We thank Dr. Daniel Bumbarger for the predation behavior picture. This work was funded by the Max-Planck Society.

1. Boca forma Fenotipificación <ol><li> Forma de identificación boca en agarosa de ratones Nota: Con el fin de visualizar los morfos boca de nematodos, inmovilizar los gusanos con un tratamiento anestésico suave en los cojines de agarosa y observar como sigue. <ol><li> Crecer y mantener los cultivos de nematodos como P. pacificus en 6 cm de medios de cultivo estándar de nematodos (NGM) placas y se alimentan de un césped de bacterias de E. coli OP50 19. </li><li> Haga cojines de agarosa mediante la adición de 0,06 g primero de agarosa para 3 ml H 2 O en un tubo de 15 ml para hacer la solución de agarosa al 3 ml 2%. Esto se puede almacenar durante un máximo de un año a 4 ° C. </li><li> Mezclar y fundir la agarosa a fondo en un horno de microondas o alternativamente usar un bloque de calor ajustado a&gt; 88 ° C. </li><li> Una vez totalmente derretida, añadir 10 l de una solución de azida de sodio al 10% a la agarosa y mezclar bien. PRECAUCIÓN: La azida de sodio seco es reactiva y todas las formas son tóxicos. </li><li> El uso de un 1 mlmicropipeta, coloque una gota de no menos de 300 l de la mezcla de azida de agarosa líquido en el medio de un portaobjetos de vidrio estándar. </li><li> Antes de que el agar se enfría, coloque rápidamente un segundo portaobjetos de microscopio en la parte superior de la gota con el fin de aplanar la agarosa que forma una almohadilla al enfriar. Repita para tantas pastillas como se requiere. </li><li> Justo antes de su uso, Despegue las portaobjetos de vidrio deslizándolos fuera el uno al otro. Nota: Si las almohadillas de agarosa se preparan con mucha antelación pueden ser excesivamente seco y pueden dañar los nematodos. </li><li> Para transferir los gusanos a las almohadillas de agarosa anestésicos, colocar una gota de tampón M9 (2 - 3 l) en el centro de la almohadilla. Escoja 2 - 3 P. joven adultos pacificus en la gota de M9 antes de colocar un cubreobjetos con cuidado sobre la almohadilla. El P. nematodos pacificus serán inmovilizados en la agarosa y listo para visualizar. </li><li> Transferir el portaobjetos de microscopio que contiene el gusano anestesiado a un microscopio una adecuadand observar bajo la óptica Nomarski 63X. Categorizar las identidades de morphing en base a las siguientes características: la presencia de un diente adicional sub-ventral, diente dorsal ampliada y la apertura de boca ancha es indicativo de un animal de la boca de metamorfosis eurystomatous, mientras que la presencia de un solo diente dorsal y apertura de la boca más estrecha indica una stenostomatous animales (Figura 1). Nota: Con el fin de mantener la salud del animal, gusanos deben mantenerse en la plataforma de agar por no más de 5 minutos. </li><li> Después de la identificación de metamorfosis boca, recuperar los nematodos ya sea eurystomatous o stenostomatous como lo requiere la eliminación de la hoja de la cubierta deslizando suavemente fuera de la almohadilla de agarosa. Elegir cuidadosamente los animales seleccionados de la almohadilla de agarosa (E. coli OP50 se puede utilizar en la selección para ayudar a que sea más pegajoso) en placas NGM frescas. Permitir la recuperación de la anestesia hasta el comportamiento de la movilidad se ha normalizado en la que los animales están listos para más ensayos depredadores. </li></ol></li> &lt;li&gt; Rápido Boca Fenotipificación Nota: Como alternativa, con más experiencia, la boca tipo de formulario se puede analizar sin necesidad de ningún tratamiento anestésico a través de un microscopio estereoscópico con gran aumento (150X). <ol><li> Coloque los nematodos en las placas de NGM estándar con un césped de bacterias de E. OP50 coli en el área de visión del microscopio. </li><li> Detectar diferencias en el tamaño de la boca y la anchura. Nota: Con este aumento sin dientes como las estructuras son observables por lo tanto, la identificación de metamorfosis boca se basa únicamente en bocas anchas frente a las bocas estrechas. </li></ol></li></ol> 2. Ensayo de la mordedura Nota: Los ensayos que muerden permiten un análisis del comportamiento predatorio detallada. <ol><li> Crecer y mantener cultivos de nematodos en las placas de NGM estándar (6 cm) y se alimentan en un césped bacteriano de E. coli OP50 19. </li><li> Hacer placas de ensayo por el crecimiento de una gran cantidad de larvas de nematodos presa seleccionada, tal como C. elegans o alternatively una presa adecuada ecológicamente pertinentes. Nota: Adulto C. elegans son demasiado grandes para ser presa adecuada por lo que es importante utilizar la etapa larval. <ol><li> Mantener C. elegans u otras especies de presas potenciales en las placas estándar NGM y alimentación en un césped de bacterias de E. coli OP50 hasta que la población está recién hambre, lo que resulta en una abundancia de larvas L1 joven. Nota: La hora de la inanición depende de numerosos factores ambientales y experimentales, incluyendo el número de nematodos utilizadas para iniciar el cultivo, la cantidad de E. coli OP50 añadió, y la temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Lavar cuatro o más placas de presa recién muertos de hambre con la M9 y pasar la solución de tornillo sin fin a través de dos filtros de 20 micras para eliminar todos los animales grandes y los huevos restantes antes de la recogida en un tubo de 15 ml. Sólo un pequeño larvas debe permanecer en la solución. </li><li> Para formar un sedimento de larvas centrifugar la presa filtrada a 377 xg durante 1 min. </li><li&gt; Pipeta 3 l de sedimento gusano puro sobre una placa de NGM 6 cm sin E. OP50 coli presente y esperar al menos 30 minutos para que las larvas hacia fuera lo suficiente como para generar una placa de ensayo. Nota: 3 l de sedimento gusano puro en las placas de ensayo estándar contienen&gt; 3,000 larvas presa. Esto es suficiente para generar un contacto frecuente entre depredadores y presas. </li><li> Nemátodos depredadores de pantalla para la metamorfosis boca requerida (protocolo 1). </li><li> Utilizando técnicas de gusano recoger estándar y un microscopio estereoscópico de luz 19, transferir depredadores clasificados correctamente a la placa de ensayo. Tener cuidado de transferir como bacterias poco OP50 como sea posible a la placa de ensayo al transferir depredadores con el fin de minimizar la contaminación bacteriana. Espere 15 minutos para permitir que el tornillo sin fin de recuperarse de la tensión de ser transferido y comprobar si de tipo salvaje comportamiento de la movilidad para asegurar gusanos no han sido dañados por la transferencia. Nota: No hay necesidad de pasar hambre P. pacificus, ya que son depredadores altamente eficientes de otras larvas de nematodos, incluso aunque bien alimentado de bacterias. </li><li> Después de la recuperación, observe el depredador utilizando un microscopio estereoscópico luz durante 10 minutos. Con este equipo, observar y caracterizar los distintos eventos de alimentación tales como morder, caracterizada por el depredador restringiendo el movimiento de la presa; matar, donde por una abertura de la cutícula se detecta una presa; y la alimentación, clasificados por un consumo observable de las entrañas de la presa (Figura 2 A, B y Película 1). </li><li> Repetir el ensayo mediante el cribado y la observación de un mínimo de 10 nemátodos depredadores individuales para asegurar la exactitud. </li></ol> 3. Ensayo de cadáver Nota: Los ensayos Corpse facilitar una más rápida cuantificación del comportamiento depredador. <ol><li> Crecer y mantener los cultivos de nematodos en las placas de NGM estándar y se alimentan de una l bacterianaarista de E. coli OP50 19. Generar triplicados de las placas de ensayo mencionados anteriormente (protocolo de 02/01 a 02/05). </li><li> Nemátodos depredadores de pantalla para la metamorfosis boca requerida como se describe en el protocolo 1. El uso de técnicas de gusano recoger estándar y una transferencia microscopio estereoscópico luz 5 nemátodos depredadores con la metamorfosis boca requerida para cada placa de ensayo. Deje los depredadores, junto con la presa durante 2 horas. </li><li> Después de 2 horas de pantalla de la placa de ensayo para determinar la presencia de cadáveres vaciados (Figura 2 B y C). Identificar cadáveres por la ausencia de la motilidad junto con defectos morfológicos evidentes incluyendo fugas entrañas o faltan fragmentos de gusano. </li></ol> 4. Análisis de faríngea y movimiento de los dientes <ol><li> Crecer y mantener los cultivos de nematodos en las placas de NGM estándar y se alimentan de un césped de bacterias de E. coli OP50 19. Generar placas de ensayo como se ha mencionado anteriormente (protocolo de 2/1 a 2/5). Si estándar de 6 cmNGM placas no encajan entre el objetivo y la platina del microscopio, utilice la tapa de pequeñas placas de Petri de 35 mm que contienen 2 ml NGM como una alternativa adecuada. </li><li> Nemátodos depredadores de pantalla para la metamorfosis boca requerida como se describe en el protocolo 1. Utilizando técnicas estándar de gusano de picking y un microscopio estereoscópico luz, la transferencia de un solo depredador clasificado correctamente a la placa de ensayo. Espere 15 minutos para permitir que el tornillo sin fin de recuperarse de la tensión de ser transferido. </li><li> Observar a los animales depredadores en un microscopio a 40 - 63X Normaski, con una cámara de alta velocidad (Películas 2 y 3). Record faríngea de bombeo y movimiento de los dientes durante 15 s, a 50 Hz en al menos 20 animales para asegurar la cuantificación exacta. Replay registra películas a la velocidad deseada con el fin de contar con bombas individuales y eventos de dientes. Nota: El bombeo se observa en el corpus, situado en el medio de la faringe, mientras que el movimiento del diente es detectable en la abertura de la boca y sólo es observido desde el diente dorsal. </li></ol>

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The authors declare no financial or competing interests.

Los nematodos proporcionan un sistema de gran alcance para la comprensión de la neurobiología y comportamiento con C. elegans siendo hasta el momento la principal herramienta. Sin embargo, numerosas especies de nematodos incluyendo P. visualización comportamientos pacificus, que están ausentes o varían en complejidad desde el organismo modelo C. elegans y por lo tanto plantean cuestiones fascinantes sobre la evolución y la regulación de estos comportamientos. Un tal comportamiento adicional se encuentra en muchas otras especies de nematodos incluyendo P. pacificus es la capacidad para complementar su dieta bacteriana mediante la participación de la alimentación de los depredadores 1, 20. Por tanto, hemos desarrollado y descrito un protocolo detallado para la caracterización fácil y rápida de estos comportamientos predatorios no analizadas previamente en los nematodos. En primer lugar, hemos proporcionado métodos para la detección de variaciones en el aparato de alimentación dentro de la boca de los nematodos. La identificación del tipo correcto boca es un primer s esencialTEP para los ensayos de depredación de éxito como, al menos dentro del género Pristionchus únicos animales eurystomatous son capaces de alimentación de depredadores. Es mejor para identificar boca se transforma con el protocolo &quot;rápida boca fenotipificación&quot; se describe en el protocolo de 1,2 ya que este método es que es mucho menos invasiva y por lo tanto es menos probable que los comportamientos depredadores pueden ser perturbados. Sin embargo, se recomienda para convertirse primero familiarizado con las diferentes estructuras de la boca por la identificación con animales anestesiados en las almohadillas de agar (protocolo 1.1). Después de la identificación de la metamorfosis boca deseada, hemos descrito dos ensayos para cuantificar la alimentación depredadora. Estos son una, de alto rendimiento &quot;ensayo de cadáver&quot; rápida (protocolo 3) y una más tiempo, pero el análisis del comportamiento en mayor profundidad a través del &quot;ensayo de mordida&quot; (protocolo 2). Ambos de estos protocolos son altamente flexible que permite varias modificaciones con el fin de optimizar los ensayos de función de las experimenrequisitos Tal. Para los ensayos de mordedura utilizando P. depredadores pacificus en C. elegans presa, observaciones de las interacciones de comportamiento depredadores para una ventana de tiempo de 10 min era suficiente para cuantificar una cantidad significativa de picaduras junto con otros eventos de alimentación. Para los ensayos de &quot;cadáver&quot; de nuevo utilizando P. depredadores pacificus en C. elegans presa, 5 depredadores durante 2 horas produjo números cadáver fácilmente cuantificables y coherentes que permitan un rápido análisis de comportamiento. Sin embargo, debe tenerse en cuenta diferentes especies de depredadores movimiento nematodo a diferentes velocidades, comer a diferentes velocidades y generalmente demuestran una gran diversidad de otros comportamientos 1. Además, diferentes especies de presa también se pueden comer a tasas diferentes por razones similares. Por ello se recomienda para optimizar los ensayos basados ​​en las especies de nematodos ensayados tanto como depredadores y presas, y también la existencia de diferencias en las condiciones ambientales. Durante los dos &quot;mordida&quot; y &quot;cuerpose &quot;ensayos es fundamental que tanto la presa y los depredadores son saludables, como estrés o depredadores lesionados no van a matar de manera eficiente. Además, las placas de ensayo frescos son esenciales como placas de mayor edad pueden llegar a ser seca que afecta negativamente a la salud de los nematodos que conduce a errónea ensayos. también se espera que las futuras versiones de estos ensayos depredadores serán capaces de tomar ventaja de los recientes avances en la tecnología con el fin de automatizar gran parte del análisis que se ha logrado para la investigación de muchos de los comportamientos observados en C. elegans 21, 22. en la actualidad problemas es probable que surjan en los nematodos tales como P. pacificus como aparecen mucho más sensible al contacto, por lo que el aislamiento e inmovilización en cámaras de microfluidos probables abrogar la alimentación depredador. la superación de este puede ser un reto, pero facilitaría nematodos individuales a ser examinados en búsqueda sutil depredadora comportamientos. Por último, también hemos proporcionado métodos FOr examinar el aparato de alimentación de los nematodos en sí facilitar las comparaciones entre los modos de alimentación depredadores y bacterianas mediante la cuantificación de la cinética de los dientes y de bombeo faríngeo usando una cámara de alta velocidad (protocolo 4). La cuantificación de las tasas de bombeo de la faringe en C. elegans se ha utilizado para controlar la alimentación durante muchos años 23, sin embargo, C. elegans carece de cualquier forma de denticle boca y también carece de comportamientos abusivos. A través de la combinación de la cuantificación de la faringe de bombeo con el de la actividad de los dientes, se puede también observar cualquier inervación de los dientes específicos a la depredación. Debido a la ampliación necesaria para observar el movimiento de los dientes de los animales a menudo se mueven fuera del plano focal, por lo que es por lo general sólo es posible observar el diente por ventanas de tiempo cortos. Además, a diferencia de C. elegans, la faringe de P. pacificus no bombea de forma continua, sino que se dedica a los hechizos de bombeo y la alimentación. Por lo tanto, para la exacta pum faríngealas tasas de ping mientras que la alimentación que se determinen, es importante registrar 15 segundos de alimentación continua. Estos métodos presentados aquí, por lo tanto proporcionan el primer marco para la investigación de comportamientos depredadores en los sistemas de nematodos. Por otra parte, también pueden ser adaptables para su uso en la investigación de otras interacciones dentro del ecosistema nematodo incluyendo la influencia de organismos además ecológicamente relevantes en la depredación incluyendo microorganismos, hongos y ácaros . Por tanto, proporcionan un medio para diseccionar cómo se regulan estos comportamientos predatorios, la forma en que pueden haber evolucionado y también su importancia ecológica.

Los nematodos con sus pequeños pero complejos sistemas nerviosos han demostrado ser herramientas poderosas para la comprensión de muchos aspectos de la neurobiología incluyendo el comportamiento. Gran parte de esta investigación se ha centrado en el organismo modelo Caenorhabditis elegans en el que una gran cantidad de diferentes comportamientos han sido diseccionados y analizados con éxito. Estos incluyen mecanosensorial 3, 4 quimiotáctica, thermotactic 5,6 y 7 magnetotáctica influir en el apareamiento 8,9, el aprendizaje 10 y comportamientos de alimentación 11. Sin embargo, otras especies de nematodos más alejadas exhiben conductas que no se observan en el rhabditid C. elegans o, alternativamente, muestran niveles adicionales de complejidad, lo que plantea preguntas pertinentes respecto a su evolución y regulación. Un tal ejemplo de esto se puede observar en el nematodo diplogastrid alejadas Pristionchus pacificus, que muestra mucho más compleja de alimentación seráconductas y ritmos que los observados en C. elegans 1. Esto es a pesar de las dos especies comparten las neuronas faríngeas homólogos 12. Coincidiendo con estos comportamientos de alimentación adicionales, P. pacificus también muestra una variedad en la dieta expandido, ya que son depredadores ávidos, capaces de complementar su dieta bacteriana por también se alimentan de las larvas de otros nematodos. Afortunadamente, P. pacificus se ha desarrollado como un modelo para la biología evolutiva comparativo e integrador y por lo tanto muchas herramientas moleculares y genéticos están ahora disponibles. Estos incluyen un genoma secuenciado en su totalidad y anotado 13, las herramientas moleculares y genéticos, incluyendo los transgenes 14 y CRISPR / Cas9 15,16, así como una filogenia detallada y bien anotado 17 con más de 25 especies estrechamente relacionadas, incluyendo su especie hermana recién descubiertos. Además, la ecología de numerosas especies Pristionchus incluyendo P. pacificus es quell definido con muchas especies ahora Habiéndose descrito compartiendo una asociación necromenic con escarabajos, una serie que comparten con frecuencia con otras especies de nematodos 18. P. por lo tanto pacificus proporciona un excelente sistema modelo con el que para diseccionar la evolución de comportamientos novedosos y su importancia ecológica. Con el fin de analizar los comportamientos de alimentación en especies de nematodos depredadores tales como P. pacificus hemos desarrollado varios ensayos de comportamiento novedosas para facilitar la observación y cuantificación de las acciones depredadoras. Como P. pacificus muestra una estructura de boca dimórfico, que influye fuertemente en el comportamiento depredador, la identificación del morfotipo correcta es esencial 1,2. La estrecha morfo stenostomatous boca contiene un solo diente dorsal roma y no participa en ninguna alimentación de depredadores. Por otra parte, la gran metamorfosis eurystomatous boca incluye una mucho más grande en forma de garra del diente dorsal y una contrapuestadiente sub-ventral, que en conjunto operan de manera eficiente para abrir la cutícula de sus presas. La relación de la eurystomatous depredador a la forma stenostomatous no depredadores varía entre las especies Pristionchus y también dentro de P. pacificus, sin embargo, el porcentaje de la boca eurystomatous morph en el P. pacificus cepa de tipo salvaje (PS312) es por lo general 70 - 90% 2. Además, las relaciones de forma boca pueden fluctuar dependiendo de las diferentes influencias del medio ambiente (ambos conocidos, incluyendo la inanición y algunos pequeños de señalización, así como factores desconocidos molécula), la identificación de este modo correcto y el aislamiento de la forma de la boca eurystomatous depredador es esencial para los ensayos de depredadores exitosos. Junto a la descripción de la forma de la boca depredador hemos desarrollado un &quot;ensayo de mordida&quot; para la observación directa y la cuantificación de los comportamientos depredadores, incluyendo morder, de matar y alimentándose eventos. Aquí nematodos presa son aislados a través del filtroción de las culturas recién desnutridos y adultos expuestos a depredadores P. pacificus, que se observan en conjunto en un lapso de tiempo corto. Además, también hemos desarrollado un alto rendimiento &quot;ensayo de cadáver&quot; para facilitar la detección rápida de comportamiento depredador través de la observación indirecta de eventos predatorios. Esto se aprovecha de la presencia de cadáveres de larvas como una herramienta para la detección de la depredación. Ambos ensayos proporcionan métodos fáciles y altamente repetible para observar y medir el comportamiento depredador de las especies de nematodos como P. pacificus.

<table><tbody><tr><td>Nylon net filters (20 &amp;#181;m)</td><td>Merck Millipore Ltd</td><td>NY2004700</td><td>Used to filter worms just leaving larvae for use as prey.</td></tr><tr><td>PP Funnel for filter (54 mm)</td><td>Duran</td><td>292215003</td><td>Used to filter worms just leaving larvae for use as prey.</td></tr><tr><td>Small petri dish (35/10 mm)</td><td>Greiner Bio-One&amp;nbsp;</td><td>627102</td><td>For imaging on High speed camera</td></tr><tr><td>Zeiss SteREO Discovery V12</td><td></td><td></td><td>For mouth form identificaton</td></tr><tr><td>Axio-Imager A1</td><td></td><td></td><td>For mouth form identificaton</td></tr><tr><td>Glass Slides</td><td>Roth</td><td>H869</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slips</td><td>Roth</td><td>657</td><td></td></tr><tr><td>Motion Scope M3 Highspeed camera</td><td>IDT</td><td></td><td>High speed camera</td></tr><tr><td>Video zoom 44 ENG 1/2&quot; 0.5X to 2.4X</td><td>Zeis</td><td>452984-0000-000</td><td>High speed camera zoom</td></tr><tr><td>Nematode Growth Medium (NGM) ingredients:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Roth</td><td>5210.2</td><td>CAS-Nr. 9002-18-0</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Roth</td><td>3957</td><td>CAS-Nr. 7647-14-5</td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>BD</td><td>211699</td><td>Lot 4316614</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td>CAS-Nr. 10035-04-8</td></tr><tr><td>Cholesterol from lanolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F 26732 00050</td><td>CAS-Nr. 57-88-5</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Merck</td><td>1,058,861,000</td><td>CAS-Nr. 10034-99-8</td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>ACROS organics</td><td>271080025</td><td>CAS-Nr. 7778-77-0</td></tr><tr><td>6 cm petri dish</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>3.5 cm petri dish</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>M9 ingredients:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>ACROS organics</td><td>271080025</td><td>CAS-Nr. 7778-77-0</td></tr><tr><td>Sodium hydrogen phosphate heptahydrate (NaHPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390-500G-D</td><td>CAS-Nr. 7782-85-6</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Roth</td><td>3957</td><td>CAS-Nr. 7647-14-5</td></tr></tbody></table>

assaying predatory feeding behaviors in pristionchus and other nematodes

This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including Pristionchus pacificus display complex behaviors, the most striking of which is the predation of other nematode larvae. However, as these behaviors are absent in the model organism Caenorhabditis elegans, they have thus far only recently been described in detail along with the development of reliable behavioral assays 1. These predatory behaviors are dependent upon phenotypically plastic but fixed mouth morphs making the correct identification and categorization of these animals essential. In P. pacificus there are two mouth types, the stenostomatous and eurystomatous morphs 2, with only the wide mouthed eurystomatous containing an extra tooth and being capable of killing other nematode larvae. Through the isolation of an abundance of size matched prey larvae and subsequent exposure to predatory nematodes, assays including both "corpse assays" and "bite assays" on correctly identified mouth morph nematodes are possible. These assays provide a means to rapidly quantify predation success rates and provide a detailed behavioral analysis of individual nematodes engaged in predatory feeding activities. In addition, with the use of a high-speed camera, visualization of changes in pharyngeal activity including tooth and pumping dynamics are also possible.

<html> Después de la identificación con éxito de la metamorfosis boca apropiada en P. pacificus, claras diferencias entre los animales eurystomatous y stenostomatous se puede detectar (Figura 3) con sólo los animales eurystomatous que participan en matar comportamiento. En los animales stenostomatous este comportamiento parece ser suprimida por completo. Además, las diferencias en la actividad de los dientes y faríngea de bombeo de los animales eurystomatous en bacterias y presa (Figura 4 y Películas 2 y 3) también son evidentes. Mientras que la alimentación depredador, la velocidad de bombeo se reduce por debajo de la observada durante la alimentación de bacterias y movimiento de los dientes se detecta en una relación uno a uno con el bombeo de la faringe. Este es un indicador potencial de los mecanismos reguladores clave que modulan la respuesta conductual a diferentes dieta. s / ftp_upload / 54404 / 54404fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. P. pacificus tiene un dimorfismo Boca que influye Conducta Alimentaria. (A) La forma de la boca eurystomatous es capaz de depredación y tiene una abertura de boca ancha con una gran forma de garra del diente dorsal (de color rojo falsa) y (B) un gancho opuesto grande en forma de diente sub-ventral (falsa de color azul). (C) La forma de la boca stenostomatous sólo es capaz de alimentarse de bacterias y tiene una abertura de boca estrecha con una forma de pedernal diente dorsal (de color rojo falsa) y (D) sin el diente de sub-ventral (*). Normaski imágenes son 63X y barra de escala representa 10 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54404/54404fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2. Los ensayos de depredación. (A) P. pacificus muerde y mata a las larvas de otros nematodos tales como C. elegans. (B) Para los ensayos que pican, el número de bitesby depredadores (*) se puede observar el uso de un microscopio estereoscópico luz y la matanza éxito y la alimentación de los acontecimientos registrados también. Los cadáveres también son claramente visibles (círculos). (C) Para los ensayos de cadáveres, cadáveres de larvas (flechas) se pueden identificar fácilmente en comparación con larvas vivas. La barra de escala representa 1 mm de B y 150 micras de C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54404/54404fig3.jpg" /> Figura 3. Resultados de la mordedura y el cadáver Ensayos sobre C. elegans presa. (A) comportamiento de picadura sólo es evidente<html> en forma eurystomatous boca con este comportamiento no se muestra en los animales stenostomatous. Barra de error representa la desviación estándar de 10 repeticiones. (B) que coincide con ningún comportamiento de morder evidente a partir de animales stenostomatous, los ensayos de cadáveres también revelan canales solamente en placas de ensayo de animales eurystomatous. Barra de error representa la desviación estándar de 5 repeticiones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54404/54404fig4.jpg" /> Figura 4. Eurystomatous bombeo tarifas y Diente Movimiento durante la alimentación predatorios. Diente movimiento sólo se observa mientras que los animales eurystomatous se dedican a la alimentación de los depredadores. Esto también coincide con una reducción en el bombeo de la faringe. barra de error representa la desviación estándar de 10 repeticiones.<html> href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="película 1" src="/files/ftp_upload/54404/54404movie1.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/Movie_1_Killing_behaviour.mp4">Película 1. Observación del Comportamiento de Killing Bite Ensayo utilizando un microscopio estereoscópico de luz. (Haga clic derecho para descargar).</a> <img alt="película 2" src="/files/ftp_upload/54404/54404movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/Movie_2_HS_Camera_Killing.mp4">2. Cámara de película de alta velocidad de la película de P. pacificus matar C. elegans larvas. (Haga clic derecho para descargar).</a> ad / 54404 / 54404movie3.jpg &quot;/&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/Movie_3_HS_pumping_and_tooth.mp4">3. Película zoom de la cámara de alta velocidad de movimiento de los dientes durante la depredación. (Haga clic derecho para descargar).</a>

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Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes

Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth.

El ensayo de los comportamientos de alimentación depredadores en<em&gt; Pristionchus</em&gt; Y otros nematodos

This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including ...

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Research

JoVE Journal

Environment

Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes

9.7K vistas.  Max-Planck Institute for Developmental Biology. Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth. 

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Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to two families: Steinernematidae and Heterorhabditidae. Until now, more than 70 species have been described in the Steinernematidae and there are about 20 species in the Heterorhabditidae. The nematodes have a mutualistic partnership with Enterobacteriaceae bacteria and together they act as a potent insecticidal complex that kills a wide range of insect species.
Herein, we focus on the most common techniques considered for collecting EPN from soil. The second part of this presentation focuses on the insect-baiting technique, a widely used approach for the isolation of EPN from soil samples, and the modified White trap technique which is used for the recovery of these nematodes from infected insects. These methods and techniques are key steps for the successful establishment of EPN cultures in the laboratory and also form the basis for other bioassays that consider these nematodes as model organisms for research in other biological disciplines. The techniques shown in this presentation correspond to those performed and/or designed by members of S. P. Stock laboratory as well as those described by various authors.

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

Entomopathogenic nematodes are soil-inhabiting roundworms that parasitize a wide range of insects. We demonstrate sampling methods used for the isolation of these nematodes from the soil using two techniques: the insect baiting and the modified White trap, for the recovery of nematodes from soil samples and infected insect cadavers, respectively.

Muestreo de suelos y aislamiento de nematodos entomopatógenos (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

Investigación

Medio ambiente

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

Análisis Automatizado de un Ensayo de Preferencia Chemosensorial Basada en Población de Nematodo

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Comportamiento

Rapid Isolation of Wild Nematodes by Baermann Funnel

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild nematodes in their natural environments are valuable for understanding many aspects of biology, including the selective regimes in which distinctive genomic and phenotypic characters evolve, the genetic basis for complex trait variation, and the natural genetic diversity fundamental to all animal populations. This manuscript describes a simple and efficient method for extracting nematodes from their natural substrates, including rotting fruits, flowers, fungi, leaf litter, and soil. The Baermann funnel method, a classical nematology technique, selectively isolates active nematodes from their substrates. Because it recovers nearly all active worms from the sample, the Baermann funnel technique allows for the recovery of rare and slow-growing genotypes that co-occur with abundant and fast-growing genotypes, which might be missed in extraction methods that involve multiple generations of reproduction. The technique is also well suited to addressing metagenetic, population-genetic, and ecological questions. It captures the entire population in a sample simultaneously, allowing an unbiased view of the natural distribution of ages, sexes, and genotypes. The protocol allows for deployment at scale in the field, rapidly converting substrates into worm plates, and the authors have validated it through fieldwork on multiple continents.

This protocol outlines a method for efficiently extracting live nematodes from natural substrates in the field.

Aislamiento rápido de nematodos silvestres por Baermann Funnel

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild ...

Genética

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in cellular and mammalian models. Here, we describe detailed methods to perform stable isotopic profiling of intermediary metabolism and metabolic flux in the nematode, Caenorhabditis elegans. Methods are described for profiling whole worm free amino acids, labeled carbon dioxide, labeled organic acids, and labeled amino acids in animals exposed to stable isotopes either from early development on nematode growth media agar plates or beginning as young adults while exposed to various pharmacologic treatments in liquid culture. Free amino acids are quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) in whole worm aliquots extracted in 4% perchloric acid. Universally labeled 13C-glucose or 1,6-13C2-glucose is utilized as the stable isotopic precursor whose labeled carbon is traced by mass spectrometry in carbon dioxide (both atmospheric and dissolved) as well as in metabolites indicative of flux through glycolysis, pyruvate metabolism, and the tricarboxylic acid cycle. Representative results are included to demonstrate effects of isotope exposure time, various bacterial clearing protocols, and alternative worm disruption methods in wild-type nematodes, as well as the relative extent of isotopic incorporation in mitochondrial complex III mutant worms (isp-1(qm150)) relative to wild-type worms. Application of stable isotopic profiling in living nematodes provides a novel capacity to investigate at the whole animal level real-time metabolic alterations that are caused by individual genetic disorders and/or pharmacologic therapies.

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling by gas chromatography mass spectrometric analysis of intermediary metabolic flux is described in the nematode, Caenorhabditis elegans. Methods are detailed for assessing isotopic enrichment in carbon dioxide, organic acids, and amino acids following isotope exposure either during development on agar plates or during adulthood in liquid culture.

Perfiles de isótopos estables de flujo intermediarios metabólicos en fase de desarrollo y de Adultos Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Biología

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their locomotory patterns upon detection of diverse environmental stimuli and can modulate their suite of behavioral responses in response to starvation conditions. Nematodes typically exhibit a decreased aversive response when removed from a food source for over 30 min. Observation of behavioral changes in response to a changing nutritional status can provide insight into the mechanisms that regulate the transition from a well-fed to starved state.
We have developed an assay that measures a nematode&#39;s ability to cross an aversive barrier (i.e. copper) then reach a food source over a prolonged period of time. This protocol builds upon previous work by integrating multiple variables in a manner that allows for continued data collection as the organisms shift towards an increasingly starved condition. Moreover, this assay permits an increased sample size so that larger populations of nematodes can be simultaneously evaluated.
Organisms defective for the ability to detect or respond to copper immediately cross the chemical barrier, while wild type nematodes are initially repelled. As wild type worms are increasingly starved, they begin to cross the barrier and reach the food source. We designed this assay to evaluate a mutant that is incapable of responding to diverse environmental cues, including food sensation or detection of aversive chemicals. When evaluated via this protocol, the defective organisms immediately crossed the barrier, but were also incapable of detecting a food source. Hence, these mutants repeatedly cross the chemical barrier despite temporarily reaching a food source. This assay can straightforwardly test populations of worms to evaluate potential pathway defects related to aversion and starvation.

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Here, we present a Caenorhabditis elegans-specific assay designed to evaluate changes in copper aversion behavior and the ability to locate a common food source, as the organism progresses from a well-fed to starved nutritional state.

UN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ensayo de aversión al cobre basado en el estado nutricional

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Neurociencias

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. To improve the mating efficiency of B. Xylophilus and to increase the chances of mating observation, virgin adults were cultured and used for the investigation. Eggs were obtained by keeping the nematodes in water and allowing the females to lay eggs for 10 min. The second-stage juveniles (J2) were synchronized by incubating the eggs for 24 h at 25 &#176;C in the dark, and the early J4 were obtained by culturing the J2 with grey mold, Botrytis cinerea, for another 52 h. At this time point, most J4 nematodes could be clearly distinguished as being male or female using their genital morphology. The male and female J4 were collected and cultured separately in two different Petri dishes for 24 h to get virgin adult nematodes. A virgin male and a virgin female were paired in a drop of water in the well of a concave slide. The mating behavior was filmed with a video recorder under a stereomicroscope. The whole period of the mating process was 82.8 &#177;3.91 min (mean &#177;SE) and could be divided into 4 different phases: searching, contacting, copulating, and lingering. The mean minutes of duration were 21.8 &#177; 2.0, 28.0 &#177; 1.9, 25.8 &#177; 0.7 and 7.2 &#177; 0.5, respectively. Eleven sub-behaviors were described: cruising, approaching, encountering, touching, hooping, locating, attaching, ejaculating, separating, quiescence, and roaming. Interestingly, obvious intra-sexual competition was observed when one female was grouped with 3 males or one male with 3 females. This protocol is useful and valuable, not only in investigating the mating behavior of B. xylophilus, but also in acting as a reference for ethological studies of other nematodes.

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

La observación y cuantificación de la conducta de apareamiento en el nematodo del pino,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Protocolo de laboratorio para análisis genéticos de contenido intestinal de macroinvertebrados acuáticos con grupo-específica rDNA cartillas

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative sparsity of information about C. elegans in its natural context comes from the challenges involved in the identification of the small nematode in nature. Despite these challenges, an increasing focus on the ecology of C. elegans has caused a wealth of new information regarding its life outside of the laboratory. The intensified search for C. elegans in nature has contributed to the discovery of many new Caenorhabditis species and revealed that congeneric nematodes frequently cohabitate in the wild, where they feed on microbial blooms associated with rotting plant material. The identification of new species has also revealed that the androdioecious mating system of males and self-fertilizing hermaphrodites has evolved three times independently within Caenorhabditis. The other two selfing species, C. briggsae and C. tropicalis, share the experimental advantages of C. elegans and have enabled comparative studies into the mechanistic basis of important traits, including self-fertilization. Despite these advances, much remains to be learned about the ecology and natural diversity of these important species. For example, we still lack functional information for many of their genes, which might only be attained through an understanding of their natural ecology. To facilitate ecological research of selfing Caenorhabditis nematodes, we developed a highly scalable method to collect nematodes from the wild. Our method makes use of mobile data collection platforms, cloud-based databases, and the R software environment to enhance researchers&#39; ability to collect nematodes from the wild, record associated ecological data, and identify wild nematodes using molecular barcodes.

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

This protocol can be used to perform large-scale ecological surveys of selfing Caenorhabditis nematodes. The primary advantage of this method is the efficient organization and analysis of ecological and molecular data associated with the nematodes collected from nature.

Un enfoque altamente escalable para realizar estudios ecológicos de los nematodos de Caenorhabditis Selfing

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant matter, especially rotten fruits like apples or on compost heaps. It is also associated with certain invertebrate hosts such as slugs and woodlice. These habitats are rich in microbes, which serve as food for C. elegans and which can also persistently colonize the nematode gut. To date, the exact diversity and consistency of the native C. elegans microbiota across habitats and geographic locations is not fully understood. Here, we describe a suitable approach for isolating C. elegans from nature and characterizing the microbiota of worms. Nematodes can be easily isolated from compost material, rotting apples, slugs, or attracted by placing apples on compost heaps. The prime time for finding C. elegans in the Northern Hemisphere is from September until November. Worms can be washed out of collected substrate material by immersing the substrate in buffer solution, followed by the collection of nematodes and their transfer onto nematode growth medium or PCR buffer for subsequent analysis. We further illustrate how the samples can be used to isolate and purify the worm-associated microorganisms and to process worms for 16S ribosomal RNA analysis of microbiota community composition. Overall, the described methods may stimulate new research on the characterization of the C. elegans microbiota across habitats and geographic locations, thereby helping to obtain a comprehensive understanding of the diversity and stability of the nematode's microbiota as a basis for future functional research.

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is one of the main model species in biology, yet almost all research is performed in the absence of its naturally associated microbes. The methods described here will help to improve our understanding of the diversity of associated microbes as a basis for future functional C. elegans research.

Aislamiento y caracterización de la microbiota natural del nematodo modelo Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Investigación de comportamientos colectivos en nematodos utilizando medio de agar para alimentos para perros

The Large-Scale Cultivation of Nematodes to Study Their Collective Behaviors

Animals exhibit dynamic collective behaviors, as observed in flocks of birds, schools of fish, and crowds of humans. The collective behaviors of animals have been investigated in the fields of both biology and physics. In the laboratory, researchers have used various model animals such as the fruit fly and zebrafish for approximately a century, but it has remained a major challenge to study large-scale complex collective behavior orchestrated by these genetically tractable model animals. This paper presents a protocol to create an experimental system of collective behaviors in Caenorhabditis elegans. The propagated worms climb on the lid of the Petri plate and show collective swarming behavior. The system also controls worm interactions and behaviors by changing the humidity and light stimulation. This system allows us to examine the mechanisms underlying collective behaviors by changing environmental conditions and examining the effects of individual-level locomotion on collective behaviors using mutants. Thus, the system is useful for future research in both physics and biology.

Autor destacado: Análisis colectivo del comportamiento del nematodo, Caenorhabditis elegans

Here, a system is reported for studying the collective behaviors of nematodes by culturing them in bulk using dog food agar medium. This system allows researchers to propagate large numbers of dauer worms and can be applied to Caenorhabditis elegans and other related species.

El cultivo a gran escala de nematodos para estudiar sus comportamientos colectivos

Animals exhibit dynamic collective behaviors, as observed in flocks of birds, schools of fish, and crowds of humans. The collective behaviors of animals ...

El ensayo de los comportamientos de alimentación depredadores en

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