Name: development of a more sensitive and specific chromogenic agar medium for the detection of vibrio parahaemolyticus and other vibrio species
Uploaded: 2016-11-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
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Damos las gracias a M. Channey, E. Chau, y K. Tomas por su colaboración en el proyecto. El Proyecto de abastecimiento fueron financiados parcialmente por California Polytechnic State University.

1. Medios y cultivo de cepas microbianas NOTA: Use técnicas asépticas en todos los experimentos. Utilizar materiales estériles. Esterilizar todos los recipientes, herramientas y reactivos antes de su uso. Autoclave todos los materiales de desecho antes de su eliminación, ya que se consideran de riesgo biológico. temperatura del autoclave y el tiempo de combinación es ≥121 ° C x ≥15 min para todos los procedimientos siguientes. <ol><li> Para hacer ~ 1 l de agar tríptico de soja (TSA), primero agregar 1 L de agua desionizada en un matraz de 2 litros Erlenmeyer que contiene una barra de agitación magnética. Utilice un matraz que es al menos dos veces mayor que el volumen final. Añadir 30 g de polvo de caldo de soja tríptico y 20 g de agar gránulos en el matraz. NOTA: El uso agar al 2% en lugar del 1,5% para limitar el enjambre de algunas especies de Vibrio. <ol><li> Mezclar bien activando el agitador. Mientras se agita, encender la calefacción a hervir la mezcla. Retirar el matraz de la estufa tan pronto como la mezcla comience a hervir. Cubra THe matraz con un papel de aluminio. Tape el papel de aluminio para fijarlo al matraz antes de autoclave. </li><li> Para hacer caldo de soja tríptico (TSB), omita el agar de la receta en el paso 1.1. NOTA: Puede utilizar botellas en lugar de un matraz Erlenmeyer. </li><li> Para hacer agar de soja tríptico suplementado con cloruro de sodio 2% o NaCl (TSAS), añadir 20 g de NaCl en la mezcla antes de la agitación y el calentamiento. Para hacer caldo de soja tríptico suplementado con 2% de NaCl (OSP), omitir el agar, añadir 20 g de NaCl en la mezcla antes de la agitación y el calentamiento. </li></ol></li><li> Para hacer agar de infusión de cerebro y corazón (BHI), suspender 37 g de polvo BHI y 15 g de gránulos de agar en 1 L de agua purificada. Calentar con agitación para disolver el polvo. Autoclave. Omitir el agar para hacer caldo BHI. </li><li> Para hacer agar TCBS, suspender 89 g del polvo TCBS en 1 L de agua purificada. Calentar con agitación y se deja hervir durante 1 minuto para disolver completamente el polvo. No esterilizar en autoclave. </li><li> Para todos los medios de agar, enfriar el agar caliente a 45-50 ° C en un baño de agua. Organizar placas de Petri vacías en pilas de cinco a seis placas. A partir de la parte inferior de la pila, se vierte el agar fundido en cada placa de Petri para llegar hasta la mitad. Cierre la tapa de la placa de Petri después de verter. Dejar que el agar se solidifique al permitir que las placas reposar a temperatura ambiente. <ol><li> Utilice las placas de agar al día siguiente o después de 12 horas. Almacenar las placas utilizadas en un refrigerador hasta por dos semanas. Antes de usar, eliminar los platos de la nevera y se equilibre a temperatura ambiente durante al menos 15 min. NOTA: agar de un litro hace ~ 45 placas de agar. Permitir a las placas de agar se seque lo suficiente en el día de la preparación, y se equilibran a temperatura ambiente después de almacenamiento en frío para reducir eficazmente la propagación de las colonias. </li></ol></li><li> Obtener placas de agar chocolate y cromogénico y equilibrar a temperatura ambiente antes de cada experimento. </li><li> Subcultura de los 54 cepas microbianas que se muestran en la Tabla 1 da cada pocosys. <ol><li> Use un asa de siembra estéril para transferir las culturas a partir de una solución madre congelada o un lote anterior a los medios no selectivos como el BHI, TSB / TSA o agar chocolate. Crecer halófilas Vibrio spp. en los OSP / TSAS. </li><li> Para comprobar la pureza de la cultura, racha todas las cepas en un patrón que permita la observación de colonias aisladas. Por ejemplo, utilizar un patrón de rayas de tres fases para diluir una gran cantidad de bacterias a menor cantidad, con el tiempo produciendo colonias aisladas. </li></ol></li><li> Incubar las placas al revés a 35-37 ° C durante un máximo de 48 horas. Para Campylobacter spp., Incubar los tubos o placas en un frasco de tapa cerrado que contiene una bolsa de gas para producir un ambiente microaerofílico. Observe morfología de las colonias después de la incubación. Los cultivos puros deben producir colonias que exhiben morfología de la colonia similar. NOTA: Incubar todas las placas al revés para evitar que las gotas de agua condensadas formadas en la parte inferior de la tapa caiga sobre la colOnies. </li></ol> 2. Las especies Determinación por PCR <ol><li> Llevar a cabo TLH-PCR para confirmar la identidad de V. cepas parahaemolyticus. Use cebadores TLH -F (5 &#39;AAA GCG GAT TAT GCA GCA GAA CTG 3&#39;) y -R tlh (5 &#39;TCG ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC 3&#39;) para amplificar un fragmento de 450 pb del gen de la hemolisina termolábil 20 . <ol><li> Use un asa de siembra estéril para transferir algunas colonias aisladas de cada V. parahaemolyticus cepa de TSAS a 5 ml de TSB. Incubar a 35-37 ° C durante 16-24 horas. </li><li> culturas centrifugar a 14.000 xg durante 1 min. Eliminar el sobrenadante y lavar el precipitado dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Hervir la suspensión durante 3 min para dar lisado celular. NOTA: V. parahaemolyticus es fácil de ser lisadas. Por lo tanto no se requiere reactivo de lisis. También es posible utilizar un poco de colonia directamente como la plantilla. </li><li> Realizar PCR en una reacción de 25 l-volumen. Preparar una mezcla de reacción que contiene una concentración final de 1 x tampón de PCR, 1.5 mM MgCl2, 100 mM de cada dNTP, 1 mM de cada cebador, 1 U de Taq polimerasa y 1 l de lisado celular. Después de la preincubación a 94 ° C durante 5 min, ejecute 35 ciclos de amplificación de 94 ° C durante 30 seg, 58 ° C durante 30 seg, y 72 ° C durante 60 seg 21. </li><li> alícuotas de carga de amplicón 5-l en 1,5% geles de agarosa. Encienda la fuente de alimentación para iniciar la electroforesis. Visualizar la presencia o ausencia de amplicones bajo iluminación UV después de la tinción con bromuro de etidio. </li></ol></li></ol> 3. Crecimiento en medios selectivos y diferenciales <ol><li> Dos a cuatro días antes del experimento, racha todas las cepas microbianas que se muestran en la Tabla 1 en medio no selectivo (TSAS, BHI o agar chocolate) para el aislamiento de colonias. Incubar las placas a 35-37 ° C durante 48 horas. Comprobar la pureza de los cultivos mediante la observación de morfología de las colonias después de la incubación. Los cultivos puros deben producir colonias que exhiben morfología de la colonia similar. </li><li> Transferir algunas colonias aisladas a partir del paso 3.1 en 5 ml de caldo. Incubar los tubos a 35-37 ° C durante 16-24 horas. Nota: El uso colonias jóvenes, que son menos de cuatro días de edad, para preparar cultivos de una noche en todos los experimentos. </li><li> Racha de un asa de siembra de cultivos de una noche en medios selectivos y diferenciales (TCBS y agar cromogénico) para el aislamiento de colonias. Incubar las placas a 35-37 ° C durante un máximo de 96 horas. </li><li> Registrar el crecimiento global de todas las cepas mediante el examen tanto de la densidad de cultivo en el plato y el tamaño de las colonias aisladas. Registre el color de las colonias bajo la luz ambiental y / o UV. Tenga en cuenta otras características de la colonia aislada, como la elevación, el margen y la forma. </li></ol> 4. Ensayo de recuperación <ol><li> Seleccionar un subconjunto representativo de V. cepas parahaemolyticus (n = 14) que abarcan diferentes serotipos y orígenes de aislamiento <shasta&gt; 22. Inocular cultivos jóvenes de las placas en 5 ml de TSB. Incubar los tubos a 35-37 ° C durante 16-24 horas. </li><li> Llevar a cabo un método de recuento en placa estándar de los cultivos de una noche como se describe a continuación. <ol><li> Vórtice para mezclar bien los cultivos de la noche. Hacer una 10 veces o dilución 10 -1 mediante la transferencia de 100 l de cultivo de una noche en un tubo que contiene 900 l de PBS. Vórtice para mezclar bien. </li><li> Utilizar una punta de pipeta para transferir 100 l del tubo de dilución 10 -1 a otro tubo que contiene 900 l de PBS. Vórtice para mezclar bien. Esto constituye dilución 10 -2. Repita el proceso de forma secuencial para obtener una dilución 10 -7. </li><li> El uso de los 10 -4 a 10 -7 tubos de dilución, la placa de 100 l cada uno de los TCBS y TSAS placas de agar cromogénicos,. NOTA: El factor de dilución (df) de la placa se convierte en 10 -5-10 -8, respectivamente. </li><li> Difundir las alícuotas de manera uniforme en tél agar superficie. NOTA: Es muy bien utilizar el mismo esparcidor por cepa en el mismo medio, siempre que la alícuota más diluida se extiende primero (es decir, de 10 -8-10 -5). No utilice el mismo esparcidor para diferentes medios. </li><li> Incubar las placas a 35-37 ° C durante un máximo de 96 horas. Recuento de las colonias en las placas. Ignorar placas de apoyo colonias que son demasiado numerosos para contar (TNTC) o menor que 25. Calcular CFU / ml de acuerdo con lo siguiente: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/54493/54493eq1.jpg" /> Dónde N = el número de células en el tubo sin diluir, expresado como UFC / ml o CFU / g C = el número total de colonias contadas en las placas que dan 25-300 colonias 1 = el número de placa (s) donde las colonias contadas son de la más baja df n2 = número de placa (s) donde son colonias contadas a partir de la dilución de 10 veces subsecuente ref = factor de dilución más baja (es decir, la dilución más concentrada) </li></ol></li><li> Comparar CFU / ml entre los diferentes medios de comunicación. Utilice UFC / ml en TSAS como el 100%, se calcula el% de recuperación de V. parahaemolyticus cultiva en el agar cromogénico y TCBS. </li></ol> Ensayo 5. Competencia <ol><li> Elegir un subconjunto de cepas que muestran diferentes morfologías de colonias en el agar cromogénico y TCBS. NOTA: De esta manera, será posible contar las colonias se originaron de V. Sólo parahaemolyticus, a pesar de la presencia de otras especies en el inóculo. <ol><li> Elija una V. parahaemolyticus cepa que produce las colonias de color turquesa y cian esperados en TCBS y el agar cromogénico, respectivamente. </li><li> Elija un no V. parahaemolyticus y Vibrio una especie no que no crecen en cualquiera de estos medios, o tienen diferentes color de la colonia. NOTA: Por ejemplo, V. metschnikovii crece muy débilmente on TCBS y no creció en el agar cromogénico. Shigella sonnei no crece en TCBS pero produce colonias de color magenta en el agar cromogénico. </li></ol></li><li> Después de la selección de las cepas anteriores, preparar caldos de cultivo durante la noche utilizando colonias aisladas cultivadas en medios no selectivos. <ol><li> Hacer cultivos de una noche de V. parahaemolyticus y V. metschnikovii mediante la transferencia de algunas colonias aisladas de TSAS a 5 ml de TSB. Incubar a 35-37 ° C durante 16-24 horas. </li><li> Hacer cultivos de una noche de Shigella sonnei mediante la transferencia de unas pocas colonias aisladas de agar BHI a 5 ml de caldo BHI. Incubar a 35-37 ° C durante 16-24 horas. </li></ol></li><li> Para cada cepa, lleve a cabo una serie de dilución similar a los pasos 4.2.1 y 4.2.2. Placa de diluciones apropiadas sobre TSAS o BHI para determinar CFU / ml de cultivo de una noche, utilizando la ecuación de muestra en el paso 4.2.5. NOTA: Por lo general, 100 l de la dilución 10 -5 a la 10 -7tubos de obras para la mayoría de las culturas. Utilice los valores de UFC / ml para respaldar calcular la cantidad exacta de las células utilizadas en el siguiente paso. Los valores de UFC / ml calculados se obtienen después de la incubación, aunque los pasos siguientes se llevan a cabo en la misma fecha que la Etapa 5.3. </li><li> El uso de los cultivos de la noche y los tubos de dilución en los pasos 5.2 y 5.3, mezclar diferentes cantidades de una V. cepa parahaemolyticus y un no V. especies parahaemolyticus. Por ejemplo, la mezcla de 500 l de la tubo de dilución 10 -5 de V. parahaemolyticus con 500 l de los cultivos de una noche de V. metschnikovii. NOTA: Esta mezcla simula alto fondo microflora. Para simular un fondo bajo microflora, mezclar 500 l cada uno del tubo de dilución 10 -5 de ambas especies. </li><li> Spread 100 l de la mezcla de cada uno de los TCBS y TSAS placas de agar cromogénicos,. </li><li> Después de la incubación a 35-37 ° C durante un máximo de 96 horas, contar las colonias de V. parahaemolyticus y la no V. especies parahaemolyticus con base en su diferencia en el crecimiento y la morfología de las colonias en el agar cromogénico y TCBS. NOTA: Por ejemplo, si la no V. parahaemolyticus especies no crecen en el agar cromogénico y TCBS, todas las colonias serán de V. parahaemolyticus. Si la no V. parahaemolyticus especie crece en ambos medios, sólo las colonias de color turquesa en colonias TCBS y cian en agar cromogénico serán de V. parahaemolyticus. La no V. especies parahaemolyticus pueden o no pueden exhibir la morfología de colonia similar a V. parahaemolyticus en TSAS. <ol><li> Si la no V. especies parahaemolyticus crece de manera similar a V. parahaemolyticus en este medio no selectivo, divida el recuento de colonias por dos para obtener el número de V. parahaemolyticus solamente. Comparar el recuento de colonias real con la frecuencia esperada derivada del Paso 5.3. </li></ol></li></ol> 6. EFFECTS de Oyster Los homogeneizados <ol><li> Pesar ≥50 g de carne de molusco ≥12 moluscos incluida la carne y el licor. <ol><li> Añadir la misma cantidad de PBS a la carne de la ostra y el licor. Mezclar la mezcla a alta velocidad durante 90 seg. Esto constituye el 2 -1 diluida homogeneizado de ostras. </li><li> Añadir 100 g de 2 -1 homogeneizado ostra diluido a 400 g de PBS. Utilice una escala para medir el peso, no por volumen. Mezclar la mezcla a alta velocidad durante 1 min. Autoclave el homogeneizado de ostras. NOTA: Este será el homogeneizado de ostras utilizado para clavar. </li></ol></li><li> Repetir el ensayo de recuperación (Paso 4) en presencia de homogeneizado de ostras. <ol><li> Después de los 500 g de ostras homogeneizado se enfría, se añaden 100 l de V. parahaemolyticus cultivos de una noche cultivados en TSB a ella. Determinar la cantidad real de V. parahaemolyticus células en el inóculo mediante la realización de los procedimientos de recuento en placa estándar descrito en el paso 4.2. </li></ol></li><li> Repscomer el ensayo de la competencia (Paso 5) en presencia de homogeneizado de ostras. <ol><li> Después de los 500 g de ostras homogeneizado se enfría, se añaden 100 l cada uno de los cultivos de una noche de V. parahaemolyticus y V. no parahaemolyticus a ella. Determinar la cantidad real de bacterias Las células en el inóculo mediante la realización de los procedimientos de recuento en placa estándar descrito en el paso 4.2 </li></ol></li><li> Mezclar las células bacterianas con homogeneizado de ostras bien mediante el uso de un homogeneizador. NOTA: Después de mezclar, el homogeneizado de ostra que contiene las células añadidas intencionadamente se llama claveteado homogeneizado de ostras. </li><li> Hacer diluciones del homogeneizado de ostras de púas para obtener 10 -1 a 10 -3 tubos de dilución de acuerdo con los procedimientos descritos en la etapa 4.2.2. Spread 100 l de cada dilución en el cromogénico TCBS y TSAS agar,. Incubar las placas a 35-37 ° C durante un máximo de 96 horas. </li><li> Comparar el recuento de colonias en agar cromogénico real y TCBS con el exse sospecha vienen del recuento de colonias deduce de Pasos 6.2.1 y 6.3.1. NOTA: Por ejemplo, si un tubo de V. parahaemolyticus cultivo durante la noche contiene 10 8 CFU / ml, un inóculo de 100 l significa que 10 7 células se añaden a la 500-g de homogeneizado de ostras, produciendo 5 x 10 4 células / g. Después de la dilución y de las planchas, teniendo la placa df = 10 -2 debería producir 500 colonias; mientras que el tener df = 10 -3 debería producir 50 colonias. Estos son los recuentos de colonias esperados. </li></ol>

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D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+thiosulphate-citrate-bile+salt+sucrose+(TCBS)+agar+and+CHROMagar+Vibrio+for+isolating+Vibrio+parahaemolyticus.">Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus.</a> Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).</li><li>Canizalez-Roman, A., Flores-Villase&#241;or, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Le&#242;n-Sicairos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+a+chromogenic+agar+medium-PCR+protocol+with+a+conventional+method+for+isolation+of+Vibrio+parahaemolyticus+strains+from+environmental+and+clinical+samples.">Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples.</a> Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).</li><li>Kriem, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Vibrio+spp.+in+raw+shrimps+(Parapenaeus+longirostris)+and+performance+of+a+chromogenic+medium+for+the+isolation+of+Vibrio+strains.">Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains.</a> Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).</li><li>Food Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+guidance+on+reporting+results+from+studies+evaluating+diagnostic+tests.">Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests.</a> http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).</li><li>Burd, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+laboratory-developed+molecular+assays+for+infectious+diseases.">Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases.</a> Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).</li></ol>

Some media were generously provided by Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA. Thorsen conducted this study while a student at California Polytechnic State University. He is currently an employee of Hardy Diagnostics.

Este estudio se centra en el desarrollo de medios de cultivo y evaluación. Convencionalmente, el TCBS es selectivo y diferencial medio utilizado para el aislamiento y la detección de V. parahaemolyticus, V. cholerae y V. 12 vulnificus. Sin embargo, se ha informado de limitaciones para este medio, tales como la incapacidad para diferenciar V. cholerae de otras especies de Vibrio. La sacarosa y el indicador de pH son los agentes de diferenciación de TCBS. Por lo tanto, la producción de ácido por fermentador de sacarosa causa el cambio de color del medio. La coloración del medio es un inconveniente de TCBS, ya que puede oscurecer la observación de la morfología de colonia. El medio cromogénico recién desarrollado utiliza alto pH y la salinidad para suprimir el crecimiento de especies no Vibrio se encuentran en muchas muestras marinas. El nuevo medio cromogénico tiene un pH final de 8,6 ± 0,2. Por litro de agua desionizada, se compone de 10 g de peptona, 10 g de la mezcla de sales marinas, 10 g de bilis de buey, 10 g de sodiotiosulfato, 5 g de extracto de levadura, 5 g de citrato de sodio, 2,2 g de carbonato de sodio, 2 g de lactosa, 0,5 g de piruvato de sodio, 0,3 g de una mezcla cromogénico y 15 g de agar. La mezcla cromogénico permite la diferenciación entre las especies de Vibrio. según sus capacidades diferenciales para producir ciertas enzimas. En lugar de alterar el color del medio de agar TCBS, diferente Vibrio spp. exhibiría diferente color de las colonias en el nuevo medio cromogénico. En comparación, un medio cromogénico disponibles comercialmente contiene 15 g de agar, 8 g de peptona y extracto de levadura, 51,4 g de sales, 0,3 g de una mezcla cromogénico y un pH final de 9,0 ± 0,2. La robustez de una evaluación del ensayo depende del tamaño de la muestra. Dado que este estudio hace hincapié en la eficacia del nuevo medio cromogénico para aislar y detectar V. parahaemolyticus, es importante para acumular muchos diversa V. cepas parahaemolyticus. Estudios previos que comparan y TCBSnuevos medios de cultivo a menudo implicaba muestras ambientales o de alimentos que contienen tipos y la cantidad de microorganismos desconocidos 23,24,25,26. Varias colonias por muestra se aislaron embargo, la naturaleza clonal de los aislamientos fue a menudo indeterminado. Idealmente, las diferentes cepas deben ser probados en el desarrollo del ensayo de otro modo la precisión del ensayo se infla. Identidad de la cepa se puede establecer mediante métodos de tipificación convencionales, tales como electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) o secuenciación de múltiples locus. V. cepas parahaemolyticus en este estudio se caracterizaron previamente por ribotipaje y PFGE 19. Durante el desarrollo del ensayo, la sensibilidad, la especificidad y límite de detección son algunos de los factores clave que deben ser investigados. La sensibilidad, también conocida como la precisión o la sensibilidad de diagnóstico, es el acuerdo positivo por ciento entre los métodos de referencia y de prueba. La especificidad, también conocido como la precisión o especificidad de diagnóstico, es el porcentaje negativo una<html> Gréement entre los métodos de referencia y de prueba. En este estudio, se utilizó el método basado en la PCR como método de referencia debido a que los resultados fueron verificados entre los diferentes grupos. TCBS y los medios cromogénicos eran los métodos de prueba. Para determinar la sensibilidad, los resultados de la V. Se utilizaron cepas parahaemolyticus; es decir, sensibilidad = 100% x verdaderos positivos / (verdaderos positivos + falsos negativos). Por otra parte, los resultados de la no V. Se utilizaron cepas parahaemolyticus para determinar la especificidad; y por lo tanto, especificidad = 100% x Verdadero Negativo / (verdaderos negativos + falsos positivos). Para proporcionar resultados de especificidad más fiable, no V. parahaemolyticus cepas deben ser aislados de un entorno donde se llevará a cabo el muestreo. Nuestros cálculos de sensibilidad y especificidad se basan en documentos escritos por el gobierno de 27 años, el mundo académico y la organización científica 28 29 sobre un tema relacionado con el desarrollo del ensayo y validación. nt &quot;&gt; En base a los resultados, el medio cromogénico mostró un mejor rendimiento que TCBS en la identificación de V. parahaemolyticus. El acuerdo global por ciento entre el método de referencia y medio cromogénico es del 94,4%, en comparación con el 77,8% entre el método de referencia y TCBS. la sensibilidad y la especificidad del medio cromogénico son 90,9% y 96,9% respectivamente, que son mayores que las de TCBS (86,4% y 71,9%, respectivamente). estudios previos que evalúan otros medios cromogénicos para la detección de V. parahaemolyticus encontraron que las sensibilidades oscilaron a partir 85 a un 88%, mientras que las especificidades variaron de 94 a 95% 23,24,25. sin embargo, estos estudios no utilizan el mismo método de cálculo que nuestro estudio. Además, a veces utilizan un método de referencia diferente o se combinaron los resultados de ambos bioquímica analiza y medio cromogénico como un método de prueba. como resultado, es difícil comparar directamente los resultados de estos estudios previos. V. parahaemolyticus, el agar cromogénico utilizado en este estudio también podría diferenciar más especies de Vibrio que TCBS debido a la inclusión de una mezcla cromogénico en la fórmula medio, produciendo múltiples colores. Aunque no fue el foco de este estudio para detectar V. cholerae y V. vulnificus, vale la pena señalar que las colonias magenta exhibidos por estas especies pueden diferenciarse adicionalmente por fluorescencia bajo UV. Una limitación de utilizar el agar cromogénico para la detección de V. cholerae y V. vulnificus es su aparente baja recuperación de estas especies. Para sortear este problema, una etapa de enriquecimiento debe ser incluido. Otra posible limitación del agar cromogénico es su vida útil más corta que TCBS. Es necesaria la optimización continua de este nuevo medio para mantener el pH durante el almacenamiento. A pesar de la popularidad de las técnicas moleculares, Métodos de cultivo a dependiendo siguen siendo valiosos ya que a menudo son menos costosos y tienen un mejor límite de detección. Estos métodos de cultivo pueden ser utilizados como una herramienta de detección. Por el contrario, pueden ser utilizados para confirmar la identidad y la viabilidad de los microorganismos siguientes análisis moleculares. Para enumerar las bacterias a través de un enfoque de cultura-función, recuento de placa estándar es reconocido como el método estándar. La ecuación muestra en el paso 4.2.5 es una forma más exacta para determinar CFU / g o CFU / ml de un promedio de las UFC de diferentes factores de dilución. Es importante tener en cuenta que todos los diluyentes y los medios de comunicación a través de los procedimientos deben contener sal suficiente para mantener la viabilidad de las bacterias halófilas tales como V. parahaemolyticus. La temperatura de incubación y el medio ambiente deben ser óptimas para el crecimiento bacteriano. El medio cromogénico está diseñado para detectar especies de Vibrio que son importantes patógenos humanos. Por lo tanto, más estudios deben llevarse a cabo para DETERMIne su eficacia para detectar otras especies de Vibrio ambientales que no son médicamente relevante. En futuras aplicaciones, el nuevo agar cromogénico puede ser incorporado en las pruebas de rutina de muestras ambientales para V. parahaemolyticus. Esto se puede hacer por siembra directa de muestras en el agar cromogénico para detectar la presencia de un presunto V. parahaemolyticus. El agar cromogénico también se puede utilizar para enumerar V. parahaemolyticus siguientes diluciones. La cuantificación también se puede estimar mediante la realización de un método de Número Más Probable utilizando caldo de enriquecimiento, seguido de rayas en el agar cromogénico para la confirmación.

Como miembro del género Vibrio, V. parahaemolyticus es una bacteria Gram-negativas, no formadoras de esporas, curvada, en forma de barra. Se presenta una alta movilidad en ambos ambientes líquidos y semisólidos. La mayoría V. parahaemolyticus cepas no son patógenos para los seres humanos, sin embargo, los subtipos patógenos han causado epidemias y pandemias, por lo tanto, esta especie se considera que es un importante patógeno de transmisión alimentaria en muchos países 1,2. La incidencia de la infección por Vibrio en los EE.UU. ha mostrado una tendencia al alza desde el año 2000 3. Entre Vibrio spp., V. parahaemolyticus es la especie más frecuentemente reportado que causan enfermedades en los EE.UU. 4,5. Otras especies clínicamente relevantes incluyen V. Alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, etc. Un pequeño porcentaje de las enfermedades es causada por múltiples especies simultáneamente. V. parahaemolyticus es una i naturalesnhabitant de agua marina y, por tanto, ampliamente distribuido en aguas marinas en todo el mundo, incluyendo los estuarios. La especie fue descubierta en 1950 después de un brote de intoxicación alimentaria en Japón. En los EE.UU., la especie fue aislada por primera vez en el agua de mar, sedimentos y moluscos en la región de Puget Sound 6,7. Filtradores en los hábitats marinos, como los moluscos bivalvos, pueden albergar V. parahaemolyticus como parte de su flora natural 8. Como tal, V. infecciones parahaemolyticus en humanos a menudo están relacionados con el consumo de mariscos contaminados, especialmente los mariscos crudos o poco cocidos. Una ruta menos común de entrada se produce cuando herida abierta se expone al agua del mar, lo que lleva a una infección cutánea. La mayoría V. cepas parahaemolyticus no causan enfermedad en humanos, sin embargo, ciertos subtipos que albergan los factores de virulencia como hemolisina directa termoestable (TDH) son patógenas. Los síntomas más frecuentes de transmisión alimentaria V. infección son parahaemolyticusdiarrea y dolor abdominal, seguido de náuseas, vómitos y fiebre. También se informa de dolor de cabeza y escalofríos. El período de incubación promedio es de 15 horas, pero puede ser de hasta 96 horas después del consumo de una cantidad suficiente de cepas patógenas 9. La enfermedad dura de dos a tres días. Los síntomas de la gastroenteritis causada por V. parahaemolyticus son en gran medida auto-limitante y, por tanto, un tratamiento especial no es necesario. Los casos leves de gastroenteritis pueden ser tratados eficazmente mediante rehidratación oral. Más enfermedades graves se pueden tratar con antibióticos tales como la tetraciclina o la ciprofloxacina 10. La tasa de mortalidad es de alrededor del 2% de los casos de gastroenteritis, pero puede ser tan alta como 29% para aquellos que desarrollan infección del torrente sanguíneo o septicemia. Cualquier persona que consume mariscos o tiene una herida abierta expuesta al agua de mar está en riesgo de V. infección parahaemolyticus. La forma más grave de enfermedades, septicemia que amenaza la vida, es más común en una subpoblación con co médico subyacentenditions 11, que incluyen el alcoholismo, enfermedad hepática, diabetes, enfermedad renal, enfermedad maligna, y otras condiciones que conducen a una respuesta inmune debilitado. Cabe destacar que este grupo de personas es también un riesgo mayor de contraer enfermedades graves causadas por V. vulnificus, que se puede encontrar en los hábitats naturales similares a V. parahaemolyticus. V. parahaemolyticus se aísla de forma rutinaria usando agar sales de sacarosa tiosulfato-citrato-biliares (TCBS) como un medio selectivo y diferencial. El enriquecimiento en agua de peptona alcalina puede preceder el aislamiento en agar TCBS. presuntas colonias en TCBS se prueban aún más en una serie de pruebas bioquímicas y / o ensayos moleculares dirigidas a la presencia de genes específicos de cada especie. Métodos basados en PCR se utilizan a menudo para confirmar la identidad de V. parahaemolyticus mediante la amplificación del gen de la hemolisina termolábil, tlh 12. Independientemente de la choice de los métodos de confirmación, es importante tener un medio eficaz para aislar y diferenciar V. parahaemolyticus de otros vibrios marinos en el primer lugar. TCBS rutinariamente se ha utilizado para diferenciar las especies dentro del género Vibrio, según su capacidad para fermentar la sacarosa 12. Reacción de fermentación positiva se acompaña de un cambio de color del indicador de pH de bromotimol azul. V. colonias parahaemolyticus son bastante distintiva en TCBS, exhibiendo color de azul a verde. Sin embargo, este medio no puede diferenciar fácilmente V. alginolyticus y V. cholerae. especies de Proteus sacarosa-fermentación pueden producir colonias de color amarillo que se asemejan V. V. cholerae o Alginolyticus 13. El aislamiento inicial en TCBS, V. parahaemolyticus también se han identificado erróneamente como Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides, y Pseudomonas spp 14. Las cepas con ferm sacarosa retardadaentación puede ser confundida con otra sacarosa no fermentadores Vibrio 13, que incluye V. parahaemolyticus. TCBS se encontró que no es sensible frente a Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens, entre otros. Varias otras especies producen colonias verdes a grises que son potencialmente confundirse con V. V. parahaemolyticus o 15 vulnificus. Como resultado de ello, es deseable desarrollar medios de cultivo alternativa con mejor sensibilidad y especificidad hacia la detección y el aislamiento de V. parahaemolyticus y otras especies estrechamente relacionadas. Varias alternativas de medios de comunicación se han desarrollado recientemente. Además de la inclusión de agentes selectivos, la mayoría incorporan sustratos cromogénicos para diferenciar especies en base a sus actividades enzimáticas diferenciales. Por ejemplo, indoxilo-β-glucósido y de indoxilo-β-galactósido se han utilizado como los sustratos cromogénicos para diferenciar V. paracahaemolyticus colonias (que aparecen de color verde azulado) de las de V. cholerae (púrpura) debido a sus capacidades diferenciales para producir β-glucosidasa y β-galactosidasa 16. Diferentes formulaciones de agar cromogénico desarrolladas por varios grupos han sido evaluados y se informó para llevar a cabo de forma comparable a o mejor que TCBS 17,18,19. Una ventaja de usar un medio cromogénico es que la coloración del medio circundante es mínimo lo que facilita el aislamiento de colonias particulares. En este estudio, se evaluó la capacidad de un medio cromogénico de nueva formulación para detectar y aislar V. cholerae, V. parahaemolyticus y V. vulnificus; con un enfoque especial en su capacidad para diferenciar V. parahaemolyticus de otras especies.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent/Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHI powder</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0418-17-7</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Blender</td><td>Any</td><td></td><td>to blend oyster meat</td></tr><tr><td>CampyGen gas generator</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>CN035A</td><td>to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands</td></tr><tr><td>Chocolate agar plates</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>E14</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Common PCR reagents (dNTPs, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, &lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; Polymerase)</td><td>Any</td><td></td><td>or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014)</td></tr><tr><td>Culture tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S50712</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S348903</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Gel doc</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HardyChrom Vibrio agar plates</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>G319</td><td>This study evaluates this medium</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inoculating loops</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-606</td><td>10 microliter-size was used in this study</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Oysters</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>R23701</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Pipette and tips</td><td>Any</td><td></td><td>Sterilized tips</td></tr><tr><td>Primers for &lt;em&gt;tlh&lt;/em&gt;</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spreader</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-11</td><td>Beads may be used instead</td></tr><tr><td>Stomacher blender</td><td>Stomacher</td><td>400</td><td>Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec.&amp;nbsp; Other homogenizer can be used.</td></tr><tr><td>Sterile filter bags for blenders</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-5</td><td></td></tr><tr><td>TCBS powder</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>265020</td><td>This study evaluates this medium</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TSB powder</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0370-07-5</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>UV viewing cabinet</td><td>Any</td><td></td><td>Emit long-wave UV light</td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Any</td><td></td><td>&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Sources&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial species and strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aeromonas hydrophila&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Candida albicans&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Campylobacter jejuni&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Proteus mirabilis&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Staphylococcus aureus&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Salmonella&lt;/em&gt; Choleraesuis</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Shigella boydii&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Shigella flexneri&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Shigella sonnei&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Vibrio alginolyticus&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. cholerae&lt;/em&gt; (serotypes include &lt;em&gt;O139, O1,&lt;/em&gt; non &lt;em&gt;O1, El Tor&lt;/em&gt; biovars)</td><td>FDA, ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. damsela&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. fisheri&lt;/em&gt;</td><td>Environment</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. fluvialis&lt;/em&gt;</td><td>CDC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. furnissii&lt;/em&gt;</td><td>CDC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. hollisae&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. metschnikovii&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. mimicus&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. parahaemolyticus&lt;/em&gt; (serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;)</td><td>ATCC, FDA, CDC, Environment</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. proteolyticus&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. vulnificus&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

development of a more sensitive and specific chromogenic agar medium for the detection of vibrio parahaemolyticus and other vibrio species

Infecciones transmitidas por los alimentos en los EE.UU. causada por especies de Vibrio han mostrado una tendencia al alza. En el género Vibrio, V. parahaemolyticus es responsable de la mayoría de las infecciones -asociado Vibrio. Por lo tanto, la diferenciación precisa entre Vibrio spp. y la detección de V. parahaemolyticus es de vital importancia para garantizar la seguridad de nuestro suministro de alimentos. Aunque las técnicas moleculares son cada vez más comunes, métodos de cultivo a dependiendo todavía de forma rutinaria hecho y que se consideran métodos estándar en determinadas circunstancias. Por lo tanto, un nuevo medio de agar cromogénico fue probado con el objetivo de proporcionar un mejor método para el aislamiento y la diferenciación de Vibrio spp clínicamente relevante. El protocolo compara el límite de sensibilidad, especificidad y de detección para la detección de V. parahaemolyticus entre el nuevo medio cromogénico y un medio convencional. Varios V. parahaemolyticus cepas (n = 22) de reSe han usado presentar diversos serotipos y de la fuente de origen. Ellos fueron identificados previamente por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC), y verificado aún más en nuestro laboratorio por TLH-PCR. En por lo menos cuatro ensayos separados, estas cepas se inocularon en el agar y tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa cromogénicos (TCBS) de agar, que es el medio recomendado para el cultivo de esta especie, seguido de incubación a 35-37 ° C durante 24 h -96. Tres V. parahaemolyticus cepas (13,6%) no crecieron de manera óptima en TCBS, no obstante, exhibieron colonias de color verde si había crecimiento. Dos cepas (9,1%) no dieron los esperados cian colonias en el agar cromogénico. V. no cepas parahaemolyticus (n = 32) también se probaron para determinar la especificidad de la agar cromogénico. Entre estas cepas, 31 no crecieron o exhibieron otras morfologías de colonias. La recuperación media de V. parahaemolyticus en el chromogenic agar fue de ~ 96,4% en relación con agar de soja tríptico suplementado con 2% de NaCl. En conclusión, el nuevo agar cromogénico es un medio eficaz para detectar V. parahaemolyticus y para diferenciarlo de otros vibrios.

En este estudio, 54 cepas microbianas fueron ensamblados, que incluyó 22 cepas dentro de la V. especies parahaemolyticus, Vibrio otras 19 especies, y 13 especies de Vibrio no (Tabla 1). La mayoría V. cepas parahaemolyticus se recibieron ya sea de la FDA, CDC u otros departamentos de salud estatales. Representan diversos serotipos y fuentes de aislamiento. Estas cepas fueron identificadas previamente por los organismos reguladores. Además, confirmó la identidad de estos V. parahaemolyticus mediante la realización de un TLH-PCR 21,22. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Especies </td><td rowspan="2"> Nº de cepas ensayadas </td><td colspan="2"> Crecimiento y color de las colonias </td></tr><tr><td> TCBS </td><td> domedio hromogenic </td></tr><tr><td rowspan="2"> Aeromonas hydrophila </td><td rowspan="2"> 2 </td><td rowspan="2"> Sin crecimiento </td><td> 1 cepa no hay crecimiento; </td></tr><tr><td> 1 cepa de color magenta </td></tr><tr><td> Candida albicans </td><td> 1 </td><td> El débil crecimiento, amarillo </td><td> Sin crecimiento </td></tr><tr><td> Campylobacter jejuni </td><td> 1 </td><td> Sin crecimiento </td><td> Sin crecimiento </td></tr><tr><td> Escherichia coli </td><td> 1 </td><td> Sin crecimiento </td><td> El débil crecimiento, magenta </td></tr><tr><td> Proteus mirabilis </td><td> 1 </td><td> Sin crecimiento </td><td> Sin crecimiento </td></tr><tr><td> aeruginosa Pseudomonas </td><td> 2 </td><td> Turquesa </td><td> Amarillo </td></tr><tr><td> Staphylococcus aureus </td><td> 1 </td><td> El débil crecimiento, amarillo </td><td> Sin crecimiento </td></tr><tr><td> choleraesu Salmonellaes </td><td> 1 </td><td> Sin crecimiento </td><td> Sin crecimiento </td></tr><tr><td> boydii Shigella </td><td> 1 </td><td> Sin crecimiento </td><td> Sin crecimiento </td></tr><tr><td> Shigella flexneri </td><td> 1 </td><td> Sin crecimiento </td><td> Sin crecimiento </td></tr><tr><td> Shigella sonnei </td><td> 1 </td><td> Sin crecimiento </td><td> El débil crecimiento, magenta </td></tr><tr><td> alginolyticus Vibrio </td><td> 3 </td><td> Amarillo o turquesa </td><td> Amarillo </td></tr><tr><td> V. cholerae </td><td> 4 </td><td> Amarillo o turquesa </td><td> Magenta </td></tr><tr><td> V. damsela </td><td> 1 </td><td> Turquesa </td><td> Cobalto </td></tr><tr><td> V. fisheri </td><td> 1 </td><td> El débil crecimiento, amarillo </td><td> Sin crecimiento </td></tr><tr><td> V. fluvialis </td><td> 1 </td><td> Turquesa </td><td> Cobalto </td></tr><tr><td> V.furnissii </td><td> 1 </td><td> Amarillo </td><td> Amarillo </td></tr><tr><td> V. hollisae </td><td> 1 </td><td> Turquesa </td><td> Amarillo </td></tr><tr><td> V. metschnikovii </td><td> 1 </td><td> Sin crecimiento </td><td> Sin crecimiento </td></tr><tr><td> V. mimicus </td><td> 1 </td><td> Turquesa </td><td> Magenta </td></tr><tr><td> V. parahaemolyticus </td><td> 22 </td><td> La mayoría de las cepas de color turquesa </td><td> La mayoría de las cepas cian; algunos clara </td></tr><tr><td> V. proteolyticus </td><td> 1 </td><td> Turquesa </td><td> Cobalto </td></tr><tr><td> V. vulnificus </td><td> 4 </td><td> Turquesa o clara </td><td> Magenta </td></tr></tbody></table> Tabla 1. especies microbianas utilizadas en este estudio y sus características de crecimiento en el medio selectivo y diferencial. Llamada color era based en una rueda de color. Cian es similar a verde azulado; magenta es similar a la lavanda rosado, turquesa es similar a verde, amarillo abarca de oliva y marrón. Se realizaron cuatro ensayos separados para determinar el crecimiento y la morfología de colonias de estas cepas en el selectivo y diferencial media - TCBS y el agar cromogénico. TCBS es el medio convencional que se utiliza para el aislamiento de algunas especies de Vibrio, incluyendo V. cholerae y V. 12 parahaemolyticus. La variación del color de las colonias crecidas en TCBS era de color amarillo, turquesa (verde) o clara (Figura 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54493/54493fig1.jpg" /> Figura 1. Morfología de colonias de Vibrio spp. en TCBS agar. V. parahaemolyticus (turquesa), V. cholerae (amarillo), y de la mañana<html> la inoculación ixed de las dos especies (a). Las colonias de V. parahaemolyticus parece turquesa, con una circular, la totalidad, y la morfología convexa (b). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54493/54493fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> La posibilidad de un nuevo medio cromogénico para seleccionar las especies de Vibrio clínicamente relevantes de los alimentos y muestras ambientales se puso a prueba. Además, se evaluó la capacidad de este medio para distinguir simultáneamente estas especies entre sí. Colonia color observado en el agar cromogénico eran cobalto, cian, magenta, amarillo o claro (Figura 2). Como se muestra en la Tabla 1, tanto TCBS y el agar cromogénico exhiben ciertos grados de selectividad contra microorganismos no Vibrio. 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54493/54493fig2.jpg" /> Figura 2. colonia morfología de Vibrio spp. en el agar cromogénico de nuevo desarrollo. V. parahaemolyticus (cian), V. cholerae (magenta), y una inoculación mixta de las dos especies (a). Las colonias de V. parahaemolyticus parece cian, con una circular, la totalidad, y la morfología convexa (b). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54493/54493fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> De acuerdo con el método de recuento en placa estándar en cultivos de la noche, las colonias de V. se observaron parahaemolyticus en las placas de agar cromogénicos que reciben la más alta factor de dilución (es decir, df = 10 -8). Estos resultados son comparables a los de un medio no selectivo (CSTE). Esto sugiere que el límite de detección del medio cromogénico es similar a medios no selectivos, que es de aproximadamente 10 células o más bajo en ausencia de matriz alimentaria. La capacidad de detección para otras especies de Vibrio, como V. Alginolyticus, V. fluvialis y V. doncella era también decente en comparación con el medio no selectivo. Sin embargo, algunas cepas de V. cholerae, V. vulnificus y V. mimicus produjo de 10 a 100 veces menos CFU en el agar cromogénico. Los agentes selectivos utilizados en los medios selectivos cromogénicos u otros inevitablemente inhiben algunas células. Las células lesionadas, por ejemplo, no podrían recuperarse en medios selectivos. Sin embargo, la capacidad de detección ligeramente más pobre es un problema inexistente en la mayoría de los procedimientos de rutina que emplean una etapa de enriquecimiento. Pequeña cantidad de microorganismos en los alimentos o de muestras ambientales se multiplicaría a un alto nivel en el caldo de enriquecimiento, superando el límite de detección. El enriquecimiento en agua de peptona alcalina es often realizado para determinar la prevalencia de especies de Vibrio en muestras ambientales 12. En presencia de homogeneizado de ostras, el agar cromogénico continuó mostrando un buen grado de recuperación. En otras palabras, una gran proporción (&gt; 70%) de V. células parahaemolyticus eran capaces de crecer en el agar cromogénico, no afectado por la presencia de la matriz de la ostra (Figura 3a). El crecimiento y la recuperación de la V. células parahaemolyticus también no se vio afectada por la presencia de otra especie de Vibrio (Figura 3B). Este es un atributo importante debido a muestras ambientales están obligados a contener diferentes especies de Vibrio, que se encuentran en un número elevado sobre todo después de un proceso de enriquecimiento. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54493/54493fig3.jpg" /> Figura 3. </strong&gt; El porcentaje de recuperación de V. cepa parahaemolyticus en homogeneizado de ostras con y sin un competidor bacteriana. Recuperación (media ± DE) se calculó de acuerdo a la observada frente a la esperada UFC contar con las placas de agar. Espera contabilidad de UFC se calculó basándose en la carga bacteriana en el inóculo. Alta recuperación de V. Se observó cepa parahaemolyticus en todos los medios de comunicación sin competencia (a). Nivel similar de recuperación se observó cuando los altos niveles de V. metschnikovii células estaba presente (b). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54493/54493fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Para comparar más la agar cromogénico y TCBS, se calcularon la sensibilidad y especificidad. La Tabla 2 muestra la capacidad de estos medios de comunicación para Accurado identificar V. parahaemolyticus. La sensibilidad se relaciona con el porcentaje de verdadero positivo, lo que significa la V. parahaemolyticus cepas produjeron la morfología de las colonias esperado en los medios de comunicación. La especificidad se relaciona con el porcentaje de verdadero negativo, lo que significa no V. parahaemolyticus cepas deben exhibir pobre o ningún crecimiento, o una morfología de la colonia diferente de V. parahaemolyticus. La sensibilidad y especificidad para TCBS para identificar V. parahaemolyticus eran 86,4% y 71,8%, respectivamente. En comparación, la sensibilidad y la especificidad del medio cromogénico fueron 90,9% y 96,9%, respectivamente. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> un) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> agar TCBS </td><td> V. parahaemolyticus </td><td> V no. parahaemolyticus </td></tr><tr><td> Un buen crecimiento y turquesa colonies </td><td> 19 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> Deficiencia en el crecimiento o no de color turquesa colonias </td><td> 3 </td><td> 23 </td></tr><tr><td> segundo) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> agar cromogénico </td><td> V. parahaemolyticus </td><td> V no. parahaemolyticus </td></tr><tr><td> Buenas colonias de crecimiento y cian </td><td> 20 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Deficiencia en el crecimiento o no cian colonias </td><td> 2 </td><td> 31 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. La sensibilidad y la especificidad de TCBS (a) y cromógeno (b) agar en la detección de V. parahaemolyticus. Las identidades de V. parahaemolyticus se determinó previamente por prueba bioquímica y PCR tlh-.

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Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

Desarrollo de una más sensible y específica cromogénico medio de agar para la detección de<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Y Otros<em&gt; Vibrio</em&gt; Especies

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

development-more-sensitive-specific-chromogenic-agar-medium-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

14.4K vistas.  California Polytechnic State University. Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium. 

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'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

&quot;Bioluminiscente &#39;reportero fagos para la detección de patógenos bacterianos de la categoría A

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Investigación

Inmunología e Infección

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food webs. Toxicity testing based on microorganisms are widely used because they are relatively quick, reproducible, cheap, and are not associated with ethical issues. Here, we describe an ecotoxicological method to evaluate the biological response of the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method assesses the acute toxicity of chemical compounds, including new contaminants such as nanoparticles, as well as environmental samples. The endpoint is the reduction of bacterial culturability (i.e., the capability to replicate and form colonies) due to exposure to a toxicant. This reduction can be generally referred to as mortality. The test allows for the determination of the LC50, the concentration that causes a 50% decrease of bacteria actively replicating and forming colonies, after a 6 h exposure. The culturable bacteria are counted in terms of colony forming units (CFU), and the &#34;mortality&#34; is evaluated and compared to the control. In this work, the toxicity of copper sulphate (CuSO4) was evaluated. A clear dose-response relationship was observed, with a mean LC50 of 1.13 mg/L, after three independent tests. This protocol, compared to existing methods with microorganisms, is applicable in a wider range of salinity and has no limitations for colored/turbid samples. It uses saline solution as the exposure medium, avoiding any possible interferences of growth medium with the investigated contaminants. The LC50 calculation facilitates comparisons with other bioassays commonly applied to ecotoxicological assessments of the marine environment.

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

This work describes a new protocol to assess the ecotoxicity of pollutants, including emerging contaminants such as nanomaterials, using the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method allows for the determination of the LC50, or mortality, the concentration that causes a 50% decrease in bacteria culturability, after a 6 h exposure.

Método ecotoxicológico con bacterias marinas<em&gt; Vibrio anguillarum</em&gt; Evaluar la Toxicidad Aguda de los Contaminantes Ambientales

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food ...

Medio ambiente

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no fitness consequence (commensal), or be beneficial (mutualistic). While much attention has been given to pathogenic interactions, little is known about the processes that dictate the reproducible acquisition of beneficial/commensal bacteria from the environment. The light-organ mutualism between the marine Gram-negative bacterium V. fischeri and the Hawaiian bobtail squid, E. scolopes, represents a highly specific interaction in which one host (E. scolopes) establishes a symbiotic relationship with only one bacterial species (V. fischeri) throughout the course of its lifetime6,7. Bioluminescence produced by V. fischeri during this interaction provides an anti-predatory benefit to E. scolopes during nocturnal activities8,9, while the nutrient-rich host tissue provides V. fischeri with a protected niche10. During each host generation, this relationship is recapitulated, thus representing a predictable process that can be assessed in detail at various stages of symbiotic development. In the laboratory, the juvenile squid hatch aposymbiotically (uncolonized), and, if collected within the first 30-60 minutes and transferred to symbiont-free water, cannot be colonized except by the experimental inoculum6. This interaction thus provides a useful model system in which to assess the individual steps that lead to specific acquisition of a symbiotic microbe from the environment11,12.
Here we describe a method to assess the degree of colonization that occurs when newly hatched aposymbiotic E. scolopes are exposed to (artificial) seawater containing V. fischeri. This simple assay describes inoculation, natural infection, and recovery of the bacterial symbiont from the nascent light organ of E. scolopes. Care is taken to provide a consistent environment for the animals during symbiotic development, especially with regard to water quality and light cues. Methods to characterize the symbiotic population described include (1) measurement of bacterially-derived bioluminescence, and (2) direct colony counting of recovered symbionts.

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

The method outlines the procedure by which the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and its bacterial symbiont, Vibrio fischeri, are raised separately and then introduced to allow for specific colonization of the squid light organ by the bacteria. Colonization detection by bacterially-derived luminescence and by direct colony counting are described.

La colonización de Euprymna scolopes Squid por Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

Desarrollo de un Biosensor de ADN electroquímico para la detección de un patógeno de transmisión alimentaria

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Bioingeniería

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

Un análisis de la virulencia bacteriana rápida basada en imágenes usando ameba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.

Técnicas de laboratorio utilizadas para mantener y diferenciar los biotipos de<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Aislados Clínicos y Ambientales

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ability to obtain single cells for fluorescence microscopy, which can be particularly challenging when imaging cells that exist within bacterial communities. For example, the human pathogen Vibrio parahaemolyticus exists as short rod-shaped swimmer cells in liquid conditions that upon surface contact differentiate into a subpopulation of highly elongated swarmer cells specialized for growth on solid surfaces. This paper presents a method to perform single cell fluorescence microscopy analysis of V. parahaemolyticus in its two differential states. This protocol very reproducibly induces differentiation of V. parahaemolyticus into a swarmer cell life-cycle and facilitates their proliferation over solid surfaces. The method produces flares of differentiated swarmer cells extending from the edge of the swarm-colony. Notably, at the very tip of the swarm-flares, swarmer cells exist in a single layer of cells, which allows for their easy transfer to a microscope slide and subsequent fluorescence microscopy imaging of single cells. Additionally, the workflow of image analysis for demographic representation of bacterial societies is presented. As a proof of principle, the analysis of the intracellular localization of chemotaxis signaling arrays in swimmer and swarmer cells of V. parahaemolyticus is described.

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

This protocol enables single cell microscopy of the differentially distinct Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. The method produces a population of swarmer cells easily available for single cell analysis and covers preparation of cell cultures, induction of swarmer differentiation, sample preparation, and image analysis.

Inducción de la diferenciación celular y de imágenes monocelulares de<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Células Swimmer y Swarmer

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Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

Formación de biopelículas inducida por sales biliares en patógenos entéricos: técnicas para la identificación y cuantificación

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. This method employs stable plasmids that allow each population to be differentially tagged with distinct antibiotic resistance capabilities and fluorescent proteins for selection and visual discrimination of each population, respectively. Here, we describe the preparation and coincubation of competing Vibrio fischeri strains, fluorescence microscopy imaging, and quantitative data analysis. This approach is simple, yields quick results, and can be used to determine whether one population kills or inhibits the growth of another population, and whether competition is mediated through a diffusible molecule or requires direct cell-cell contact. Because each bacterial population expresses a different fluorescent protein, the assay permits the spatial discrimination of competing populations within a mixed colony. Although the described methods are performed with the symbiotic bacterium V. fischeri using conditions optimized for this species, the protocol can be adapted for most culturable bacterial isolates.

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Bacteria encode diverse mechanisms for engaging in interbacterial competition. Here, we present a culture-based protocol for characterizing competitive interactions between bacterial isolates and how they impact the spatial structure of a mixed population.

Ensayo de incubación de monedas para cuantificar las interacciones competitivas entre aislados de Vibrio fischeri

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Protocolo rápido para la preparación de electrocompetentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Y<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

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