavar y transferir gusanos individuales a la cubeta. En nuestro estudio, hemos utilizado 1 mm, 2 mm y 5 mm tamaños de cubetas para examinar los efectos de las restricciones físicas en el comportamiento natatorio. </li></ol> 2. Configuración óptico para el vídeo Analysis <ol><li> Realice la configuración como se muestra en la Figura 1, utilizando un 543 nm (verde) El helio-neón (HeNe) láser, dos espejos de superficie frontal de aluminio, un soporte de la cubeta, una pantalla de proyección, y una cámara de alta velocidad (Casio Exilim High Speed) capaces de rodaje en ~ 240 fps. Los dos espejos se utilizan para dirigir el haz láser a través de la cubeta. Diferentes tamaños de cubetas se pueden utilizar dependiendo de la naturaleza del estudio. Como ejemplo, se utilizó cubetas que son 5 mm de espesor para mostrar los efectos de las restricciones espaciales en las frecuencias de natación. El rayo láser debe satisfacer los requisitos de sobremuestreo;. Es decir, el organismo debe obstruir no más de un tercio del haz de láser. Para C. elegans, el rayo láser debe ser de aproximadamente 2 mm de diámetro cuando interactúa con un nematodo. El rayo láser no debe ser mayor que 5 mm de diámetro ya que el patrón de difracción será difícil de localizar. La distancia desde el organismo de difracción de la pantalla debe ser mucho mayor queel propio organismo. </li><li> Place Parafilm sobre la parte superior de la cubeta y se invierte para mezclar los nematodos en la columna de agua. Colocar la cubeta en un soporte de cubeta de modo que los gusanos son inicialmente cerca de la parte superior de la cubeta. Uso de los espejos, dirigir el haz láser a través del centro de la cubeta. Debido a que los nematodos son más densos que el agua, lentamente se caen al fondo de la cubeta, mientras que al mismo tiempo nadando dentro de la columna de agua. </li><li> En la pantalla de proyección, el color de la mancha correspondiente al haz de láser transmitido negro para reducir la dispersión como el haz transmitido cumple la pantalla de proyección (Figura 2). Alternativamente poner una abertura en la pantalla de proyección para permitir que el haz transmitido a pasar a través de la pantalla. La eliminación o reducción de la dispersión de haz transmitido mantendrá la matriz CCD de la cámara de saturación debido al haz transmitido. </li><li> Para capturar una medida del tamaño del patrón de difracción, dibujar una línea deaproximadamente 5 cm sobre la pantalla de proyección junto al punto del láser de haz transmitido sin interferir con la imagen de luz difractada. </li><li> Inicio de la grabación con la cámara mientras la luz de la habitación se encuentra en modo que la línea de 5 cm se encuentra en el mismo metraje que las imágenes de difracción. Apague la luz de la habitación. Grabar imágenes de difracción en la pantalla con la cámara como gusanos pasan a través del haz de láser. </li></ol> 3. Datos de Vídeo Preparación <ol><li> Instalar el programa de análisis de vídeo (Logger Pro: <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> ) en el equipo. Importe el vídeo en el programa de análisis de vídeo </li><li> Establecer el origen para coincidir con el punto de láser transmitida. Ajuste la escala utilizando la línea de 5 cm en la pantalla de proyección. </li><li> Seguir el desplazamiento angular de la imagen de difracción formada por cada nematodo utilizando el software de análisis de vídeo (Figura 3) </li><li> Para encontrar la angulaciónr desplazamiento tomando el arctan (y / x), copiar y pegar datos en una hoja de cálculo (Excel) y añadir 180 º o π para todos los ángulos negativos para producir un gráfico continuo (Figura. 4). </li></ol> 4. Adquisición de datos en tiempo real para la observación inmediata de las frecuencias de Natación <ol><li> Usando la misma configuración que para el análisis de vídeo, coloca un fotodiodo (DET10A de Thorlabs) con un área pequeña (~ 1 mm 2) fuera del centro en el patrón de difracción justo en frente de la pantalla de proyección. </li><li> Conecte el fotodiodo al osciloscopio digital (PicoScope realizada por Pico Technology) que se conecta al ordenador a través del puerto USB. Observar los patrones paliza en la pantalla del ordenador. </li><li> Guardar adquiridos conjuntos de datos en formato ASCII o de texto. </li></ol> 5. Análisis de Datos <ol><li> Importe los datos obtenidos utilizando el vídeo o el fotodiodo en un programa de análisis de datos capaz de formas de onda de ajuste mediante chi-cuadrado minimización. El programa utilizado es de origen ( <a href="http://www.originlab.com/" target="_blank">http://www.originlab.com/</a> ). Ajustar una curva sinusoidal para determinar la frecuencia paliza (Figuras 4 y 5). </li><li> Frecuencias promedio de natación de diversas muestras y determinar la varianza. Para este estudio, los datos se analizaron estadísticamente usando un ANOVA de un solo factor seguido por el test de Bonferroni comparaciones múltiples. Un valor de p de &lt;0,05 se consideró estadísticamente significativo. </li></ol> 6. Patrones Modelo de difracción utilizando Mathematica como ejemplo Nota: Los patrones de difracción se puede modelar usando muchas herramientas computacionales diferentes. Este procedimiento será diferente para diferentes herramientas computacionales como Matlab, Excel, origen, etc <ol><li> Crear imagen: Tomar imágenes de nematodos en un portaobjetos de microscopio utilizando un microscopio tradicional. </li><li> Binarización imagen: Importar &#39;gusano&#39; la imagen gusano into Mathematica arrastrando la imagen en Mathematica. Convertir la imagen en una imagen en blanco y negro (binarización). Esto se puede lograr con la &#39;binarización&#39; comando en Mathematica: BlackandWhiteImage = binarización [Gusano]. La imagen puede ser vista como una imagen en blanco y negro. También puede utilizar el comando &#39;EdgeDetect&#39; para crear un BlackandWhiteImage: EdgeDetect [Worm, 6.0,0.035], donde los dos números finales controlar el grosor de los bordes resultantes. </li><li> Convertir la imagen en una matriz de ceros y unos: Esto se puede lograr con el &#39;ImageData&#39; comando en Mathematica: Matrix = ImageData [BlackandWhiteImage]. </li><li> Transformada de Fourier matriz: Usa el enlace &#39;Fourier&#39; comando en Mathematica para transformar la matriz de Fourier utilizando los FourierParameters indicados: FTransform = Fourier [Matrix, FourierParameters -&gt; {0, -2}]. </li><li> Square módulo de matriz para obtener la matriz de difracción y mejorar el contraste de la imagen: Cuadrado del absolutovalor de la matriz y visualizar la imagen resultante, que es el patrón de difracción correspondiente a la imagen original. Además, utilice la opción &#39;Conectar&#39; función escalar el contraste de la imagen: ImageContrast = Imagen [Log [1 + (Abs [FTransform]) ^ 2] / 0,5]. </li><li> Cambiar el tamaño de la imagen para facilitar su visualización: Recortar el patrón de difracción central y cambiar el tamaño como desee: ImageResize [ImageContrast [y, 100], 500]. </li><li> Comparar los patrones de difracción modelados con patrones de difracción obtenidos a partir de los gusanos libre de natación. (Figura 6) </li></ol>

<ol>
	<li>Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+mechanical+load+modulate+the+locomotory+gait+of+swimming+C.+elegans.">Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans.</a> J. Exp. Biol. 210, (2007).</li><li>James, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A student's guide to Fourier transforms with applications in physics and engineering. , (1995).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans.">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 20982-20987 (2008).</li><li>Li, W., Feng, Z., Sternbert, P. W., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+stretch+receptor+neuron+revealed+by+a+mechanosensitive+TRP+channel+homologue.">A C. elegans stretch receptor neuron revealed by a mechanosensitive TRP channel homologue.</a> Nature. 440, 684-687 (2006).</li><li>Stiernagle, T., ed, W. o. r. m. B. o. o. k. ,. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Eells, R., Lueckheide, M., Magnes, J., Susman, K., Rozenblat, T., Kakhurel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Diffraction+Analysis+and+the+Transformation+of+C.+elegans.">Dynamic Diffraction Analysis and the Transformation of C. elegans.</a> , (2011).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+using+Laser+Diffraction.">Analysis of Freely Swimming C. elegans using Laser Diffraction.</a> O. J. Biphys. , (2012).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Sampson, A., Eells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotive+Analysis+of+C.+Elegans+through+Diffraction,+Control+number:+348+Session:+JTuA+-+Joint+FiO/LS+Poster+Session+I+Pres.+number:+JTuA39.">Locomotive Analysis of C. Elegans through Diffraction, Control number: 348 Session: JTuA - Joint FiO/LS Poster Session I Pres. number: JTuA39.</a> , (2010).</li><li>Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. J., Zoval, J., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity+fource+transduced+by+the+MEC-4/MEC-10+DEG/EnaC+channel+modulates+DAF-16/FoxO+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Gravity fource transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/EnaC channel modulates DAF-16/FoxO activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 177, 835-845 (2007).</li><li>Park, S., Hwang, H., Nam, S. -. W., Martinez, F., Austin, R. H., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+a+structured+microfluidic+environment.">Enhanced Caenorhabditis elegans locomotion in a structured microfluidic environment.</a> PLOS One. 3, e2550 (2008).</li><li>Keller, H. E., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+Lenses+for+Confocal+Microscopy.">Objective Lenses for Confocal Microscopy.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).</li><li>Martin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TECHNICAL OPTICS. II, (1950).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Hemos desarrollado un nuevo enfoque para la medición en tiempo real de movimiento y comportamientos locomotores simples en organismos microscópicos como los nematodos que no requiere el uso de microscopios. 8 Este enfoque metodológico se podrían utilizar también para el estudio de numerosos organismos microscópicos como protistas. Este método sólo está limitado por la longitud de onda de la luz utilizada. El organismo no debe ser menor que la longitud de onda de la luz. Además del ahorro de costes y la portabilidad del equipo necesario, una ventaja clave de este método es la capacidad para medir el comportamiento en tiempo real y en tres dimensiones, sin las limitaciones estrechas de planos de imagen bajo un microscopio. También es posible con esta técnica para examinar las influencias de las fuerzas gravitacionales u otras numerosas condiciones en el comportamiento que no pueden ser estudiados utilizando microscopio basados ​​en enfoques. 9 Por lo tanto, se puede lograr una mejor comprensión de microorganismo natural locomotriz BEHAviors liberados de los confines de las gotas de portaobjetos de microscopio o cámaras especializadas de microfluidos (Park et al, 2008). 10 La falta de información de fase en un patrón de difracción no permite la recuperación directa de la imagen correspondiente al objeto de difracción desde el patrón de difracción de campo lejano es proporcional al cuadrado del valor absoluto de la transformada de Fourier. Estamos por lo tanto, el cálculo de los patrones de difracción de imágenes gusano de modo que se pueden combinar con los patrones de difracción de nematodos libremente natación (Figura 6). Este método ha dado resultados verdaderamente libre para nadar C. elegans y se puede aplicar a cualquier especie microscópicas que las maniobras en un entorno ópticamente transparente como el agua o muchas soluciones iónicas diferentes. Microscopios convencionales sólo permiten estudios con una profundidad focal en el orden de los micrómetros. 11 Esto es debido a la limitadaprofundidad de campo cuando se enfoca la luz: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412eq1.jpg" /> donde el número-f N tiene una relación recíproca con el círculo de confusión (c) de modo que una longitud focal corta se asocia con un gran c. 12,13 Aunque este método de difracción ciertamente no es un sustituto para la microscopía convencional, es capaz para obtener resultados cuantitativos rápidamente de modo que incluso las especies se pueden manipular en tiempo real a bajo coste. Los patrones de difracción se puede obtener con cualquier puntero láser. Los patrones de difracción se puede filmar con una resolución reducida temporal con una cámara digital normal. Mientras que el usuario puede no tener un microscopio o un fotodiodo fácilmente disponibles, las partes fundamentales de este experimento como la medición de frecuencias de volteo y evaluar los patrones de difracción se puede realizar a un costo extremadamente bajo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> 543 nm láser HeNe </td><td> Melles Griot </td><td> LGX1 </td><td> Cualquier láser en el rango visible con menos de 5 mW se puede utilizar. </td></tr><tr><td> 2 delanteros Espejos superficie de aluminio </td><td> Thorlabs </td><td> PF10-03-F01 </td><td></td></tr><tr><td> High Speed ​​Exilim cámara </td><td> Casio </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cubeta de cuarzo </td><td> Las células Starna </td><td> 21/G/5 </td><td></td></tr><tr><td> LoggerPro (Software) </td><td> Vernier </td><td></td><td> <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> </td></tr><tr><td> Mathematica 8 </td><td> Wolfram </td><td></td><td&gt; <a href="http://www.wolfram.com/" target="_blank">http://www.wolfram.com/</a> </td></tr></tbody></table>

quantitative locomotion study of freely swimming micro-organisms using laser diffraction

Suelos y organismos acuáticos microscópicos viven y se comportan en un complejo entorno tridimensional. La mayoría de los estudios de comportamiento organismo microscópico, en contraste, se han realizado utilizando enfoques basados ​​en microscopio, que limitan el movimiento y comportamiento a un estrecho campo, casi bidimensional focal. 1 Se presenta un enfoque novedoso analítico que proporciona análisis en tiempo real de nadar libremente C. elegans en una cubeta sin dependencia de microscopio basado en equipo. Este enfoque consiste en el seguimiento de la periodicidad temporal de los patrones de difracción generados por dirigir la luz láser a través de la cubeta. Medimos frecuencias de oscilación para los nematodos libre de natación. Análisis de los patrones de difracción de campo lejano se revela pistas sobre las formas de onda de los nematodos. La difracción es el proceso de doblado luz alrededor de un objeto. En este caso, la luz es difractada por los organismos. Las ondas de luz interfieren y pueden formar anuncioiffraction patrón. Un campo lejano, o Fraunhofer, patrón de difracción se forma si la distancia de la pantalla a objeto es mucho más grande que el objeto de difracción. En este caso, el patrón de difracción se puede calcular (modelado), usando una transformada de Fourier. 2 C. elegans son de vida libre de nematodos viven en el suelo que navegan en tres dimensiones. Se mueven tanto en una matriz sólida como la tierra o el agar en un patrón sinusoidal locomotor llamado gatear y en líquido en un patrón diferente llamado natación. 3 Las funciones que desempeña la información sensorial proporcionada por mechanosensory, quimiosensorial, y las células thermosensory que rigen los cambios plásticos en la locomoción los patrones y los interruptores en los patrones están empezando a dilucidar. 4 Se describe un método óptico para medir la locomoción de nematodos en tres dimensiones que no requiere de un microscopio y nos permitirá comenzar a explorar las complejidades de la locomoción nematodo bajo co diferentenditions.

<html> Como ejemplo, se estudió C. elegans en una cubeta de cuarzo de 1 cm de ancho, 5 mm de espesor y 4 cubetas cm de altura. El muestreo de un solo gusano utilizando el análisis de vídeo, la frecuencia de natación media obtenida a partir de análisis de vídeo en una cubeta de 5 mm de espesor es de aproximadamente 2,5 Hz (Figura 4). Del mismo modo, el muestreo de un solo gusano utilizando el método de tiempo real de adquisición de datos, se obtiene una frecuencia de natación de aproximadamente 2,7 Hz (Figura 5), usando el osciloscopio digital (PicoScope). Este procedimiento se puede repetir para muchos gusanos. Un estudio detallado de los gusanos libremente natación reveló una frecuencia de natación media de 2,37 Hz en una cubeta de 5 mm. 6 Como era de esperar, la frecuencia de la piscina es más alta que para un gusano que se arrastra (~ 0,8 Hz). 3 El uso de este método de difracción, la frecuencias medias Natación de una C. elegans, que se limita a un portaobjetos de microscopio, se ha encontrado que coincide con el valor previamente publicado de 2 Hz. 1,7 ve_content &quot;&gt; Siguiendo los procedimientos 3.) y luego 6.) permite el modelado de natación patrones de difracción con la ayuda de imágenes de gusano obtenidos con un microscopio convencional. Los patrones de difracción de modelado se utilizan para simular un ciclo de natación de la C. elegans ( Figura 6). Un modelo de éxito consiste en patrones de natación físicamente factibles sucesivas emparejan las frecuencias de natación. El gusano debe estar en la misma forma al final de un ciclo de baño como lo fue en el comienzo de un ciclo de natación. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig1.jpg" /> Figura 1. Un verde láser HeNe se utilizó para crear un patrón de difracción dinámica utilizando vivo C. elegans. Este patrón de difracción fue filmado a 240 fps. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig2.jpg" /> Figura 2. Dra<html> ala un punto negro aumenta la absorción del haz transmitido. La saturación de la cámara debido a la dispersión de la luz se reduce y el patrón de difracción se hace visible. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig3.jpg" /> Figura 3. Captura de pantalla del software de análisis de vídeo (Logger Pro) con un patrón de difracción de gusano que se está siguiendo. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4412/4412fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig4.jpg" /> Figura 4. Los datos de vídeo correspondientes al ciclo de natación de un nemátodo en una cubeta de 5 mm. El ajuste de la curva muestra una frecuencia de natación de ~ 2,5 Hz. &quot;/&gt; Figura 5. Datos en tiempo real correspondientes al ciclo de natación de un nemátodo en una cubeta de 5 mm. El ajuste de la curva muestra una frecuencia de natación de ~ 2,7 Hz. <img alt="La figura 6" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig6.jpg" /> Figura 6. La fila superior representa los patrones de difracción reales y se adapta a los patrones de difracción de modelado en la fila inferior. Los patrones de difracción de modelos fueron producidos usando gusanos en un portaobjetos de microscopio (fila del medio).

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Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Los organismos microscópicos como el nematodo de nado libre<em&gt; C. elegans</em&gt;, Viven y se comportan en un complejo entorno tridimensional. Se presenta un enfoque novedoso que proporciona un análisis de<em&gt; C. elegans</em&gt; El uso de patrones de difracción. Este enfoque consiste en el seguimiento de la periodicidad temporal de los patrones de difracción generados por dirigir la luz láser a través de una cubeta.

Estudio cuantitativo de Locomotion libremente Piscina microorganismos utilizando la difracción láser

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

quantitative-locomotion-study-freely-swimming-micro-organisms-using

Research

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Bioengineering

11.4K vistas.  Vassar College. Los organismos microscópicos como el nematodo de nado libre C. elegans, Viven y se comportan en un complejo entorno tridimensional. Se presenta un enfoque novedoso que proporciona un análisis de C. elegans El uso de patrones de difracción. Este enfoque consiste en el seguimiento de la periodicidad temporal de los patrones de difracción generados por dirigir la luz láser a través de una cubeta.

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Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated micro-plates. Under these conditions, cells spread and divide in all directions resulting in an inherent variability in cell shape, morphology and behavior. The high cell-to-cell variance of the overall population impedes the success of HCA, especially for drug development. The ability of micropatterns to normalize the shape and internal polarity of every individual cell provides a tremendous opportunity for solving this critical bottleneck 1-2.
To facilitate access and use of the micropatterning technology, CYTOO has developed a range of ready to use micropatterns, available in coverslip and microwell formats. In this video article, we provide detailed protocols of all the procedures from cell seeding on CYTOOchip micropatterns, drug treatment, fixation and staining to automated acquisition, automated image processing and final data analysis. With this example, we illustrate how micropatterns can facilitate cell-based assays. Alterations of the cell cytoskeleton are difficult to quantify in cells cultured on homogenous substrates, but culturing cells on micropatterns results in a reproducible organization of the actin meshwork due to systematic positioning of the cell adhesion contacts in every cell. Such normalization of the intracellular architecture allows quantification of even small effects on the actin cytoskeleton as demonstrated in these set of protocols using blebbistatin, an inhibitor of the actin-myosin interaction.

Adhesive micropatterns that normalize cellular architecture can be used to increase sensitivity in the detection of drug effects, improve reproducibility and simplify automated image acquisition and analysis. Such technology will benefit drug/siRNA screening assays, performed on conventional cell culture supports and consequently suffering from excessive cell-to-cell variability.

Una mejor visualización y análisis cuantitativo de los efectos de drogas Uso de células micropatterned

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Investigación

Bioingeniería

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1. The main difficulty of this assay is the perceived cost ($25-100K) and technical expertise required for implementing a laser ablation system2,3. However, solid-state pulse lasers of modest costs (&lt;$10K) can provide robust performance for laser ablation in transparent preparations where target axons are "close" to the tissue surface. Construction and alignment of a system can be accomplished in a day. The optical path provided by light from the focused condenser to the ablation laser provides a convenient alignment guide. An intermediate module with all optics removed can be dedicated to the ablation laser and assures that no optical elements need be moved during a laser ablation session. A dichroic in the intermediate module allows simultaneous imaging and laser ablation. Centering the laser beam to the outgoing beam from the focused microscope condenser lens guides the initial alignment of the system. A variety of lenses are used to condition and expand the laser beam to fill the back aperture of the chosen objective lens. Final alignment and testing is performed with a front surface mirrored glass slide target. Laser power is adjusted to give a minimum size ablation spot (&lt;1um). The ablation spot is centered with fine adjustments of the last kinematically mounted mirror to cross hairs fixed in the imaging window. Laser power for axotomy will be approximately 10X higher than needed for the minimum ablation spot on the target slide (this may vary with the target you use). Worms can be immobilized for laser axotomy and time-lapse imaging by mounting on agarose pads (or in microfluidic chambers4). Agarose pads are easily made with 10% agarose in balanced saline melted in a microwave. A drop of molten agarose is placed on a glass slide and flattened with another glass slide into a pad approximately 200 um thick (a single layer of time tape on adjacent slides is used as a spacer). A "Sharpie" cap is used to cut out a uniformed diameter circular pad of 13mm. Anesthetic (1ul Muscimol 20mM) and Microspheres (Chris Fang-Yen personal communication) (1ul 2.65% Polystyrene 0.1 um in water) are added to the center of the pad followed by 3-5 worms oriented so they are lying on their left sides. A glass coverslip is applied and then Vaseline is used to seal the coverslip and prevent evaporation of the sample.

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse imaging is a sensitive way to assay the effects of mutations in C. elegans on axon regeneration. A high quality, but inexpensive, laser ablation system can be easily added to most microscopes. Time lapse imaging over 15 hours requires careful immobilization of the worm.

La construcción de un láser de bajo presupuesto axotomía Sistema para el Estudio de la regeneración de axones en C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans&#039; Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Electrotaxis microfluidos basados ​​en On-Demand Análisis cuantitativo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

Inducido por fármacos Sensibilización de adenilciclasa: Racionalización Ensayo y miniaturización de moléculas pequeñas y siRNA aplicaciones de cribado

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

El cartílago humano Tissue Fabrication Usando tridimensional Tecnología de impresión inyección de tinta

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper presents a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device capable of generating water/oil/water double emulsions using a coaxial flow focusing geometry that can be fabricated entirely using soft lithography. Similar to emulsion devices using glass capillaries, double emulsions can be formed in channels with uniform wettability and with dimensions much smaller than the channel sizes. Three dimensional flow focusing geometry is achieved by casting a pair of PDMS slabs using two layer soft lithography, then mating the slabs together in a clamshell configuration. Complementary locking features molded into the PDMS slabs enable the accurate registration of features on each of the slab surfaces. Device testing demonstrates formation of double emulsions from 14 &#181;m to 50 &#181;m in diameter while using large channels that are robust against fouling and clogging.

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Microfluidic double emulsions generation typically involves devices with patterned wettability or custom-fabricated glass components. Here we describe the fabrication and testing of an all polydimethylsiloxane (PDMS) double emulsion generator that does not require surface treatment or complicated fabrication processes, and is capable of producing double emulsions down to 14 &#181;m.

Generación de doble emulsión utilizando un flujo Focus Dispositivo de polidimetilsiloxano (PDMS) Co-axial

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

En Vivo evaluación cuantitativa de la estructura miocárdica, la función, perfusión y viabilidad Usando computarizada micro-tomografía cardiaca

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Multicolor detección por fluorescencia de la gotita de microfluídica el uso de fibras ópticas

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

An Efficient and Reproducible Protocol for Distraction Osteogenesis in a Rat Model Leading to a Functional Regenerated Femur

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) is a surgical technique leading to bone regeneration after an osteotomy. The osteotomized extremities are moved away from each other by gradual distraction to reach the desired elongation. This procedure is widely used in humans for lower and upper limb lengthening, treatment after a bone nonunion, or the regeneration of a bone defect following surgery for bone tumor excision, as well as in maxillofacial reconstruction. Only a few studies clearly demonstrate the efficiency of their protocol in obtaining a functional regenerated bone, i.e., bone that will support physiological weight-bearing without fracture after removal of the external fixator. Moreover, protocols for DO vary and reproducibility is limited by lack of information, making comparison between studies difficult. The aim of this study was to develop a reproducible protocol comprising an appropriate external fixator design for rat limb lengthening, with a detailed surgical technique that permits physiological weight-bearing by the animal after removal of the external fixator.

This study describes a reproducible and detailed protocol using a newly developed external fixator for distraction osteogenesis (DO) in a femoral rat model which permits physiological weight-bearing by the animal after removal of the external fixator.

Un protocolo eficiente y Reproducible para la osteogénesis de la distracción en un modelo de rata a un fémur regenerado funcional

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) ...

Dual Raster-Scanning Photoacoustic Small-Animal Imager for Vascular Visualization

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great potential for application in the imageology of small animals. The wide-field photoacoustic imaging of small animals can provide images with high spatiotemporal resolution, deep penetration, and multiple contrasts. Also, the real-time photoacoustic imaging system is desirable to observe the hemodynamic activities of small-animal vasculature, which can be used to research the dynamic monitoring of small-animal physiological features. Here, a dual-raster-scanning photoacoustic imager is presented, featuring a switchable double-mode imaging function. The wide-field imaging is driven by a two-dimensional motorized translation stage, while the real-time imaging is realized with galvanometers. By setting different parameters and imaging modes, in vivo visualization of small-animal vascular network can be performed. The real-time imaging can be used to observe pulse change and blood flow change of drug-induced, etc. The wide-field imaging can be used to track the growth change of tumor vasculature. These are easy to be adopted in various areas of basic biomedicine research.

A dual raster-scanning photoacoustic imager was designed, which integrated wide-field imaging and real-time imaging.

Imagen fotoacústica fotoacústica dual para visualización vascular

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great ...