Agradecemos a M. Channey, E. Chau, e K. Tomas por sua assistência no projeto. suprimentos do projeto foram parcialmente financiado pela California Polytechnic State University.

1. Mídia e Cultura de microbianas Cepas NOTA: Use técnicas assépticas em todos os experimentos. Usar materiais estéreis. Esterilizar todos os recipientes, ferramentas e reagentes antes de usar. Autoclave todos os resíduos antes do descarte, porque eles são considerados de risco biológico. temperatura e tempo autoclave combinação é ≥121 ° C x ≥15 min durante todos os procedimentos a seguir. <ol><li> Para tornar ~ 1-L-agar de soja tríptica (TSA), primeiro adicionar 1 L de água desionizada num balão de Erlenmeyer de 2 L contendo uma barra de agitação magnética. Usar um balão que é pelo menos duas vezes maior do que o volume final. Adicionar 30 g de caldo de soja tríptica em pó e 20 g de agar grânulos para o frasco. NOTA: Use 2% de agar em vez de 1,5% para limitar enxame de algum Vibrio spp. <ol><li> Misturar bem, rodando sobre o agitador. Enquanto se agitava, ligue o fogo para ferver a mistura. Retirar o frasco do aquecedor, logo que a mistura começa a ferver. Vagamente cobrir the frasco com uma folha de estanho. Tape o papel alumínio para protegê-lo para o frasco antes de autoclave. </li><li> Para fazer tríptico caldo de soja (TSB), omitir o agar da receita no passo 1.1. NOTA: Pode usar garrafas em vez de Erlenmeyer. </li><li> Para fazer agar de soja tríptica suplementado com cloreto de sódio a 2% ou NaCl (CST), adicionar 20 g de NaCl na mistura antes da agitação e aquecimento. Para fazer caldo de soja tríptica suplementado com 2% de NaCl (TSBs), omitir o agar, adicionar 20 g de NaCl na mistura antes da agitação e aquecimento. </li></ol></li><li> Para tornar a infusão de coração e cérebro de agar (BHI), suspensão 37 g de BHI em pó e 15 g de grânulos de agar em 1 litro de água purificada. Aquecer com agitação frequente para dissolver o pó. Autoclave. Omitir o agar para fazer caldo BHI. </li><li> Para fazer ágar TCBS, suspensão 89 g do pó em TCBS 1 L de água purificada. Aquecer com agitação frequente e fervura durante 1 min para dissolver completamente o pó. Não autoclave. </li><li> Por todos os meios de agar, arrefecer o agar quente para 45-50 ° C num banho de água. Organizar placas de Petri vazios em pilhas de cinco a seis placas. A partir da parte inferior da pilha, verter o agar derretido em cada placa de Petri para atingir cerca de metade cheio. Feche a tampa placa de Petri após o vazamento. Permitir que o agar solidificar, permitindo que as placas de repouso à temperatura ambiente. <ol><li> Use as placas de ágar no dia seguinte ou após 12 horas. Armazenar placas não utilizados em uma geladeira por até duas semanas. Antes da utilização, remover as placas a partir do frigorífico e equilibrar-los à temperatura ambiente durante pelo menos 15 min. NOTA: agar de um litro faz ~ 45 placas de ágar. Permitir que as placas de ágar para secar suficientemente no dia da preparação, e equilibrar-los à temperatura ambiente após o armazenamento a frio para reduzir eficazmente a propagação das colônias. </li></ol></li><li> Obter chocolate e de ágar cromogênico placas e equilibrar-los à temperatura ambiente antes de cada experimento. </li><li> Subcultura todos os 54 cepas microbianas apresentados na Tabela 1 a cada poucos days. <ol><li> Use um loop de inoculação estéril para transferir culturas a partir de um estoque congelado ou um lote anterior para mídia não-seletivos, como BHI, TSB / TSA ou agar chocolate. Crescer halophilic Vibrio spp. em TSBs / TSAS. </li><li> Para verificar a pureza da cultura, raia todas as estirpes em um padrão que permita a observação das colônias isoladas. Por exemplo, usar um padrão de estrias de três fases para diluir uma grande quantidade de bactérias a quantidade menor, originando eventualmente colónias isoladas. </li></ol></li><li> Incubar as placas de cabeça para baixo a 35-37 ° C durante até 48 h. Para Campylobacter spp., Tubos ou placas incubar em um frasco de tampa fechada contendo uma bolsa de gás para produzir um ambiente microaerophilic. Observar morfologia das colónias após incubação. Culturas puras deve produzir colónias que exibem uma morfologia de colónia semelhante. NOTA: Incubar todas as placas de cabeça para baixo para evitar que as gotículas de água condensada formadas no lado inferior da tampa de cair na colonies. </li></ol> 2. Espécies Determinação por PCR <ol><li> Realizar tlh-PCR para confirmar a identidade de V. cepas parahaemolyticus. Utilização iniciadores TLH -F (5 &#39;AAA GCG TAT GAT GCA GAA GCA CTG 3&#39;) e -R TLH (5 &#39;TCG ACT TTC CAT TAG TTT CTC TGC 3&#39;) para amplificar um fragmento de 450 pb do gene de hemolisina 20 termolábil . <ol><li> Use um loop de inoculação estéril para transferir algumas colônias isoladas de cada V. estirpe parahaemolyticus a partir TSAS a 5 ml de TSBs. Incubar a 35-37 ° C durante 16-24 hr. </li><li> culturas centrifugar a 14.000 xg por 1 min. Remover o sobrenadante e lavar o sedimento duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Ferver a suspensão durante 3 minutos para se obter lisado celular. NOTA: V. parahaemolyticus é fácil de ser lisadas. Portanto reagente de lise não é necessária. É também possível usar um pouco de colónia directamente como molde. </li><li> Executar PCR numa reacção de 25-ul volume. Prepara-se uma mistura reaccional contendo uma concentração final de tampão de PCR 1x, MgCl2 1,5 mM, 100 uM de cada dNTP, 1 pM de cada iniciador, 1 U de Taq polimerase e 1 ml de lisado celular. Após pré-incubação a 94 ° C durante 5 min, executar 35 ciclos de amplificação de 94 ° C durante 30 seg, 58 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 60 seg 21. </li><li> alíquotas de carga de amplicão 5-ul em géis de agarose a 1,5%. Ligue a fonte de alimentação para iniciar a electroforese. Visualizar a presença ou ausência de produtos de amplificação sob iluminação com UV, após coloração com brometo de etídio. </li></ol></li></ol> 3. Crescimento na selectivo e diferencial de mídia <ol><li> Dois a quatro dias antes do experimento, raia todas as cepas microbianas apresentados na Tabela 1 no meio não selectivo (TSAS, BHI ou agar chocolate) para o isolamento de colónia. Incubar as placas a 35-37 ° C durante 48 h. Verifique a pureza das culturas através da observação da morfologia das colónias após incubação. Culturas puras deve produzir colónias que exibem uma morfologia de colónia semelhante. </li><li> Transferir algumas colónias isoladas a partir do passo 3.1 em 5 mL de caldo. Incubar os tubos a 35-37 ° C durante 16-24 hr. Nota: Use as colónias jovens, que são menos de quatro dias de idade, para preparar culturas durante a noite em todos os experimentos. </li><li> Streak uma ansa de culturas durante a noite em meio selectivo e diferencial (TCBS e agar cromogênico) para o isolamento de colónia. Incubar as placas a 35-37 ° C durante até 96 h. </li><li> Grave o crescimento global de todas as estirpes, examinando tanto a densidade da cultura no prato e o tamanho de colônias isoladas. Grave a cor das colónias sob a luz ambiente e / ou UV. Nota outras características da colônia isolada como a altitude, a margem e forma. </li></ol> Ensaio 4. Recuperação <ol><li> Seleccionar um subconjunto representativo de V. cepas parahaemolyticus (n = 14) que abrangem diferentes sorotipos e origens de isolamento <s-se&gt; 22. Inocular culturas jovens das placas em 5 ml de TSBs. Incubar os tubos a 35-37 ° C durante 16-24 hr. </li><li> Realizar um método de contagem padrão em placa das culturas durante a noite, como descrito abaixo. <ol><li> Vortex para misturar as culturas durante a noite bem. Adicione uma dobra em 10 ou 10 -1 de diluição por transferência de 100 uL da cultura durante a noite para um tubo contendo 900 jil de PBS. Vortex para misturar bem. </li><li> Usar uma nova ponta de pipeta para transferir 100 ul a partir do tubo 10 -1 de diluição para outro tubo contendo 900 ul de PBS. Vortex para misturar bem. Isto constitui 10 -2 diluição. Repetir o processo sequencial para se obter 10 -7 diluição. </li><li> Usando os 10 -4 a 10 -7 tubos de diluição, placa 100 ul cada um no, TCBs e CST placas de ágar cromogênico. NOTA: O factor de diluição (DF) sobre a placa torna-se 10 -5 a 10 -8, respectivamente. </li><li> Espalhe as alíquotas uniformemente em tele agar superfície. NOTA: É bem usar o mesmo espalhador por pressão sobre o mesmo meio, enquanto a alíquota mais diluída é espalhado primeiro (ou seja, a partir de 10 -8 a 10 -5). Não use o mesmo espalhador para diferentes mídias. </li><li> Incubar as placas a 35-37 ° C durante até 96 h. Contagem das colónias nas placas. Ignorar placas de rolamento colónias que são demasiado numerosas para contar (TnTc) ou menos do que 25. Calcular CFU / ml de acordo com o seguinte: <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/54493/54493eq1.jpg" /> Onde N = o número de células no tubo não diluído, expresso em CFU / ml ou CFU / g C = o número total de colónias contadas em placas que dão 25-300 colónias N 1 = o número de placa (s), onde as colónias são contadas a partir do DF inferior n = 2 o número de placa (s), onde as colónias são contadas a partir da diluição de 10 vezes subsequente dF = factor de diluição menor (isto é, a diluição mais concentrada) </li></ol></li><li> Compare UFC / ml entre os diferentes meios de comunicação. Use UFC / ml em TSAS como 100%, calcular a recuperação% de V. parahaemolyticus cultivadas em agar cromogénico e TCBS. </li></ol> Ensaio 5. Concorrência <ol><li> Escolha um subconjunto de estirpes que exibem diferentes morfologias colônia na agar cromogênico e TCBS. NOTA: Dessa forma, será possível a contagem das colónias originado V. única parahaemolyticus, apesar da presença de outras espécies no inoculo. <ol><li> Escolha um V. estirpe parahaemolyticus que produz os turquesa e ciano colónias esperado em TCBS eo agar cromogênico, respectivamente. </li><li> Escolha um V. não- parahaemolyticus e uma espécie não-Vibrio que não crescem em qualquer um destes meios de comunicação, ou exibem cor diferente colônia. NOTA: Por exemplo, V. metschnikovii cresce muito pouco oN TCBS e não crescem em agar cromogénico. Shigella sonnei que não crescem em TCBS mas produz colónias magenta sobre o ágar cromogénico. </li></ol></li><li> Após a seleção das estirpes anteriores, preparar caldos de cultura durante a noite usando colônias isoladas cultivadas em meio não selectivo. <ol><li> Faça culturas durante a noite de V. parahaemolyticus e V. metschnikovii transferindo algumas colónias isoladas a partir de TSAS a 5 ml de TSBs. Incubar a 35-37 ° C durante 16-24 hr. </li><li> Adicione culturas de uma noite de Shigella sonnei, transferindo-se algumas colónias isoladas a partir de agar de BHI para 5 ml de caldo BHI. Incubar a 35-37 ° C durante 16-24 hr. </li></ol></li><li> Para cada cepa, realizar uma série de diluição semelhante ao Passos 4.2.1 e 4.2.2. Placa diluições apropriadas em TSAS ou BHI para determinar UFC / ml da cultura durante a noite, utilizando-se a equação mostrado no Passo 4.2.5. NOTA: Normalmente, 100 ul da diluição de 10 -5 a 10 -7tubos funciona para a maioria das culturas. Use os valores de UFC / mL para trás calcular a quantidade exata de células usadas na próxima etapa. Os valores de CFU / ml calculados são obtidos depois de incubação, embora os seguintes passos são executados na mesma data no passo 5.3. </li><li> Usando as culturas durante a noite e tubos de diluição nos Passos 5.2 e 5.3, misturar diferentes quantidades de um V. estirpe parahaemolyticus e V. não espécies parahaemolyticus. Por exemplo, misturar 500 ul da diluição -5 tubo 10 de V. parahaemolyticus com 500 ul das culturas durante a noite de V. metschnikovii. NOTA: Esta mistura simula fundo alta microflora. Para simular um fundo baixo microflora, misturar 500 ul cada do tubo 10 -5 diluição de ambas as espécies. </li><li> Espalhe 100 uL da mistura de cada um no, TCBS e TSAS placas de agar cromogénicos. </li><li> Após incubação a 35-37 ° C durante até 96 h, a contagem de colónias de V. parahaemolyticus e o V. não- espécies parahaemolyticus com base na sua diferença no crescimento e morfologia da colônia no ágar cromogênico e TCBS. NOTA: Por exemplo, se o V. não- O parahaemolyticus espécies não crescem em agar cromogénico e TCBS, todas as colónias será de V. parahaemolyticus. Se o V. não- espécies parahaemolyticus cresce em ambos os meios, apenas as colónias azul-turquesa em TCBs e ciano colónias em agar cromogênico será de V. parahaemolyticus. O V. não- espécies parahaemolyticus podem ou não exibem uma morfologia de colónia semelhante a V. parahaemolyticus em TSAS. <ol><li> Se o V. não- espécies parahaemolyticus cresce de modo semelhante a V. parahaemolyticus neste meio não selectivo, divida o número de colónias por dois para obter números de V. parahaemolyticus somente. Comparar o número de colónias real com a contagem esperada derivada da etapa 5.3. </li></ol></li></ol> 6. EffECTS de ostra homogeneizados <ol><li> Pesar ≥50 g carne de ostra de ≥12 moluscos incluindo carne e bebidas alcoólicas. <ol><li> Adicionar uma quantidade igual de PBS à carne de ostra e bebidas alcoólicas. Mistura-se a mistura a alta velocidade durante 90 segundos. Isto constitui 2 -1 homogenato diluído de ostras. </li><li> Adicionar 100 g de 2 -1 homogenato diluído de ostra a 400 g de PBS. Use uma escala para medir o peso, não volume. Mistura-se a mistura a alta velocidade durante 1 minuto. Autoclave a homogenato de ostras. NOTA: Este será o homogeneizado ostra usado para spiking. </li></ol></li><li> Repetir o ensaio de recuperação (Passo 4), na presença de homogenato de ostras. <ol><li> Após a 500 g de ostra homogeneizado esfriar, adicione 100 ml de V. parahaemolyticus culturas durante a noite cultivadas em TSBs a ele. Determinar a quantidade real de V. células parahaemolyticus no inóculo por realização dos procedimentos de contagem padrão em placas descritas no Passo 4.2. </li></ol></li><li> Repcomer o ensaio de competição (Passo 5) na presença de homogenato de ostras. <ol><li> Após a 500 g de ostra homogeneizado esfria, adicionar 100 ul cada um culturas durante a noite de V. parahaemolyticus e V. não- parahaemolyticus a ele. Determinar a quantidade real de bactérias células do inóculo por realização dos procedimentos de contagem padrão em placas descrito no Passo 4.2 </li></ol></li><li> Misturar as células bacterianas com homogenato de ostra bem utilizando um homogeneizador. NOTA: Após a mistura, o homogeneizado ostra contendo as células intencionalmente adicionados é chamado cravado ostra homogeneizado. </li><li> Fazer diluições do homogeneizado ostra cravada para se obter 10 -1 a -3 10 tubos de diluição de acordo com os procedimentos descritos no Passo 4.2.2. Espalhe 100 ul de cada diluição para o cromogénico TCBS e TSAS ágar,. Incubar as placas a 35-37 ° C durante até 96 h. </li><li> Compare o número de colónias real sobre agar cromogênico e TCBS com o experado contagem de colónias deduzida a partir de Passos 6.2.1 e 6.3.1. NOTA: Por exemplo, se um tubo de V. parahaemolyticus cultura durante a noite contém 10 8 CFU / ml, um inoculo de 100 ul significa que 10 7 células são adicionadas a 500 g de homogeneizado de ostra, obtendo-se 5 x 10 4 células / g. Após a diluição e em placas, a placa com df = 10 -2 deve render 500 colónias; enquanto que com df = 10 -3 deve rendimento de 50 colónias. Estas são as contagens de colónias esperado. </li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Vibrio+spp.+in+raw+shrimps+(Parapenaeus+longirostris)+and+performance+of+a+chromogenic+medium+for+the+isolation+of+Vibrio+strains.">Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains.</a> Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).</li><li>Food Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+guidance+on+reporting+results+from+studies+evaluating+diagnostic+tests.">Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests.</a> http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).</li><li>Burd, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+laboratory-developed+molecular+assays+for+infectious+diseases.">Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases.</a> Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).</li></ol>

Some media were generously provided by Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA. Thorsen conducted this study while a student at California Polytechnic State University. He is currently an employee of Hardy Diagnostics.

Este estudo centra-se no desenvolvimento e avaliação meios de cultura. Convencionalmente, TCBS é o selectivo e diferencial meio utilizado para isolar e detectar V. parahaemolyticus, V. cholerae e V. vulnificus 12. No entanto, limitações têm sido relatados para este meio, tais como a incapacidade para diferenciar V. cholerae a partir de outras espécies de Vibrio. Sacarose e indicador de pH são os agentes de diferenciação de TCBS. Assim, a produção de ácido por fermentador de sacarose provoca a mudança de cor do meio. A coloração do meio é uma desvantagem de TCBS porque pode obscurecer observação da morfologia da colônia. O meio cromogénico recentemente desenvolvido utiliza o pH elevado e salinidade para suprimir o crescimento de espécies Vibrio não encontradas em muitas amostras marinhos. O novo meio cromogénico tem um pH final de 8,6 ± 0,2. Por litro de água desionizada, que consiste em 10 g de peptona, 10 g de mistura de sais do mar, 10 g de bílis de boi, 10 g de sódiotiossulfato, 5 g de extracto de levedura, 5 g de citrato de sódio, 2,2 g de carbonato de sódio, 2 g de lactose, 0,5 g de piruvato de sódio, 0,3 g de uma mistura cromogénica e 15 g de ágar. O mix cromogénico permite a diferenciação entre Vibrio spp. de acordo com as suas capacidades diferenciais para produzir certas enzimas. Em vez de alterar a cor do meio de agar TCBS, diferente Vibrio spp. exibiriam cor diferente colônia no novo meio cromogénico. Em comparação, um meio cromogénico comercialmente disponível contém 15 g de agar, 8 g de peptona e extracto de levedura, 51,4 g de sais, 0,3 g de uma mistura cromogénica e um pH final de 9,0 ± 0,2. A robustez de uma avaliação do ensaio depende do tamanho da amostra. Uma vez que este estudo enfatiza sobre a eficácia do novo meio cromogénico para isolar e detectar V. parahaemolyticus, é importante para acumular muitos V. diversificada cepas parahaemolyticus. Estudos anteriores comparando TCBS enovos meios de cultura muitas vezes envolvidos amostras ambientais ou alimentares que contenham tipos e quantidade de microorganismos 23,24,25,26 desconhecidos. Várias colónias por amostra foram isoladas ainda a natureza clonal dos isolados muitas vezes era indeterminada. Idealmente, diferentes estirpes devem ser testados em ensaio de desenvolvimento de outra forma a exactidão do ensaio seria aumentado. Estirpe de identidade pode ser estabelecida por métodos convencionais, tais como subtipagem de electroforese em gel de campo pulsado (PFGE) ou multi-locus de sequenciação. V. cepas parahaemolyticus neste estudo foram previamente caracterizados por ribotipagem e PFGE 19. Durante o desenvolvimento do ensaio, a sensibilidade, especificidade e limite de detecção estão entre os principais fatores a serem investigados. Sensibilidade, também conhecido como precisão ou sensibilidade de diagnóstico, é o acordo positivo por cento entre os métodos de teste e referência. Especificidade, também conhecido como precisão ou especificidade do diagnóstico, é o negativo por cento ao<html> ACORDO entre os métodos de teste e referência. Neste estudo, utilizou-se o método à base de PCR, como o método de referência, porque os resultados foram verificados entre os diferentes grupos. TCBS e os meios cromogénicos foram os métodos de ensaio. Para determinar a sensibilidade, resulta da V. cepas parahaemolyticus foram utilizados, ou seja, sensibilidade = 100% x Verdadeiro Positivo / (verdadeiro positivo + falso negativo). Por outro lado, resulta de V. não- parahaemolyticus estirpes foram usadas para determinar a especificidade; e, portanto, a especificidade = 100% x Verdadeiro Negativo / (True Negative + Falso Positivo). Para fornecer resultados de especificidade mais confiáveis, V. não cepas parahaemolyticus deve ser isolado de um ambiente no qual a amostragem será conduzida. Nossos cálculos de sensibilidade e especificidade são baseados em documentos escritos pelo governo 27, 28 e academia organização científica 29 sobre um tema relacionado com o desenvolvimento de ensaio e validação. nt &quot;&gt; Com base em nossos resultados, o meio cromogénico mostraram melhor desempenho do que TCBS na identificação de V. parahaemolyticus. O acordo global por cento entre o método de referência e meio cromogénico é de 94,4%, em comparação com 77,8% entre o método de referência e TCBS. a sensibilidade e a especificidade do meio cromogénico são 90,9% e 96,9%, respectivamente, que são maiores do que os dos TCBS (86,4% e 71,9%, respectivamente). estudos anteriores avaliaram outros meios cromogénicos para a detecção de V. parahaemolyticus encontrado que as sensibilidades variou 85-88%, enquanto especificidades variou de 94 a 95% 23,24,25. Entretanto, esses estudos não usar o mesmo método de cálculo como o nosso estudo. Além disso, eles às vezes utilizado um método de referência diferente ou eles combinaram os resultados de ambos bioquímica analisa e meio cromogénico como um método de teste. como resultado, é difícil comparar directamente os nossos resultados com estes estudos anteriores. V. parahaemolyticus, o ágar cromogénico utilizado neste estudo também pode diferenciar mais espécies Vibrio que TCBS devido à inclusão de uma mistura cromogénica na fórmula forma, dando origem a cores múltiplas. Embora não tenha sido o foco deste estudo para detectar V. cholerae e V. vulnificus, vale a pena notar que as colónias magenta exibida por estas espécies podem ser ainda diferenciadas por fluorescência sob UV. Uma limitação para utilizar o agar cromogénico para a detecção de V. cholerae e V. vulnificus é sua aparente baixa recuperação para estas espécies. Para contornar este problema, uma etapa de enriquecimento devem ser incluídos. Outra possível limitação do agar cromogênico é a sua vida útil mais curta do que TCBS. otimização contínua deste novo meio é necessário para manter o pH durante o armazenamento. Apesar da popularidade de técnicas moleculares, Métodos, dependendo da cultura ainda são valiosos como eles são muitas vezes menos caro e ter uma melhor limite de detecção. Estes métodos de cultura pode ser utilizado como uma ferramenta de rastreio. Por outro lado, eles podem ser utilizados para confirmar a identidade e viabilidade dos microrganismos seguintes análises moleculares. Para enumerar as bactérias através de uma abordagem de cultura, dependendo, Plate Count padrão é reconhecido como o método standard. A equação mostrado no Passo 4.2.5 é uma forma mais precisa para determinar a CFU / g ou CFU / mL de uma média de CFUs de diferentes factores de diluição. É importante observar que todos os diluentes e meios de comunicação em todos os processos devem conter sal suficiente para manter a viabilidade das bactérias halófilas como V. parahaemolyticus. A temperatura de incubação e do ambiente deve ser óptimo para o crescimento bacteriano. O meio cromogénico é projetado para detectar espécies de Vibrio que são importantes patógenos humanos. Portanto, mais estudos devem ser realizados para determine sua eficácia para detectar outras espécies de Vibrio ambientais que não sejam clinicamente relevante. Em futuras aplicações, o novo ágar cromogénico pode ser incorporado em ensaios de rotina de amostras ambientais para V. parahaemolyticus. Isto pode ser realizado por estrias directa de amostras sobre o ágar cromogénico para detectar a presença de V. presuntivo parahaemolyticus. O ágar cromogénico também pode ser usado para enumerar V. parahaemolyticus seguinte diluições. A quantificação pode também ser calculada através da realização de um método do número mais provável usando caldo de enriquecimento, seguido por estrias sobre o ágar cromogénico para confirmação.

Como um membro do gênero Vibrio, V. parahaemolyticus é, curvo bactéria Gram-negativa, não-formadoras de esporos, em forma de haste. Ele exibe uma elevada motilidade em ambos os ambientes líquidos e semi-sólidos. A maioria V. cepas parahaemolyticus não são patogénicas para os seres humanos, mas os subtipos patogênicos têm causado epidemias e pandemias, portanto, esta espécie é considerada um importante patógeno de origem alimentar em muitos países 1,2. A incidência de infecção Vibrio em os EUA tem mostrado uma tendência ascendente desde 2000 3. Entre Vibrio spp., V. parahaemolyticus é a espécie mais frequentemente relatados que causam doenças em os EUA 4,5. Outras espécies clinicamente relevantes incluem V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, etc. Uma pequena porcentagem das doenças é causada por várias espécies simultaneamente. V. parahaemolyticus é uma i naturaisnhabitant de água do mar e, portanto, amplamente distribuídos em águas marinhas em todo o mundo, incluindo os estuários. A espécie foi descoberta em 1950 na sequência de um surto de intoxicação alimentar no Japão. Em os EUA, a espécie foi isolada pela primeira vez na água do mar, sedimentos, e marisco na região de Puget Sound 6,7. Filtro alimentadores em habitats marinhos, tais como moluscos bivalves, podem abrigar V. parahaemolyticus como parte de sua flora natural 8. Como tal, V. infecções parahaemolyticus em humanos são muitas vezes ligados ao consumo de mariscos contaminados, principalmente mariscos crus ou mal cozidos. Uma rota menos comum de entrada ocorre quando ferida aberta é exposta à água do mar, levando à infecção de pele. A maioria V. cepas parahaemolyticus não causam a doença humana, mas certos subtipos que abrigam fatores de virulência como hemolisina direta termoestável (TDH) são patogênicas. Os sintomas mais prevalentes de origem alimentar V. infecção parahaemolyticus sãodiarreia e dor abdominal, seguida de náuseas, vómitos e febre. Dor de cabeça e arrepios são também relatados. O período de incubação médio é de 15 horas, mas pode ser de até 96 horas após o consumo de uma quantidade suficiente de estirpes patogénicas 9. A doença dura de dois a três dias. Os sintomas de gastroenterite causados por V. parahaemolyticus são amplamente auto-limitada e, por conseguinte, um tratamento especial não é necessário. Os casos leves de gastroenterite podem ser eficazmente tratados por reidratação oral. Mais doenças graves podem ser tratados com antibióticos tais como tetraciclina ou ciprofloxacina 10. A mortalidade é de cerca de 2% para os casos de gastroenterite, mas pode ser tão elevado quanto 29% para os que desenvolvem infecção da corrente sanguínea ou a septicemia. Qualquer pessoa que consome frutos do mar ou tem ferida aberta exposta à água do mar está em risco de V. infecção parahaemolyticus. A forma mais grave da septicemia, doenças com risco de vida, é mais comum em uma subpopulação com o co médica subjacentenditions 11, que incluem alcoolismo, doença hepática, diabetes, doença renal, doença maligna, e outras condições que conduzem a uma resposta imune enfraquecido. Notavelmente, este grupo de indivíduos também está em maior risco de contrair doenças graves causadas por V. vulnificus, que pode ser encontrado em habitats naturais semelhantes a V. parahaemolyticus. V. parahaemolyticus é rotineiramente isolado utilizando ágar sais de ácido sacarose-tiossulfato-citrato biliares (TCBS) como um meio selectivo e diferencial. Enriquecimento em água peptonada alcalina pode preceder o isolamento em agar TCBS. colónias presumivelmente em TCBS são então testados em uma série de testes bioquímicos e / ou ensaios moleculares visando a presença de genes específicos da espécie. Métodos baseados em PCR são muitas vezes utilizados para confirmar a identidade de V. parahaemolyticus por amplificação do gene da hemolisina termolábeis, tlh 12. Independentemente do choice de métodos de confirmação, é importante dispor de um meio eficaz para isolar e diferenciar V. parahaemolyticus de outros vibrios marinhos em primeiro lugar. TCBS tem sido rotineiramente usado para diferenciar as espécies dentro do gênero Vibrio acordo com suas habilidades para fermentar sacarose 12. Reacção de fermentação positiva é acompanhada por uma mudança de cor do indicador de pH azul de bromotimol. V. colónias parahaemolyticus são bastante distinta em TCBS, exibindo azul para cor verde. No entanto, este meio não pode facilmente diferenciar V. alginolyticus e V. cholerae. espécies de Proteus-fermentação da sacarose podem produzir colónias amarelas se assemelham V. cholerae ou V. alginolyticus 13. No isolamento inicial em TCBS, V. parahaemolyticus também pode ser identificado erroneamente como Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides e Pseudomonas spp 14. As cepas com ferm sacarose adiadaentação pode ser confundida com outra sacarose não-fermentadoras, Vibrio 13, que incluem V. parahaemolyticus. TCBS foi encontrado para ser não é sensível contra Escherichia coli, putrefaciens Pseudomonas, entre outros. Várias outras espécies render verde para colónias cinzentas que são potencialmente confundidos com V. parahaemolyticus ou V. vulnificus 15. Como resultado, é desejável desenvolver meios alternativos com melhor sensibilidade e especificidade para detectar e isolar V. parahaemolyticus e outras espécies estreitamente relacionadas. Várias alternativas de mídia têm sido desenvolvidos recentemente. Para além da inclusão de agentes selectivos, mais incorporar substratos cromogénicos para diferenciar espécies com base nas suas actividades enzimáticas diferenciais. Por exemplo, o indoxil-β-glucósido e indoxil-β-galactósido têm sido usadas como os substratos cromogénicos para diferenciar V. páracolónias haemolyticus (que aparecem verde-azulado) dos de V. cholerae (roxo), devido às suas capacidades diferenciais para produzir β-glicosidase e β-galactosidase 16. Diferentes formulações de ágar cromogénico desenvolvidas por diversos grupos foram avaliados e foram relatados para executar comparável ou melhor do que TCBS 17,18,19. Uma vantagem de usar um meio cromogénico é que a coloração do meio circundante é mínima facilitando assim o isolamento de colónias particulares. Neste estudo, avaliou-se a capacidade de um meio cromogénico recentemente formulado para detectar e isolar V. cholerae, V. parahaemolyticus e V. vulnificus; com um foco especial sobre a sua capacidade para diferenciar V. parahaemolyticus a partir de outras espécies.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Reagent/Equipment</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-15-4</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclave</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BHI powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0418-17-7</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blender</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>to blend oyster meat</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CampyGen gas generator</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>CN035A</td>
			<td>to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chocolate agar plates</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>E14</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase)</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S50712</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S348903</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel doc</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HardyChrom Vibrio agar plates</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>G319</td>
			<td>This study evaluates this medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inoculating loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-606</td>
			<td>10 microliter-size was used in this study</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oysters</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R23701</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette and tips</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>Sterilized tips</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primers for tlh</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scale</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spreader</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-11</td>
			<td>Beads may be used instead</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stomacher blender</td>
			<td>Stomacher</td>
			<td >400</td>
			<td>Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec.&#160; Other homogenizer can be used.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile filter bags for blenders</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TCBS powder</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td >265020</td>
			<td>This study evaluates this medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermocycler</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TSB powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0370-07-5</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV viewing cabinet</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>Emit long-wave UV light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water bath</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td>Sources</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bacterial species and strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aeromonas hydrophila</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Candida albicans</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Campylobacter jejuni</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Escherichia coli</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proteus mirabilis</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Staphylococcus aureus</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Salmonella Choleraesuis</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Shigella boydii</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
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			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Shigella sonnei</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibrio alginolyticus</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars)</td>
			<td >FDA, ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. damsela</td>
			<td >FDA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. fisherii</td>
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			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. fluvialis</td>
			<td >CDC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. furnissii</td>
			<td >CDC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. hollisae</td>
			<td >FDA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. metschnikovii</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. mimicus</td>
			<td >FDA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. parahaemolyticus(serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc)</td>
			<td >ATCC, FDA, CDC, Environment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. proteolyticus</td>
			<td >FDA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. vulnificus</td>
			<td >FDA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a more sensitive and specific chromogenic agar medium for the detection of vibrio parahaemolyticus and other vibrio species

Infecções alimentares em os EUA causada por espécies de Vibrio têm mostrado uma tendência ascendente. No género Vibrio, V. parahaemolyticus é responsável pela maioria das infecções por Vibrio -associated. Assim, a diferenciação precisa entre Vibrio spp. e detecção de V. parahaemolyticus é extremamente importante para garantir a segurança do nosso abastecimento alimentar. Embora as técnicas moleculares são cada vez mais comuns, métodos, dependendo de cultura são ainda feito rotineiramente e são considerados métodos padrão em determinadas circunstâncias. Assim, um novo meio de agar cromogénico foi testado com o objectivo de proporcionar um melhor método para o isolamento e diferenciação de Vibrio spp clinicamente relevante. O protocolo de comparação do limite de sensibilidade, especificidade e de detecção para a detecção de V. parahaemolyticus entre o novo meio cromogénico e um meio convencional. Vários V. cepas parahaemolyticus (n = 22) reapresentando diversos sorotipos e fonte de origens foram utilizados. Eles foram previamente identificados pela Food and Drug Administration (FDA) e os Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC), e ainda mais verificada em nosso laboratório por tlh-PCR. Em pelo menos quatro ensaios independentes, estas estirpes foram inoculadas sobre os sais de agar-sacarose e tiossulfato-citrato-biliares cromogénicos (TCBS) de agar, que é a forma recomendada para a cultura desta espécie, seguido de incubação a 35-37 ° C durante 24 hr -96. Três V. cepas parahaemolyticus (13,6%) não cresceu de forma otimizada em TCBS, no entanto exibiram colónias verdes se houve crescimento. Duas cepas (9,1%) não deu as colônias ciano esperados no ágar cromogênico. V. não estirpes parahaemolyticus (n = 32) foram também testados para determinar a especificidade do ágar cromogénico. Entre estas estirpes, 31 não crescer ou exibiu outras morfologias colônia. A recuperação média de V. parahaemolyticus na chromogenic ~ ágar foi de 96,4% em relação ao agar de soja tríptica suplementado com 2% de NaCl. Em conclusão, o novo ágar cromogénico é um meio eficaz para detectar V. parahaemolyticus e diferenciá-lo de outros vibrios.

Neste estudo, 54 cepas microbianas foram montados, que incluiu 22 cepas dentro do V. espécies parahaemolyticus, 19 outras espécies de Vibrio, e 13 espécies de Vibrio não (Tabela 1). A maioria V. cepas parahaemolyticus ou foram recebidos de FDA, CDC ou de outros departamentos de saúde estaduais. Eles representam diversos sorotipos e fontes de isolamento. Estas estirpes foram previamente identificados pelos órgãos reguladores. Nós confirmou ainda as identidades destes V. parahaemolyticus através da realização de um tlh-PCR 21,22. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Espécies </td><td rowspan="2"> Número de estirpes testadas </td><td colspan="2"> Crescimento e cor das colónias </td></tr><tr><td> TCBS </td><td> Cmédio hromogenic </td></tr><tr><td rowspan="2"> Aeromonas hydrophila </td><td rowspan="2"> 2 </td><td rowspan="2"> Nenhum crescimento </td><td> Uma estirpe nenhum crescimento; </td></tr><tr><td> 1 estirpe cor magenta </td></tr><tr><td> Cândida albicans </td><td> 1 </td><td> Fraco crescimento, amarelo </td><td> Nenhum crescimento </td></tr><tr><td> Campylobacter jejuni </td><td> 1 </td><td> Nenhum crescimento </td><td> Nenhum crescimento </td></tr><tr><td> Escherichia coli </td><td> 1 </td><td> Nenhum crescimento </td><td> Fraco crescimento, magenta </td></tr><tr><td> Proteus mirabilis </td><td> 1 </td><td> Nenhum crescimento </td><td> Nenhum crescimento </td></tr><tr><td> Pseudomonas aeruginosa </td><td> 2 </td><td> Turquesa </td><td> Amarelo </td></tr><tr><td> Staphylococcus aureus </td><td> 1 </td><td> Fraco crescimento, amarelo </td><td> Nenhum crescimento </td></tr><tr><td> choleraesu Salmonellaé </td><td> 1 </td><td> Nenhum crescimento </td><td> Nenhum crescimento </td></tr><tr><td> boydii Shigella </td><td> 1 </td><td> Nenhum crescimento </td><td> Nenhum crescimento </td></tr><tr><td> Shigella flexneri </td><td> 1 </td><td> Nenhum crescimento </td><td> Nenhum crescimento </td></tr><tr><td> sonnei Shigella </td><td> 1 </td><td> Nenhum crescimento </td><td> Fraco crescimento, magenta </td></tr><tr><td> alginolyticus Vibrio </td><td> 3 </td><td> Amarelo ou azul-turquesa </td><td> Amarelo </td></tr><tr><td> V. cholerae </td><td> 4 </td><td> Amarelo ou azul-turquesa </td><td> Magenta </td></tr><tr><td> V. damsela </td><td> 1 </td><td> Turquesa </td><td> Cobalto </td></tr><tr><td> V. fisheri </td><td> 1 </td><td> Fraco crescimento, amarelo </td><td> Nenhum crescimento </td></tr><tr><td> V. fluvialis </td><td> 1 </td><td> Turquesa </td><td> Cobalto </td></tr><tr><td> V.furnissii </td><td> 1 </td><td> Amarelo </td><td> Amarelo </td></tr><tr><td> V. hollisae </td><td> 1 </td><td> Turquesa </td><td> Amarelo </td></tr><tr><td> V. metschnikovii </td><td> 1 </td><td> Nenhum crescimento </td><td> Nenhum crescimento </td></tr><tr><td> V. mimicus </td><td> 1 </td><td> Turquesa </td><td> Magenta </td></tr><tr><td> V. parahaemolyticus </td><td> 22 </td><td> A maioria das cepas turquesa </td><td> A maioria das cepas ciano; alguns clara </td></tr><tr><td> V. proteolyticus </td><td> 1 </td><td> Turquesa </td><td> Cobalto </td></tr><tr><td> V. vulnificus </td><td> 4 </td><td> Turquesa ou clara </td><td> Magenta </td></tr></tbody></table> Tabela 1. espécies microbianas utilizadas neste estudo e suas características de crescimento no meio selectivo e diferencial. Chamada a cores foi based em uma roda de cores. Cyan é semelhante ao teal; magenta é semelhante ao de lavanda rosada, turquesa é semelhante ao verde, amarelo abrange oliva e marrom. Quatro ensaios foram conduzidos para determinar a morfologia de crescimento e colónia destas estirpes no meio selectivo e diferencial - TCBS eo agar cromogênico. TCBS é a forma convencional utilizado para o isolamento de algumas espécies de Vibrio, incluindo V. cholerae e V. parahaemolyticus 12. Variação da cor das colónias cultivadas em TCBS era amarelo, turquesa (verde) ou clara (Figura 1). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54493/54493fig1.jpg" /> Figura 1. morfologia da colônia de Vibrio spp. em TCBS ágar. V. parahaemolyticus (turquesa), V. cholerae (amarelo), e am<html> ixed inoculação das duas espécies (a). Colónias de V. parahaemolyticus aparecem turquesa, com uma circular, inteira, e morfologia convexa (b). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54493/54493fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> A capacidade de um novo meio cromogénico para seleccionar espécies de Vibrio clinicamente relevantes de alimentos e amostras ambientais foi testado. Além disso, foi avaliada a capacidade desta forma para distinguir estas espécies simultaneamente uma da outra. Cor de colônia observado no agar cromogênico foram cobalto, ciano, magenta, amarelo ou claro (Figura 2). Como mostrado na Tabela 1, ambos TCBS e o ágar cromogénico exibiu certos graus de selectividade contra microorganismos não Vibrio. 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54493/54493fig2.jpg" /> Figura 2. morfologia da colônia de Vibrio spp. sobre o ágar cromogénico recentemente desenvolvido. V. parahaemolyticus (ciano), V. cholerae (magenta), e uma inoculação mista das duas espécies (a). Colónias de V. parahaemolyticus aparecem ciano, com uma circular, inteira, e morfologia convexa (b). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54493/54493fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Seguindo o método contagem padrão em placa em culturas durante a noite, colônias de V. parahaemolyticus foram observadas nas placas de agar cromogénicos receberem o maior factor de diluição (isto é, df = 10 -8). Estes resultados são comparáveis ​​àqueles em um meio não selectivo (CST). Isto sugere que o limite de detecção do meio cromogénico é semelhante ao meio não selectivo, que é de cerca de 10 células ou inferior, na ausência de matriz alimentar. A capacidade de detecção para outras espécies de Vibrio, como V. alginolyticus, V. fluvialis e V. donzela também foi decente em comparação com o meio não selectivo. No entanto, algumas estirpes de V. cholerae, V. vulnificus e V. mimicus rendeu 10 a 100 vezes menos de CFU no ágar cromogénico. Os agentes selectivos utilizados nos meios selectivos cromogénicos ou outros inevitavelmente inibir algumas células. células lesadas, por exemplo, não conseguiu recuperar em meio selectivo. No entanto, a capacidade de detecção ligeiramente mais pobre é um não-problema na maioria dos procedimentos de rotina que empregam uma etapa de enriquecimento. Pequena quantidade de microorganismos nos alimentos ou amostra ambiental seria multiplicar a um nível alto no caldo de enriquecimento, ultrapassando o limite de detecção. Enriquecimento em água alcalina peptona é often feito para determinar a prevalência de espécies de Vibrio em amostras ambientais 12. Na presença de homogenato de ostra, o ágar cromogénico continuou a apresentar um bom grau de recuperação. Em outras palavras, uma grande proporção (&gt; 70%) de V. parahaemolyticus células foram capazes de crescer em agar cromogénico, não afectada pela presença de matriz de ostra (Figura 3a). O crescimento e recuperação de V. parahaemolyticus células também não foi afectada pela presença de outras espécies Vibrio (Figura 3B). Este é um atributo importante porque as amostras ambientais são obrigados a conter diferentes espécies de Vibrio, que estão em números elevados, especialmente depois de um processo de enriquecimento. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54493/54493fig3.jpg" /> Figura 3. </strong&gt; percentual de recuperação de um V. estirpe parahaemolyticus em homogeneizado de ostra com e sem um concorrente bacteriana. A recuperação (média ± SD) foi calculado de acordo com o observado versus o CFU esperado contar com as placas de agar. contagem de CFU esperado foi calculada com base na carga bacteriana no inoculo. Alta recuperação de um V. parahaemolyticus tensão foi observada em todos os suportes sem competição (a). Nível semelhante de crescimento foi observado quando os níveis elevados de V. células metschnikovii estava presente (b). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54493/54493fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Para comparar ainda mais o ágar cromogénico e TCBS, foram calculados a sensibilidade e especificidade. A Tabela 2 mostra a capacidade de estes meios de comunicação para Accudamente identificar V. parahaemolyticus. Sensibilidade está relacionada com a percentagem de verdadeiros positivos, o que significa que o V. cepas parahaemolyticus rendeu a morfologia da colônia esperado na mídia. Especificidade está relacionada com a percentagem de verdadeiro negativo, o que significa que não V. cepas parahaemolyticus deve apresentar pobre ou nenhum crescimento, ou uma morfologia da colônia diferente do que V. parahaemolyticus. A sensibilidade e especificidade para TCBS para identificar V. parahaemolyticus foram 86,4% e 71,8%, respectivamente. Em comparação, a sensibilidade e especificidade do meio cromogénico foram de 90,9% e 96,9%, respectivamente. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> a) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> agar TCBS </td><td> V. parahaemolyticus </td><td> Non-V. parahaemolyticus </td></tr><tr><td> Bom crescimento e turquesa colonies </td><td> 19 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> colónias fraco crescimento ou não-turquesa </td><td> 3 </td><td> 23 </td></tr><tr><td> b) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> agar cromogênico </td><td> V. parahaemolyticus </td><td> Non-V. parahaemolyticus </td></tr><tr><td> Bons colónias de crescimento e ciano </td><td> 20 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> colónias fraco crescimento ou não-ciano </td><td> 2 </td><td> 31 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Sensibilidade e especificidade de TCBS (a) e cromogénico (b) de agar na detecção de V. parahaemolyticus. As identidades de V. parahaemolyticus foram previamente determinado por teste bioquímico e PCR tlh-.

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Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

Desenvolvimento de uma mais sensível e específica Cromogênico Agar para a detecção de<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; E outro<em&gt; Vibrio</em&gt; Espécies

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

development-more-sensitive-specific-chromogenic-agar-medium-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

14.4K visualizações.  California Polytechnic State University. Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium. 

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Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no fitness consequence (commensal), or be beneficial (mutualistic). While much attention has been given to pathogenic interactions, little is known about the processes that dictate the reproducible acquisition of beneficial/commensal bacteria from the environment. The light-organ mutualism between the marine Gram-negative bacterium V. fischeri and the Hawaiian bobtail squid, E. scolopes, represents a highly specific interaction in which one host (E. scolopes) establishes a symbiotic relationship with only one bacterial species (V. fischeri) throughout the course of its lifetime6,7. Bioluminescence produced by V. fischeri during this interaction provides an anti-predatory benefit to E. scolopes during nocturnal activities8,9, while the nutrient-rich host tissue provides V. fischeri with a protected niche10. During each host generation, this relationship is recapitulated, thus representing a predictable process that can be assessed in detail at various stages of symbiotic development. In the laboratory, the juvenile squid hatch aposymbiotically (uncolonized), and, if collected within the first 30-60 minutes and transferred to symbiont-free water, cannot be colonized except by the experimental inoculum6. This interaction thus provides a useful model system in which to assess the individual steps that lead to specific acquisition of a symbiotic microbe from the environment11,12.
Here we describe a method to assess the degree of colonization that occurs when newly hatched aposymbiotic E. scolopes are exposed to (artificial) seawater containing V. fischeri. This simple assay describes inoculation, natural infection, and recovery of the bacterial symbiont from the nascent light organ of E. scolopes. Care is taken to provide a consistent environment for the animals during symbiotic development, especially with regard to water quality and light cues. Methods to characterize the symbiotic population described include (1) measurement of bacterially-derived bioluminescence, and (2) direct colony counting of recovered symbionts.

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

The method outlines the procedure by which the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and its bacterial symbiont, Vibrio fischeri, are raised separately and then introduced to allow for specific colonization of the squid light organ by the bacteria. Colonization detection by bacterially-derived luminescence and by direct colony counting are described.

Colonização de Euprymna scolopes Squid por Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Imunologia e Infecção

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids (e.g. harboring pir-dependent or temperature-sensitive replicons1,2). These plasmids are integrated into bacterial chromosomes based on homology-mediated recombination. Such insertional mutants are often directly used in experimental settings. Alternatively, selection for plasmid excision followed by its loss can be performed, which for Gram-negative bacteria often relies on the counter-selectable levan sucrase enzyme encoded by the sacB gene4. The excision can either restore the pre-insertion genotype or result in an exchange between the chromosome and the plasmid-encoded copy of the modified gene. A disadvantage of this technique is that it is time-consuming. The plasmid has to be cloned first; it requires horizontal transfer into V. cholerae (most notably by mating with an E. coli donor strain) or artificial transformation of the latter; and the excision of the plasmid is random and can either restore the initial genotype or create the desired modification if no positive selection is exerted. Here, we present a method for rapid manipulation of the V. cholerae chromosome(s)5 (Figure 1). This TransFLP method is based on the recently discovered chitin-mediated induction of natural competence in this organism6 and other representative of the genus Vibrio such as V. fischeri7. Natural competence allows the uptake of free DNA including PCR-generated DNA fragments. Once taken up, the DNA recombines with the chromosome given the presence of a minimum of 250-500 bp of flanking homologous region8. Including a selection marker in-between these flanking regions allows easy detection of frequently occurring transformants.
This method can be used for different genetic manipulations of V. cholerae and potentially also other naturally competent bacteria. We provide three novel examples on what can be accomplished by this method in addition to our previously published study on single gene deletions and the addition of affinity-tag sequences5. Several optimization steps concerning the initial protocol of chitin-induced natural transformation6 are incorporated in this TransFLP protocol. These include among others the replacement of crab shell fragments by commercially available chitin flakes8, the donation of PCR-derived DNA as transforming material9, and the addition of FLP-recombination target sites (FRT)5. FRT sites allow site-directed excision of the selection marker mediated by the Flp recombinase10.

A quick method to modify the genome of V. cholerae is described. These modifications include the deletion of single genes, gene clusters and genomic islands as well as the integration of short sequences (e.g. promoter elements or affinity-tag sequences). The method is based on the natural transformation and FLP-recombination.

TransFLP - um método para modificar geneticamente<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Com base Transformação Natural e recombinação FLP-

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Em condições mais relevantes para o Pulmão Fibrose Cística

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Isothermal amplificação (lâmpada), Ensaios mediada por loop para detecção específica da espécie os de<em&gt; Eimeria</em&gt; Que infectam Galinhas

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

O Desenvolvimento da liofilizado Loop-mediadas isotérmicas de amplificação Reagentes para a detecção de<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

Visualização do carvão Agar resazurina Ensaio para a semi-quantitativa, médio rendimento enumeração de micobactérias

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Desenvolvimento de Células-Tronco de derivados de células T regulatórias antígeno específico da Contra Auto-imunidade

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

Uso da técnica de sobreposição de Soft-agar para triagem de compostos inibidores produzida por bactérias

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

Detecção e enriquecimento da Rare células B antígeno-específica para a análise do fenótipo e função

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.