Los autores reconocen el proyecto de desarrollo lechero Este de África (EADD) por su apoyo práctico sobre el terreno en formación cooperativas lecheras en zonas rurales de Uganda en la producción de leche fermentada. CSK Food Enrichment es reconocido por la producción, control de calidad y evaluación de la capacidad fermentativa del cultivo iniciador. Lactosan GmbH &amp; Co, Austria, es reconocido por la asistencia de producción. Los autores agradecen a Karin Overkamp (TNO Microbiología y Biología de Sistemas, Zeist, Países Bajos) para el análisis por HPLC, y Derrick Assimwe (UIRI) para el registro de las declaraciones de autor en Uganda. Estas grabaciones se llevaron a cabo durante la reunión inicial apoyado por el IDRC de la comida fermentada para proyecto de vida (CIFSRF Fase 2) en Entebbe, Uganda, mayo de 2016. La Universidad VU de Amsterdam y el museo Micropia son reconocidos por sus contribuciones financieras y la prestación de servicios de laboratorio para la producción del vídeo descrito en este artículo. Los autores agradecen a Wim van Egmondpara microscopía de fermentos lácticos.

1. Preparación de la dulce arranque Para preparar el primer plato fresco, tomar 1 L de cualquiera de ultra alta temperatura (UHT) procesado o leche de vaca fresca. Si se trata de leche UHT, continúe en el paso 1.3. Si se trata de la leche de vaca fresca, continúe con el paso 1.1. <ol><li> Evaluación de la leche para la leche de vaca fresca <ol><li> Para la prueba organoléptica para detectar anormalidades o el deterioro de la leche, comprobar el aspecto visual de la leche y comprobar su olor. </li><li> Para la prueba de paño-a-punto de ebullición, la transferencia de una pequeña muestra de la leche a una cucharada. Mantenga la cuchara por encima de una fuente de calor hasta que la leche empieza a hervir. Retire la cuchara de la fuente de calor y la mirada a la leche para detectar signos de coagulación de la leche que indican mala calidad. </li><li> Para la prueba de lactómetro, llenar un cilindro, vidrio vaso de precipitados o cualquier otro objeto hueco al menos 15 cm de alto con leche. Coloque el lactómetro en la leche. lactómetro lecturas de 28 o más para la leche a 30 ° C indiccomió la leche de la densidad suficiente sin agua añadida. </li><li> Para la prueba de etanol, hacer una solución de etanol al 80% en agua destilada. Mezclar una cantidad igual de leche con una cantidad igual de 80% de etanol, por ejemplo, mezclando una cucharadita de leche con una cucharadita de 80% de etanol en una taza. Mira la mezcla de detectar signos de coagulación de la leche que indican mala calidad. </li></ol></li><li> Cuando se utiliza la leche fresca, filtrar la leche con un tamiz o tela de filtro (tamaño de poro 0,1 a 0,5 mm), previamente pasteurizada en agua hirviendo durante 15 min. </li><li> Pasteurización <ol><li> La transferencia de la leche en una cacerola pequeña y cerrar la cacerola con una tapa. Coloque la bandeja en una sartén un poco más grande. Llene la olla grande con agua, hasta 2 cm por debajo del borde de la olla más pequeña. </li><li> Calentar esta configuración usando una fuente apropiada de calor (por ejemplo, calefacción eléctrica, quemador de gas, estufa de carbón, leña) hasta que la leche llega a 85 ° C, tal como se mide con un termómetro de laboratorio. </li><li> Gire el vitame de fuego al mínimo y mantener la temperatura de 85 ° C durante 30 min. </li></ol></li><li> Retire la cacerola con la leche de la olla con el agua y dejar enfriar. Opcionalmente transferir el pan a una sartén con agua fría para acelerar el proceso de enfriamiento. No retire la tapa de la sartén, a excepción de tomar mediciones de temperatura. </li><li> Deje que la leche se enfríe a 45 ° C, tal como se mide con un termómetro de laboratorio o en la cocina. En este punto, la transferencia de la leche a un matraz de vacío, e inocular la leche mediante la adición de todo el contenido de un paquete del cultivo de siembra (1 g). </li><li> Deje la leche inoculada durante 16 horas en el matraz de vacío para permitir que la fermentación se lleve a cabo. Comprobar el pH final de la leche fermentada, que debería ser 4,4 o menos, medida con un medidor de pH o papel pH. </li><li> Después de la fermentación, agitar o mezclar el producto durante aproximadamente 5 - 10 minutos para obtener una textura suave. </li><li> Almacenar hasta que los próximos pasos. <ol><li> Para la producción del hogar, vierta el primer plato fresco enuna bandeja de cubitos de hielo para hacer cubitos de hielo de 10 ml. Coloque los cubitos de hielo en el congelador (-18 ° C) y continúe con la sección 2 a 3 meses. </li><li> Para la producción de hasta 100 L escala en lugares de bajos recursos, siga los pasos de la sección 3, asegurando de esta manera que el paso 3.5 se inicia 16 horas después de la finalización de la etapa 1.5. Como alternativa, coloque el motor de arranque fresca en la nevera (7 ° C) después del paso 1.6 y continúe con la sección 3 a 5 días. </li><li> Para la producción de una amplia gama de tipo no láctea de alimentos fermentados, continúe con la sección 4. </li></ol></li></ol> 2. La producción de pequeños lotes a nivel de hogar <ol><li> Utilizar cualquier cantidad conveniente de leche (sugerida 1 - 10 L). </li><li> Realice el paso 1.1. </li><li> Realice el paso 1.2. </li><li> Pasteurización <ol><li> La transferencia de la leche en una cacerola pequeña y cerrar la cacerola con una tapa. Coloque la bandeja en una sartén un poco más grande. Llene la olla grande con agua, hasta 2 cm por debajo del borde de la olla más pequeña. </li><li>Calentar esta configuración usando una fuente apropiada de calor (por ejemplo, calefacción eléctrica, quemador de gas, estufa de carbón, leña) hasta que la leche llega a 60 ° C, tal como se mide con un termómetro de laboratorio o en la cocina. </li><li> Opcional: En este punto, añadir azúcar a una concentración sugerida de 5% (w / v), tal como se mide con una balanza. Revuelva bien con una cuchara de mezcla previamente pasteurizada por inmersión en agua hirviendo durante 15 minutos. Continuar calentando hasta que la leche alcanza 85 ° C, medida con un termómetro de laboratorio o la cocina. </li><li> Encienda la fuente de calor a bajo y mantener la temperatura de 85 ° C durante 30 min. </li></ol></li><li> Realice el paso 1.4. </li><li> Deje que la leche se enfríe a 45 ° C, tal como se mide con un termómetro de laboratorio o en la cocina. En este punto, inocular la leche mediante la adición de un cubo de hielo (como se prepara en la sección 1) por cada litro de leche y transferir la leche a (a) frasco (s) de vacío. </li><li> Deje la leche inoculada en el frasco de vacío para permitirla fermentación se lleve a cabo hasta que se alcanza un pH de 4,4, medido con un medidor de pH o papel pH. Se estima que esto llevará 12 horas. </li><li> Realice el paso 1.7. </li><li> La transferencia de la leche fermentada con una nevera (7 ° C) y dejar que se enfríe durante al menos 3 horas antes de su consumo. Cuando se almacena en condiciones de refrigeración adecuado, el producto se consume mejor dentro de un mes. </li></ol> 3. Producción en el entorno rural en los países de escasos recursos Nota: Utilice un máximo de 100 litros de leche por 1 L de arranque fresco. <ol><li> Realice el paso 1.1. </li><li> Realice el paso 1.2. </li><li> Pasteurización: <ol><li> La transferencia de la leche en una lata de leche de tamaño adecuado y cerrar la lata con una tapa. Coloque la lata en una olla grande. Llene el recipiente con agua, hasta el nivel más alto posible. </li><li> Calentar esta puesta en marcha usando una fuente apropiada de calor (fuego de leña es el más rápido y con frecuencia el más rentable) hasta que la leche llega a 60 ° C, medida con un laboratorio otermómetro de cocina. </li><li> Opcional: Dependiendo de preferencia de sabor, añadir el azúcar en una proporción de 50 g por litro. Revuelva bien con una cuchara de mezcla que fue previamente pasteurizada por inmersión en agua hirviendo durante 15 minutos. Continuar calentando hasta que la leche alcanza 85 ° C, medida con un termómetro de laboratorio o la cocina. </li><li> Reducir el calor y mantener la temperatura de 85 ° C durante 30 min. </li></ol></li><li> Retire la lata con la leche de la olla con el agua y dejar enfriar. Para acelerar el proceso de enfriamiento, transferir la lata a una cacerola con agua fría. No retire la tapa de la lata, a excepción de la medición de la temperatura. </li><li> Deje que la leche se enfríe a 45 ° C, tal como se mide con un termómetro de laboratorio o en la cocina. Retire la lata de la cacerola de agua fría. En este punto, inocular el de la leche mediante la adición del arrancador fresca completa (esto nunca puede ser una sobredosis). </li><li> Envolver una manta alrededor de la lata de leche con el propósito de aislamiento y la prevención de un rapdisminución de id de temperatura (idealmente, la temperatura se mantendrá entre 45 y 35 ° C). Dejar la leche inoculada en la lata para permitir que se produzca la fermentación hasta que se alcanza un pH de 4,4. Este proceso dura aproximadamente 12 horas. </li><li> Retire la manta de la lata y abrir la lata. <ol><li> Opcional: eliminar la capa superior acuosa de la leche fermentada para obtener una textura más suave de la leche fermentada probiótica (yogur). </li><li> Opcional: Añadir sabores artificiales de calidad alimentaria (por ejemplo, fresa o vainilla), por ejemplo a una concentración de 0,1% (v / v) dosificado por un 10 ml de medición taza o cuchara (dependiendo de la concentración del sabor y la preferencia de el cliente). </li><li> Opcional: Añadir conservantes. Una opción eficaz y segura costo es el uso de sorbato de potasio en una concentración máxima de 0,12 g / L (fuente: http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/4144 aconseja 3 mg / kg de peso corporal / día). Nota: Los niños pequeños con un peso inferior a 10 kg no deben tomar more que un máximo de 30 mg de sorbato potásico cuando se toma una dosis de 250 ml de leche fermentada, que es corresponde a una dosis de aproximadamente 2 cucharadas por 50 L. </li><li> Se agita la leche fermentada a fondo con una cuchara de metal que fue previamente esterilizada por inmersión en agua hirviendo durante 15 min. </li></ol></li><li> Opcional: Paquete de la leche fermentada, transferir a un refrigerador (7 ° C) y enfriar durante al menos 3 horas antes de su consumo. Nota: Cuando se almacena en condiciones de refrigeración adecuado, por debajo de 7 ° C, el producto se consume mejor dentro de dos semanas. Cuando se almacena en condiciones de refrigeración adecuada, y se añade conservante como se describe en 3.7.3 se consume el producto mejor dentro de las 4 semanas. </li></ol> 4. Producción de otros alimentos fermentados En esta sección se describe la producción de alimentos fermentados distintos de la leche fermentada con un volumen máximo de aproximadamente 50 L. <ol><li> Pasteurizar una gasa por inmersión en agua hirviendo durante al leste 15 min. Ate la tela de queso sin apretar sobre un plato o recipiente que puede contener aproximadamente 2 l usando una cuerda o una banda de goma. </li><li> Verter el primer plato fresco en el paño de queso, evitar que se derrame más, y tener suficiente espacio entre el fondo de la taza y la gasa. </li><li> Coloque el recipiente en un refrigerador a aproximadamente 7 ° C durante 8-12 horas hasta que aproximadamente 0,5 l de suero de leche ha drenado del yogur en el recipiente. </li><li> Utilizar el suero de leche para hacer diferentes tipos de alimentos fermentados. Se dan ejemplos a continuación. Nota: Los alimentos fermentados obtenidos contendrán suero de leche (leche). La leche y sus derivados son reconocidos entre los ingredientes más comunes que causan alergias e intolerancias alimentarias. <ol><li> Para la producción de Obushera, un sorgo o bebida de Uganda basado mijo seguir el protocolo descrito por Mukisa et al. 22. </li><li> Para la producción de Uji, una papilla de Kenia hecha de maíz o sorgo o una mezcla de ambos, siga el protocolo utilizado por la Jomo Universidad Kenyatta de Agricultura y Tecnología en Kenia y descrito por Kort et al. 15. </li><li> Para la producción de Zomkom, una bebida a base de sorgo de Burkina Faso, siga el protocolo descrito por Christèle et al. 23 y Kort et al. 15. </li><li> Para la producción de Mutandabota, un producto de los frutos del árbol baobab y la leche que se consume ampliamente en el sur de África sigue el procedimiento descrito por Mpofu et al. 24. Tenga en cuenta que para este producto el motor de arranque fresco que se obtiene en la sección 1 se puede utilizar directamente sin primero realizar el paso 4.1 a 4.3. </li></ol></li></ol>

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Wilbert Sybesma y Remco Kort son los fundadores de la Yoba for Life Foundation, una organización sin fines de lucro, acreditada por las autoridades fiscales holandesas como Beneficencia Institución Pública (PBI), cuyo objetivo es promover la producción y el consumo de productos fermentados en África locales . Los productos fermentados hechos con el cultivo de siembra Yoba, incluyendo el yogur, zomkom, obushera y mutandabota no son comercializados por la fundación como tal, pero el Yoba for Life Foundation estimula la producción y la propiedad local, permitiendo que las actividades de generación de ingresos para los empresarios africanos en el sector de la alimentación . El Yoba por la Vida fundación distribuye y vende bolsitas listas para su uso con cultivos de siembra bacteriana secos a través de una red de socios y voluntarios para facilitar la producción local de productos lácteos y productos de fermentación bacteriana controlada a base de cereales.

El protocolo de producción simple usando equipamiento básico y una novela fermentado cultivo iniciador de alimentos se describe en este artículo facilita la producción de una leche fermentada probiótica de alta calidad a nivel de los hogares y en zonas rurales de países con pocos recursos. Es crítico para pasteurizar la leche durante un mínimo de 30 min con el fin de obtener la reducción o eliminación de los organismos de descomposición y los posibles microorganismos patógenos suficiente. Además, el calentamiento adecuada provoca la desnaturalización de la proteína de suero de leche 17 que, posteriormente, se asociará con micelas de caseína 25 resulta en la formación de enlaces cruzados en la leche fermentada 26. En consecuencia, la viscosidad del producto final se aumenta en comparación con la leche calentada menos extensamente 27. También es crítico para evitar la inoculación de la leche por encima de 45 ° C, ya que a temperaturas más altas se pueden inactivar las bacterias. Del mismo modo, si está disponible y el costo: eficaz, se prefiere el uso de la leche UHT, especialmente para la producción del motor de arranque fresco. En primer lugar, la leche UHT es prácticamente libre de microorganismos no deseados. En segundo lugar, en las proteínas de suero de leche UHT han sido ampliamente desnaturalizado, que los hace más accesible para proteasas bacterianas, la promoción de su degradación y posterior crecimiento de las bacterias del yogur. Durante el proceso de enfriamiento, las proteínas parcialmente refold a su estado nativo, por lo tanto, el recalentamiento antes de la inoculación es beneficioso para la producción de yogur. resultados de fermentación prolongado en una leche fermentada con un pH &lt;4,4, que es a menudo indeseable. La fermentación se puede detener de manera oportuna mediante la colocación de la leche fermentada en la nevera. Yogures producidos localmente en África han demostrado que contienen niveles significativos de lactococos 28 como L. lactis, que puede causar la producción de péptidos que tienen un sabor amargo 29-32, que es generalmente undesirable 31. Por lo tanto, es fundamental que la fermentación se lleva a cabo a una temperatura entre 45 y 35 ° C 15,28. Puesto que la temperatura disminuirá lentamente durante la fermentación en un medio semi-controlada, la inoculación se realiza a 45 ° C, la temperatura más alta permitida. aislamiento suficiente durante la fermentación es esencial para evitar la disminución de la temperatura por debajo de 35 ° C. Manual de producción de yogur en un entorno rural tiene un riesgo relativamente alto de contaminación microbiana por los organismos de descomposición. En particular, las levaduras son capaces de propagarse en las condiciones ácidas en el yogur. Contaminación de levadura puede conducir a la producción de gas excesiva, ya sea en la fase de incubación o durante el almacenamiento, estropeando así el yogur inmediatamente o significativamente acortando su vida útil 33,34. los niveles de levadura pueden minimizarse mediante la esterilización por calor y / o limpieza con hipoclorito de sodio de todos los utensilios y equipo antes de cada ingenio de contactos<html> h la leche o yogur. Sobre todo después de haberse producido el deterioro de la levadura, se requiere la esterilización y limpieza severa y extensa para eliminar la contaminación. Los riesgos anteriormente descritos muestran claramente que el éxito de la aplicación de este protocolo de producción en países con pocos recursos está limitada por su carácter manual y con ello una mayor velocidad de deterioro asociado. La velocidad de deterioro se hace aún mayor en las comunidades que carecen de instalaciones de refrigeración o tener disponibilidad altamente fluctuante de la electricidad. También la falta de acceso a material de envasado asequible de alta calidad puede limitar la absorción del protocolo descrito. El equipo requerido es básico y universal, sino un termómetro de laboratorio o en la cocina es esencial. Por último, en la actualidad sólo un número limitado de países cuentan con las instalaciones para producir el liofilizado de cultivo iniciador. La mayoría de los países de escasos recursos carecen de esas instalaciones, y por lo tanto dependen de las importaciones para obtener este producto. _content &quot;&gt; Entre los productos alimenticios, leche fermentada incluyendo el yogur es el vehículo más común para las bacterias probióticas. La producción de leche fermentada no requiere equipo especial aparte de un termómetro. Así, la combinación de los anteriores describe primero genérico cultivo iniciador probiótico 13 con un simple protocolo de producción permite la producción reproducible, controlada y segura de la leche fermentada probiótica por casi todo el mundo en cualquier lugar, incluyendo la producción a nivel de la industria del hogar y artesanía en las zonas rurales de países con pocos recursos. en practique habitualmente fermentaciones naturales, los mismos niveles de probióticos las bacterias no se pueden garantizar 9. el cultivo iniciador auto-estable en 1 g bolsitas permita a los productores en pequeña escala de manera rentable producir alimentos fermentados, sin la necesidad de comprar grandes cantidades de cultivos iniciadores que por lo general pierden su viabilidad después de abrir el paquete, especialmente cuando mantenido a temperatura ambiente y a una humedad relativa alta, que esa nuestro conocimiento el caso de todos los otros cultivos de yogur de arranque disponibles. Además, la cantidad de bacterias secas que se importa sigue siendo muy baja, por debajo de 0,1% de la concentración cultivo probiótico en el producto final, ya que casi todo el cultivo iniciador se produce localmente debido al método de pre-incubación que se describe en este protocolo . La producción de leche fermentada se describe en detalle en este artículo y puede ser un primer paso para dominar el arte de la producción de alimentos fermentados probióticos, que posteriormente se pueden aplicar a muchos tipos de fermentar otros alimentos (como se indica en este artículo). Para actualizar la leche fermentada de base, un posible paso siguiente es la producción de leche fermentada-fruta real. Esto requiere la preparación de una fruta estéril Preserve (una mezcla de frutas, azúcar y opcionalmente algunos aditivos) o la compra de una fruta ya hecho conservar para ser mezclado con la leche fermentada después de la fermentación 35,36.

Este artículo describe un protocolo de producción que permite la producción de leche fermentada nutritivo y probiótico y otros alimentos fermentados probióticas con la ayuda de un cultivo de siembra que ha demostrado beneficios para la salud. El protocolo es robusto y fácil de ejecutar por cualquier persona en cualquier lugar, incluidos los países con pocos recursos. En el África subsahariana, el 21% de las muertes de niños &lt;5 años es causada por la diarrea 1, de los cuales el 29% es causado por la etiología por rotavirus en particular 2. Se ha demostrado que el consumo diario de alimento fermentado que contiene una dosis recomendada de 1 x 10 10 UFC de L. rhamnosus GG estimula la salud del intestino y reduce la incidencia y la gravedad de la diarrea asociada con el rotavirus 3-7. Las bacterias beneficiosas están presentes en una amplia gama de alimentos fermentados tradicionales de todo el África subsahariana 8-10. Sin embargo, estos alimentos son casi exclusivamente casa-produced, tiene una vida útil corta relativa y han aumentado los riesgos de seguridad debido a la naturaleza incontrolada de la fermentación 11. Por otra parte, el consumo de estos alimentos tradicionales disminuye debido a la urbanización y occidentalización general de las dietas en África 10,12. La bacteria probiótica L. genérico rhamnosus yoba 2012 13, que es idéntica a L. rhamnosus GG, fue introducido después de la patente original de L. rhamnosus GG había expirado el 14. El cultivo de siembra seco tiene una A w de aproximadamente 0,1, lo que mantiene la elevada viabilidad después de un período de almacenamiento de al menos un año a temperatura ambiente (datos no mostrados). El cultivo de siembra se envasa en porciones de 1 g y se puede utilizar para la producción de un máximo de 100 L de leche fermentada. Cuando la producción de uno o dos ciclos al día, los cultivos iniciadores pueden ayudar a alcanzar una capacidad de producción de hasta 1.000 litros por semana a partir de la vísperary días leche fresca. El uso de L. rhamnosus yoba 2012 con S. thermophilus C106 como una cultura adyuvante que permite que el Lactobacillus probiótico para propagar 15 es un consorcio bacteriano única que no ha sido reportado por otros autores. El protocolo de producción implica la resuspensión del contenido de un paquete (1 g) de liofilizado cultivo iniciador (cultivo de siembra) en 1 L de leche, lo que resulta en una llamada de arranque fresco después de la incubación durante un período de 16 horas. El primer plato fresco se utiliza a continuación para inocular un máximo de 100 L de leche. Este método de pre-incubación reduce la cantidad de bacterias liofilizadas utilizados, reduciendo así los costes de producción en comparación con la incubación directa como se describe por ejemplo por Goff 16. La formulación usada para el protocolo descrito en este documento mantiene las ventajas de un cultivo seco de congelación, tales como estabilidad de almacenamiento y facilitar el almacenamiento y la manipulación, lo que resulta en altamente rfermentaciones eproducible. Además, el protocolo de producción tal como se describe en este artículo no requiere equipos de alta tecnología en comparación con los métodos de producción estándar que se utilizan en el mundo desarrollado 17. Por último, el motor de arranque fresco se puede utilizar para la inoculación de otra (no láctea) materias primas para la producción de una amplia gama de alimentos fermentados como se muestra con éxito para Obushera, Kwete, Uji, y Zomkom, todos los alimentos tradicionalmente fermentados a base de cereales de Uganda (los dos primeros), Kenia y Burkina Faso, respectivamente 15. Esta es sólo una pequeña fracción de la gran cantidad de alimentos fermentados desarrollados en África 18. La fermentación es la ruptura de las macromoléculas, tales como almidón, azúcares y proteínas en productos que tienen un aumento de la digestibilidad, a través de las actividades de las enzimas y / o microorganismos. La fermentación es una técnica ampliamente utilizada en el África subsahariana. Ataviaréter con el secado y salazón que permite la conservación de alimentos en ausencia de instalaciones industriales o técnicas tales como el enlatado 9,19 refrigeración. Fermentación tradicional a menudo utiliza copia de vaciado manual, en el que se añade una pequeña parte de un lote anterior a un nuevo lote para facilitar la fermentación y para reducir la probabilidad de fallo de la fermentación 11. Harrison y Tomkins 20 describen una amplia gama de alimentos tradicionales africanos fermentada a base de maíz, el sorgo o el mijo, y el papel beneficioso que estos alimentos pueden llevar a los niños de destete, por ejemplo mediante la reducción de la diarrea infantil y la mortalidad asociada. Nout y Sarkar 19 describen la producción tradicional de un plato de yuca fermentada que se consume ampliamente en África occidental. Franz et al. 9 proporciona una amplia descripción de los alimentos fermentados africanos clasificados en los alimentos vegetales, cereales y alimentos con almidón de raíz de cultivos y alimentos de proteína animal. Además de eso, Narvhus y Gadaga <shasta&gt; 21 describir específicamente la producción tradicional de leche fermentada en África. Para la producción de leche fermentada con probióticos (o otros alimentos fermentados), especialmente en el caso de producción en el hogar, la disponibilidad de un congelador es ventajoso almacenar el motor de arranque fresco en porciones congeladas. En países con pocos recursos, la producción de leche fermentada se puede ejecutar así por las comunidades productoras de leche. La experiencia actual con las comunidades locales en Uganda indica que las cooperativas lecheras son entidades adecuadas para tener en la producción de yogur a partir de sus propios suministros de leche. La disponibilidad de una lata de leche es ventajoso, aunque también es posible, aunque menos preferible, para preparar grandes lotes de leche fermentada en una cacerola más grande. Por otra parte, la disponibilidad de energía eléctrica y la presencia relacionada con las mismas de instalaciones en tiendas y quioscos locales de refrigeración en los países con pocos recursos es una ventaja en la expansión del negocio y la reducción of pérdidas debido a su deterioro. Sin embargo, como se discutirá en el protocolo, a través de la adición de sorbato de potasio, es posible preservar el yogur durante varios días a temperatura ambiente y reducir spoilages en caso de fluctuaciones de energía.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yoba starter culture</td>
			<td style="width:199px;">Yoba for Life foundation</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:501px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Milk</td>
			<td>Obtained from local cow</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Fresh, whole milk, free from antibiotics and obtained from a healthy cow</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Optionally sugar</td>
			<td>Bought at local supermarket</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Canesuger was used, but beet sugar is also possible. Free from impurities</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Laboratory Thermometer</td>
			<td>Narang Scientific Industries</td>
			<td>TM-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lactometer</td>
			<td>Narang Scientific Industries</td>
			<td>LM-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol 96%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">476226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pH paper</td>
			<td>Macherey-Nagel GmbH &#38; Co</td>
			<td style="width:119px;">90206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cheesecloth</td>
			<td>Beyond Gourmet</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Any high quality food grade cheese cloth can do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sieve/strainer</td>
			<td>Cuisinart</td>
			<td>CTG-00-3MS</td>
			<td>Any fine mesh strainer can do, but stainless steel strainers are preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 l Thermos flask</td>
			<td>Bought at local warehouse</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 liter pan + lid</td>
			<td>Bought at local warehouse</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 liter pan</td>
			<td>Bought at local warehouse</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Any heat- and waterproof material will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 liter pan</td>
			<td>Bought at local warehouse</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Any heat- and waterproof material will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Milk can</td>
			<td>Narang Scientific Industries</td>
			<td>MC-SS-30</td>
			<td>Any stainless steel milkcan can do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Blanket</td>
			<td>Bought at local warehouse</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>The thicker the blanket, the better the isolation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel production protocol for small-scale manufacture of probiotic fermented foods

Un secado novela consorcio bacteriano de Lactobacillus rhamnosus yoba 2012 y Streptococcus thermophilus C106 se cultiva en 1 L de leche. Este arrancador fresco puede ser utilizado para la producción de leche fermentada y otros alimentos fermentados, ya sea en casa o en pequeña escala en los entornos rurales. Para el motor de arranque fresca, 1 L de leche se pasteuriza en un molde que se ajusta a una más grande bandeja de agua que contiene, colocado sobre una fuente de calor. En este baño de agua, la leche se calienta y se incubaron a 85 ° C durante 30 min. A continuación, la leche se enfría a 45 ° C, se transfirió a un matraz de vacío, se inocularon con las bacterias secas y la izquierda durante al menos 16 horas entre 30 ° C y 45 ° C. Para el propósito de la producción de casa frecuente, el motor de arranque fresco está congelado en cubitos de hielo, que se pueden utilizar para la producción de pequeños volúmenes de hasta 2 L de leche fermentada. A los efectos de la producción a pequeña escala en los países con pocos recursos, la pasteurización de hasta 100 litros de leche is llevados a cabo en latas de leche que se colocan en una cacerola grande llena de agua y se calienta a fuego a 85 ° C durante 30 minutos, y posteriormente se enfrió a 45 ° C. A continuación, el 100 L lote se inoculó con el 1 L de arranque recién preparada se mencionó antes. Para asegurar una fermentación eficaz a una temperatura entre 30 y 45 ° C, la leche puede está cubierto con una manta para 12 hr. Para la producción de alimentos fermentados no lácteos, el motor de arranque fresca se deja en un paño de queso durante 12 horas, y el suero escurrido-off puede ser utilizado posteriormente para la inoculación de una amplia gama de materias primas alimentarias, incluyendo verduras y cereales o alimentos a base.

El lado izquierdo de la Tabla 1 muestra un diagrama esquemático de la sección 1 del protocolo. Esto es seguido por un diagrama combinado generalizado de las secciones 2 y 3 en el lado derecho de la tabla. Los perfiles de fermentación de la leche inoculada con el cultivo de siembra usando el protocolo de producción como se describe en este artículo se registraron. La Figura 1 muestra la fermentación del arrancador fresco (como se describe en la sección 1). La Figura 2 muestra la fermentación de la leche fermentada (producto final , tal como se describe en las secciones 2 y 3). Como en la práctica en las áreas rurales de control estricto de la temperatura es difícil, las mediciones se realizaron a una temperatura de 37 ° C y 45 ° C. Para la fermentación a 37 ° C, los perfiles de acidificación de los dos sobres probados muestran una ligera diferencia en la apariciónde la acidificación exponencial de aproximadamente 30 minutos, tanto en la producción del motor de arranque fresco y el producto final. Los valores de pH finales de ambas culturas son iguales después de 16 horas. Valores de pH típicos y los títulos para el L. propagado rhamnosus y S. cepas thermophilus siguiendo los procedimientos de producción descritos para diferentes alimentos fermentados se puede encontrar en la Tabla 2. recuentos de células de L. rhamnosus y S. thermophilus se determinó en medio de agar MRS y LM17, respectivamente, mediante el uso de métodos de chapado microbiológicos comúnmente aplicados. Los recuentos celulares finales de L. rhamnosus yoba 2012 fueron de 1,7 x 10 7, 3,7 x 10 9 y 3,3 x 10 9 UFC ml-1 para la leche fermentada, KWETE y uji, respectivamente. valores de pH finales fueron de 4,3 y 4,2 para la leche fermentada y KWETE, respectivamente. Los resultados preliminares indicaron que la adición de potassorbato sium antes de la fermentación no influye negativamente pero incluso aumenta el número de L. viable rhamnosus yoba 2012 bacterias en el yogur dos semanas después de la producción (datos no mostrados). La Figura 3 muestra los resultados de la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en combinación con un detector de índice de refracción (RI) de leche no fermentada en comparación con la leche fermentada. Los resultados indican que los niveles de lactosa en la disminución de la leche, mientras que los niveles de ácido láctico y los niveles de galactosa incremento, que es un resultado de la actividad metabólica del cultivo de siembra. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54365/54365fig1.jpg" /> Figura 1. Perfil de Fermentación del motor de arranque recién hecho de semi leche desnatada (1,5% de grasa, 3,5% de proteínas). Un litro de leche se inoculó con una bolsita (1 g) de cultivo de siembra y se fermenta a 37 ° C(••••, duplicar), así como 45 ° C (- - - -, duplicar) durante 16 hr. La línea recta (----) a pH 4,4 se inserta como una indicación para determinar cuando se completa la fermentación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54365/54365fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54365/54365fig2.jpg" /> Figura 2. Perfil de Fermentación de la leche fermentada (producto final) hecha de semi leche desnatada (1,5% de grasa, 3,5% de proteínas). Un litro de leche se inoculó con un 20 g de iniciador fresco y fermenta a 37 ° C (•• ••, duplicar), así como 45 ° C (- - - -, duplicar) durante 16 hr. La línea recta (----) a pH 4,4 se inserta como una indicación para determinar cuando se completa la fermentación.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54365/54365fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54365/54365fig3.jpg" /> Figura 3. Patrones de HPLC-elución de leche no fermentada (negro) y leche fermentada durante 16 horas con el cultivo de siembra (azul). Los patrones de elución indican el consumo de lactosa y la producción de galactosa y lactato. Los azúcares y los ácidos débiles se identificaron sobre la base del tiempo de retención y la relación de área de superficie máxima de absorbancia UV e índice de refracción. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54365/54365fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="tabla 1" src="/files/ftp_upload/54365/54365tbl1.jpg" /> Tabla 1. Las semillas de cultivo Applica<html> protocolo ción. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54365/54365tbl1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.</a> <img alt="Tabla 2" src="/files/ftp_upload/54365/54365tbl2.jpg" /> Tabla 2. Propagación de Lactobacillus rhamnosus yoba 2012 en una variedad de alimentos fermentados. Los datos se obtuvieron de Kort et al. 15. Las fermentaciones se llevaron a cabo a 37 ° C a menos que se indique lo contrario. El recuento de células de L. rhamnosu s yoba 2012 y S. thermophilus C106 después de la inoculación tanto varió entre 1 x 10 6 y 1 x 10 7 UFC ml-1. El mutandabota funcional se prepara con un motor de arranque que contenga exclusivamente L. rhamnosus yoba 2012 según lo informado por Mpofu et al. 24; ND, no determinado.d / 54365 / 54365tbl2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla. Archivo suplementario. La producción local y las ventas de yogur probiótico en zonas rurales de África. Disparos y se toman imágenes en Balawoli y Namagera, Uganda, mayo de 2016. El clip muestra la cadena de valor a partir de la recepción de la leche de procesamiento, embalaje, venta y, finalmente, con el consumo de un lote de 50 litros de yogur probiótico, preparados con el uso de sólo el equipo básico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54365/yoba_production_in_Uganda_suppl_material.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar.</a>

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Novel Production Protocol for Small-scale Manufacture of Probiotic Fermented Foods

A production protocol is described for the small-scale production of probiotic fermented dairy drink with the aid of a novel bacterial starter culture.

Protocolo de Producción novela de pequeña escala Fabricación de probióticos alimentos fermentados

A novel dried bacterial consortium of Lactobacillus rhamnosus yoba 2012 and Streptococcus thermophilus C106 is cultured in 1 L of milk. This fresh starter ...

novel-production-protocol-for-small-scale-manufacture-probiotic

Research

JoVE Journal

Biology

23.5K vistas.  Yoba for Life Foundation. A production protocol is described for the small-scale production of probiotic fermented dairy drink with the aid of a novel bacterial starter culture. 

Video: Novel Production Protocol for Small-scale Manufacture of Probiotic Fermented Foods

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

Protocolo para la cría de los mosquitos (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Investigación

Biología

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

Aislamiento de neutrófilos Protocolo

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

Lentivirus Production

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are silenced at the post-transcriptional state. Short hairpin RNAs, precursors to siRNA, can be expressed using lentivirus, allowing for RNAi in a variety of cell types. Lentiviruses, such as the Human Immunodeficiency Virus, are capable to infecting both dividing and non-dividing cells. We will describe a procedure which to package lentiviruses. Packaging refers to the preparation of competent virus from DNA vectors. Lentiviral vector production systems are based on a 'split' system, where the natural viral genome has been split into individual helper plasmid constructs. This splitting of the different viral elements into four separate vectors diminishes the risk of creating a replication-capable virus by adventitious recombination of the lentiviral genome. Here, a vector containing the shRNA of interest and three packaging vectors (p-VSVG, pRSV, pMDL) are transiently transfected into human 293 cells. After at least a 48-hour incubation period, the virus containing supernatant is harvested and concentrated. Finally, virus titer is determined by reporter (fluorescent) expression with a flow cytometer.

To make lentiviruses, DNA vectors are transfected into human 293 cells. After harvest and concentrating the supernatant, virus titer is determined by fluorescence expression with a flow cytometer.

Lentivirus de producción

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are ...

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. KLRG1 exists both as a monomer and as a disulfide-linked homodimer. This well-conserved receptor is found on the most mature and recently activated NK cells as well as on a subset of effector/memory T cells.
Using KLRG1 tetramer as well as other methods, E-, N-, and R-cadherins were identified as KLRG1 ligands. These Ca2+-dependent cell-cell adhesion molecules comprises of an extracellular domain containing five cadherin repeats responsible for cell-cell interactions, a transmembrane domain and a cytoplasmic domain that is linked to the actin cytoskeleton. 
Generation of the KLRG1 tetramer was essential to the identification of the KLRG1 ligands. KLRG1 tetramer is also a unique tool to elucidate the roles cadherin and KLRG1 play in regulating the immune response and tissue integrity.

This protocol describes the production of KLRG1 tetramer, which is a powerful tool for the analysis of KLRG1 ligands.

Un protocolo para la producción de KLRG1 Tetramer

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Extracción de ADN a partir de material incluido en parafina para análisis genéticos y epigenéticos

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

De alto rendimiento de sacarificación de ensayo para materiales lignocelulósicos

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

Los pequeños extractos nucleares para ensayos funcionales de los mecanismos de expresión de genes

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Aislamiento de mitocondrias a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para mediciones de alto rendimiento de microplacas Respiratorias

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Medición y Análisis de la producción de ácido extracelular para Determinar glicolítica Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible cytoplasmic compartments. Another hurdle is the tight apposition of myofibers to the surrounding tissues. Because the process of tissue fixation and paraffin embedding leads to the shrinkage of muscle fibers, freezing is an optimal means of hardening muscle tissue for sectioning. However, a commonly encountered issue, the formation of ice crystals, occurs during the preparation of frozen sections because of the high water content of muscle. The protocol presented here first describes a simple and efficient method for properly freezing muscle tissues by immersing them in liquid nitrogen. The problem with using liquid nitrogen alone is that it causes the formation of a nitrogen gas barrier next to the tissue, which acts as an insulator and inhibits the cooling of the tissues. To avoid this "vapor blanket" effect, a new cryovial was designed to increase the speed of liquid flow around the tissue surface. This was achieved by punching a total of 14 inlet holes in the wall of the vial. According to bubble dynamics, a higher rate of liquid flow results in smaller bubbles and fewer chances to form a gas barrier. When liquid nitrogen flows into the cryovial through the inlet holes, the flow velocity around the tissue is fast enough to eliminate the gas barrier. Compared to the method of freezing muscle tissues using pre-chilled isopentane, this protocol is simpler and more efficient and can be used to freeze muscle in a throughput manner. Furthermore, this method is optimal for institutions that do not have access to isopentane, which is extremely flammable at room temperature.

This protocol describes a procedure to freeze muscle tissues by plunging them directly into liquid nitrogen. This protocol also highlights a new cryovial that can avoid the &#34;blanket effect&#34; of nitrogen gas when liquid nitrogen contacts the tissue surface of a specimen.

A Multi-agujero criovial Elimina congelación Artifacts cuando los tejidos musculares se sumergen directamente en nitrógeno líquido

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...