El mejor principio de la espectroscopia de correlación de fluorescencia, FCS, se inventó inicialmente en la década de 1970. En la década de 1990, se establecieron mejoras importantes y muchas para el FCS mediante la combinación con una microscopía de aparatos confocales. Desde entonces, fcs se ha utilizado para muchas aplicaciones químicas y de curación de virus, tales como interacciones moleculares y análisis de agregación de proteínas.
La agregación de proteínas es un sello distintivo de los trastornos neurodegenerativos. El brillo de la fluorescencia son partículas individuales en acción de tamaños moleculares explicados por las propiedades de difusión. Es muy importante en la medición de las agregaciones de proteínas porque puede determinar los ciclos de vida proyectados de las moléculas, pero también distinguir la polimerización homo o hetero.
Aquí, presentamos un procedimiento para medir la difusión de esclerosis lateral amiotrófica asociada con proteína de forma agregada utilizando FCS en liatos celulares y células vivas. Prepare un plato de plástico de 100 milímetros creciendo la célula Neuro2a sentado cómodamente en el medio de crecimiento normal. Confirme la confluencia de la celda.
Retire el medio. Agregue 3,5 mililitros de solución Trypsin-EDTA en el tercer plato del cartucho e incubarlos a 37 grados centígrados durante un minuto. Añadir 9.5 mililitros medio de crecimiento normal en el plato y suspenderlos.
La suspensión celular se mezcla con tripa azul para manchar las células muertas. Agregue la suspensión a la diapositiva de recuento de celdas. Cuente el número de celdas que utilizan el contador de celdas o manualmente.
Compruebe el número de celda en vivo y su viabilidad. Diluir la célula en el medio contado a 1,0 por 10 a la potencia de 5 por mililitro. Agregue dos mililitros de suspensión celular en el plato de plástico de 35 milímetros para lisis celular o espacio de crecimiento para la medición de células vivas.
Incubar el plato a 37 grados centígrados por un día. Al día siguiente, prepare la mezcla de ADN plásmido y los reactivos de transfección. Agregue la mezcla de transfección al medio contada por células e incubar las células durante 24 horas.
Un día después. Compruebe la expresión GFP utilizando un microscopio de rutina. Se pueden ver los cuerpos de ingredientes TDP25 muy brillantes en las células.
La lisis celular debe realizarse en el banco bioquímico. Retire el medio del plato. Añadir dos mililitros de PBS a 25 grados centígrados para lavar como medio.
Retire el PBS. Coloque el plato en una placa de aluminio en la parte superior del hielo triturado. Inmediatamente, agregue el amortiguador de lisis de 200 microlitros en el plato.
Raspa el plato usando un rascador de celdas. Recupere el lysate con restos celulares no resueltos en un nuevo tubo de 1,5 milímetros. Centrífuga el lysate a cuatro grados centígrados.
Para las mediciones de células vivas, reemplace el medio por uno nuevo antes de la medición. Compruebe el accesorio de celda utilizando un microscopio de contraste de fase. Además, compruebe la expresión GFP utilizando un microscopio de fluorescencia.
Utilice un sistema FCS combinado con microscopio confocal. Encienda el láser de 488 nanómetros. Estabilizar el sistema, al menos, durante 30 minutos.
Configure la ruta óptica. Utilice un láser de 488 nanómetros para la luz instantánea. Utilice un divisor de haz adecuado y medidores dichroic.
Y también, fusibles de fluorescencia. Por lo general, usaremos cámaras de vidrio de cubierta para calibración y mediciones de soluciones. Cuidado, toma la cámara de reloj de cubierta.
Coloque la superficie de vidrio en el papel de cribado de la lente. Vierta la calibración FCS. Añadir la solución Rhodamine 6G en, así.
Añade el agua ultrapura al objetivo. No utilice el aceite. Ajuste la cámara en el escenario del microscopio.
Mueva el escenario a la posición adecuada. Cree el ajuste del agujero y abra el asistente de ajuste del agujero. Monitoree la tasa de recuento de fotones como movimiento grueso del agujero para la dirección X.
La posición más brillante estaba determinada con razón. A continuación, supervise la tasa de recuento de fotones como movimiento fino. La posición más brillante se determinó con éxito Esta es la posición del agujero para la dirección X.
De la misma manera, busque la posición más brillante del agujero para la dirección y. La posición más brillante para la dirección y también se determinó con éxito. Agravar la posición x e y del agujero.
Es mejor ajustar la posición del agujero antes de la medición de cada día. Cuando se cambia la ruta de acceso en vivo, la posición del agujero debe ajustarse de nuevo. Cree una tasa de recuento y supervise la velocidad de recuento de teléfono.
Cambie al modo de supervisión CPM. Cuente el anillo de corrección del objeto que ejecutó para que el valor CPM sea el más alto. Cierre la ventana de velocidad de recuento.
Comience con la medición de la solución Rhodamine 6G. Una vez completada la medición, haga clic en el ajuste para realizar el análisis de ajuste de curva. Seleccione un modelo para el ajuste de la función de correlación anterior.
Para Rhodamine 6G, seleccione el modelo para difusión de 1 componente y 3 dimensiones con un estado de trillizos. Ajuste la hora de inicio de la conexión moviendo la línea roja. Haga clic en Ajustar todo para iniciar el cálculo del empalme.
Compruebe la desviación de ajuste. Asegúrese de que los lados estén registrados y sean negativos, alrededor de cero. Compruebe los valores ajustados.
Asegúrese de que el tiempo de difusión esté aproximadamente en el rango de 20-30 microsegundos. Además, el parámetro estructural es de cuatro a ocho. Abra el panel de ajuste y seleccione un modelo para la medición.
Introduzca el mismo valor de parámetro estructural en el modelo para la muestra en el panel de ajuste. Asegúrese de que el tipo debe establecerse como Fijo. Medición GFP-TDP25 en lysate celular.
Coloque el lysate en la cámara de vidrio de cubierta. Coloque la tapa para evitar el secado del lisato. Coloque la tapa del escenario para un sombreado ligero.
En el panel de adquisición, establezca la potencia láser, el tiempo de medición y sus repeticiones. Comience la adquisición. Se observó un pico.
Se volvió a observar un pico. El pico indica moléculas brillantes pasadas a través del cuerpo de detección. Los picos indican oligomeros solubles o agregados.
Cree un ajuste para realizar el análisis de ajuste de curvas. Seleccione el modelo para difusión de 2 componentes y 3 dimensiones con estado de trillizos. Ajuste la hora de inicio de la conexión.
Haga clic en ajustar todo. Compruebe los valores ajustados. SOD1-G85R etiquetado con medición GFP en una celda viva.
A diferencia de la medición de la solución, recomiendo usar la incubadora de etapa de calor. Poner el plato de culto celular en el escenario del microscopio. Confirme el enfoque y la posición utilizando el ocular.
Seleccione una celda de medición. Acerque y ajuste la posición de la celda mediante un modo de escaneo rápido. Adquiera la instantánea de las celdas utilizando el modo de velocidad de escaneo lenta.
Seleccione una posición de medición fcs utilizando la herramienta Posición. El punto de mira indica la posición de medición. Inicie la medición.
La ligera disminución del registro de tasa de recuento de fotones sugiere la fotobleaching de GFP. Realice el ajuste de curva. Se muestran los resultados representativos de GFP-TDP25 en el lysate celular.
El gráfico superior un registro de la tasa de recuento de fotones. Donde hay flechas es un pico, lo que sugiere oligómeros solubles y agregados. El gráfico central representa la función de correlación anterior.
La línea gris muestra la función de correlación baja y antigua. La línea magenta muestra la función ajustada. Las líneas punteadas indican los tiempos de inicio y finalización para el montaje.
La tabla inferior muestra el valor ajustado. A continuación, se muestran los resultados representativos de SOD1-G85R-GFP en una celda en vivo. El gráfico superior representa un registro de nuestra tasa de recuento de fotones.
Se observó la disminución gradual de la tasa de recuento de fotones registrados, lo que sugiere fotobleaching de crecimiento de GFP para diferentes mediciones. Esto se debe a la velocidad de difusión lenta en las células vivas. El gráfico central representa la antigua función de correlación de SOD1.
La línea gris muestra la función de correlación baja y antigua. La línea magenta muestra la función ajustada. Las líneas punteadas indican los tiempos de inicio y finalización con el empalme.
La tabla inferior muestra los valores ajustados. Aquí te mostramos este procedimiento para medir la difusión de cada célula asociada TDP-25 en el lysato celular y todo mutante de SOD1 en células vivas usando FCS. Los oligomeros solubles y la agregación en el lisato celular a menudo se pueden observar como picos o ráfagas.
Por otro lado, en las células vivas, tales picos rara vez se observan, excepto por estructuras vivas posiblemente obvias. Una especie lentamente difusible de SOD1 mutante añade brillo medio para partículas individuales como la homopolímerización SOD1 en su interior para nosotros. El procedimiento que se muestra aquí es simple y vale la pena.
El FCS no contiene radiación; estado directamente inactivo. Es sólo tu,y nuestra.empatía de imaginación.
