The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.

Todos los procedimientos fueron aprobados y realizados de acuerdo con el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional Vanderbilt. 1. El etiquetado con fluoróforo COI (Opcional) <ol><li> Elija un colorante fluorescente que reaccionará con una amina primaria libre (por ejemplo, en una proteína), tales como ésteres de succinimidilo o derivados de fluoresceína, para visualizar la carga de las microesferas. Disolver exceso molar 8x (con relación a moles de COI) de fluoróforo en 200 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO). </li><li> Resuspender 50 mg de COI hasta un volumen final de 800 l en una solución de vehículo (concentración final de 62,5 ng / l). La solución de vehículo variará dependiendo de la fuente de la COI. NOTA: El vehículo típico soluciones incluyen solución salina tamponada con fosfato (PBS) o DMSO. </li><li> Añadir toda la solución de fluoróforo / DMSO del paso 1.1 y resuspender el COI. Vortex durante la noche a 4 ° C. Alternativamente, vórtice la mezcla de reacción a temperatura ambiente(RT) durante 4 h. </li><li> Después de la reacción de marcaje, eliminar el exceso de fluoróforo utilizando una columna de desalado. <ol><li> Escurrir tampón de almacenamiento de la columna de desalación y enjuague con 16 ml de agua desionizada. Desechar todo el flujo a través. </li><li> Añadir el COI marcado con fluorescencia a la columna de desalado. Eluir con 1,2 ml de agua desionizada y se recoge el flujo a través. </li><li> etapa de elución repetir un adicional de cuatro veces, cada vez añadiendo 1,2 ml de agua desionizada y recoger el flujo a través de como una muestra separada. </li><li> Congelar todo el flujo de recogida a través de las muestras a -80 ° C y liofilizar según las instrucciones del fabricante para las 24 horas. </li></ol></li></ol> 2. COI-cargada de microesferas Preparación través del agua de agua-en-aceite-en-Emulsión disolvente de evaporación Método <ol><li> Añadir 1 COI mg de marcado con fluorescencia a 100 l de agua desionizada para formar la primera fase de agua (W1). </li><li> Disolver 65 mg de poli (aci láctico-co-glicólicod) (50:50 lactida: glicolida, peso molecular 54.000 - 69.000) en 750 l de diclorometano en un tubo de microcentrífuga. Ultrasonicate de 10 a 30 seg (a 160 W) para disolver completamente el PLGA. Esto forma la fase de aceite (O). </li><li> Añadir toda la fase W1 generado en la etapa 2.1 a la fase O de una manera gota a gota. Emulsionar usando un homogeneizador de mano a 20.000 rpm durante 30 segundos para formar la fase W1 / O. </li><li> Añadir toda la fase de E / S W1 de una manera gota a gota a 15 ml de una 1% (peso / volumen) de poli acuoso (alcohol de vinilo) de solución (PVA) y emulsionar utilizando un homogeneizador de mano a 20.000 rpm durante 30 sec . </li><li> Transferir todo de la emulsión generada en la etapa 2.4 a un 200 ml matraz de fondo redondo y sujeto a un 635 mm Hg de vacío usando un evaporador rotatorio durante 1 hora para eliminar el disolvente y generar la fase acuosa. </li><li> Alícuota de 1 ml de la fase acuosa generado en la etapa 2.5 a catorce tubos de microcentrífuga. Centrifugación de la solución acuosa en los tubos de microcentrífuga a 7500g durante 8 min. NOTA: En este paso, las microesferas están presentes en la solución acuosa remanente y se concentran a la parte inferior del tubo de microcentrífuga. </li><li> Retire cuidadosamente 900 l de solución acuosa a partir de los tubos de microcentrífuga con una micropipeta, de pipeteado con el fin de no molestar a las microesferas en el fondo del tubo de microcentrífuga. <ol><li> Se lavan las microesferas de exceso de PVA por adición de 1 ml de agua desionizada a cada tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 7500 xg durante 8 min, y de nuevo retirar con cuidado 900 l de solución acuosa a partir de los tubos de microcentrífuga con una micropipeta, de pipeteado con el fin de no molestar a las microesferas en el fondo del tubo de microcentrífuga. NOTA: La solución acuosa de 100 l restante contiene las microesferas generados. </li></ol></li><li> Congelar la solución acuosa de microesferas generada en el paso 2.7 a -80 ° C. </li><li> microesferas liofilizar utilizando un liofilizador de acuerdo con el fabricante delinstrucciones y almacenar a -20 ° C. NOTA: medir la eficiencia de carga de la COI disolviendo completamente microesferas de PLGA y la determinación de la concentración de proteína en relación con una curva estándar de la proteína libre 7. </li><li> Como control negativo, generar un lote de microesferas &quot;en blanco&quot; (en lo sucesivo, microesferas de control). NOTA: La generación de microesferas de control es idéntica a la generación de microesferas cargadas-COI hidrófilos, sin adición COI a 800 l de la solución de vehículo en el paso 1.2. partículas de control de ajuste de la concentración de masa de PLGA en relación con microesferas de PLGA cargadas-COI para el ensayo de mitógeno de las células β. </li></ol> 3. Preparación de los islotes Medios de cultivo y medios de comunicación pre-ensayo <ol><li> Preparar 200 ml de medio para el cultivo de islotes de ratón intactas: RPMI 1640 suplementado con glucosa 11 mM, 10% de suero de caballo, 100 U / ml de penicilina G y 100 mg / ml de estreptomicina (en lo sucesivo, esdejar que los medios de cultivo). NOTA 1: A diferencia de suero fetal bovino (FBS), suero de caballo carece de lactógeno placentario, un inductor de la proliferación de células β, que confunde análisis en el ensayo de proliferación. NOTA 2: Como las microesferas de PLGA no se esterilizan antes de su uso, la adición de antibióticos al medio de cultivo es crucial para evitar la contaminación microbiológica. </li><li> Retire 25 ml de medio de cultivo de islotes con una pipeta electrónica y colocar en un tubo cónico de 50 ml. Suplemento los 25 ml de medios de cultivo de los islotes en el tubo cónico de 50 ml con una concentración final de EGTA 0,2 mM para generar los medios de pre-ensayo. NOTA: La adición de EGTA afloja ligeramente contactos célula-célula en los islotes sin alterar la arquitectura de los islotes. Esto ayuda a asegurar la COI puede llegar a las células internas del islote y ayuda a prevenir la necrosis de la isleta central. </li></ol> 4. El cultivo de islotes intactos mouse <ol><li> Aislar islotes intactos de una cepa pre-seleccionado, sexo, age, y el genotipo de los ratones después de una digestión con colagenasa de rutina del 8,9 páncreas. Piscina islotes juntos desde como muestras. </li><li> Alícuota de 40 islotes en un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos en 200 l de medio de cultivo de los islotes. islotes de tamaño de los partidos visualmente por pocillo (una evaluación precisa de la equivalencia de los islotes (IEQ) entre las muestras no es necesario). Llenar los pozos vacíos inmediatamente adyacentes a los pozos con islotes con 200 l de agua estéril para amortiguar los problemas de evaporación. Cultura islotes en los medios de comunicación durante la noche a 37 ° C bajo una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO 2. </li></ol> 5. Re-suspensión de microesferas de control de PLGA cargadas con los países de origen y <ol><li> Después de la recuperación de los islotes durante la noche, las microesferas de volver a suspender mediante la adición de medios de pre-ensayo a una alícuota de liofilizados microesferas de PLGA cargadas con COI de tal manera que la concentración final de COI en el tubo de microcentrífuga es 10 ng / l (la cantidad de COI presente en una cantidad dada de los micros generadosFeres se determinó en el paso 2.9). Sonicar las microesferas cargadas-COI volvió a suspender en un baño de agua con hielo durante 10 minutos a 160 W con pulsos largos de 10 segundos a 4 ° C. </li><li> Resuspender de control de PLGA microesferas añadiendo el mismo volumen de medio pre-ensayo a una masa igual de control liofilizado microesferas de PLGA. Sonicar las microesferas resuspendidas control de PLGA en un baño de agua con hielo durante 10 minutos a 160 W con pulsos largos de 10 segundos a 4 ° C. </li><li> confirmar visualmente microesferas se dispersan con la pipeta 2 l de microesferas resuspendidas entre dos portaobjetos de vidrio. Visualizar microesferas utilizando un objetivo 40X en un microscopio de epifluorescencia o campo claro. </li><li> Si la agregación significativa de las microesferas es aún visible, se somete a ultrasonidos en un baño de agua con hielo durante otros 10 min a 160 W con pulsos largos de 10 segundos a 4 ° C y repita la visualización de microesferas resuspendidas. </li></ol> 6. Tratamiento de los islotes con control de PLGA microesferas cargadas con los países de origen o &lt;/ P&gt; <ol><li> Para cada pocillo para ser tratados con microesferas cargadas-COI, preparar medio de ensayo diluyendo el 10 ng / l de las microesferas resuspendidas COI con los medios de pre-ensayo para un volumen final de 100 l y una concentración final predeterminado. NOTA: La concentración final óptima de la proteína variará para cada COI utilizado para este ensayo. Idealmente, una gama de concentraciones finales se prueban. </li><li> Para cada pocillo para ser usado como control, preparar los medios de ensayo de control mediante la dilución de los de control resuspendidos microesferas de PLGA generados en la etapa 5.2 con el mismo volumen de dilución usado para diluir las microesferas cargadas con COI en el paso 6.1. NOTA: Los islotes tratados con medio de ensayo de control servirán como control negativo para permitir la detección de cualquier efecto de las microesferas en blanco pueden tener sobre los resultados experimentales. </li><li> Retire cuidadosamente 100 l de medio de cultivo de los islotes de cada pocillo con una micropipeta de tal manera que no hay islotes se desprenden de los pozos. añadir con cuidado 100 μl de medio de ensayo o 100 l de medio de ensayo de control a cada pocillo. </li><li> Incubar islotes a 37 ° C bajo una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO 2 durante tres días. </li></ol> 7. La dispersión de los islotes intactos Onto portas de microscopio <ol><li> Después de tres días, utilizar una micropipeta para retirar cuidadosamente y deseche medio de ensayo de todos los pozos de modo que no se desprenda islotes. añadir con cuidado 200 l de PBS a los islotes de lavarlas del medio de ensayo. Con cuidado, retirar y desechar PBS con una micropipeta y lavar suavemente islotes de nuevo con un 200 l de PBS adicional. </li><li> Retire y deseche PBS con una micropipeta y añadir 100 l de 0,025% de tripsina, la solución 2 mM de EDTA. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Pipet islotes en la solución de tripsina-EDTA arriba y hacia abajo cada 2 min hasta islotes se confirman visualmente a ser dispersados ​​en células individuales (tenga en cuenta que algunos pequeños grupos de células pueden todavía estar presente) utilizando un microscopio de luz. Transferir la totalidad del volumen de cada pozo individualLy en tubos de microcentrífuga labeled-. </li><li> Añadir 400 l de medio de cultivo de los islotes a cada tubo de microcentrífuga para detener la disociación celular de tripsina mediada. </li><li> Centrifugar las muestras durante 5 minutos a 100 xg a 4 ° C para sedimentar las células de los islotes a la parte inferior de los tubos de microcentrífuga. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante con micropipeta, y el sedimento se vuelve a suspender en 200 medios de cultivo de islotes l fresco. </li><li> Usando una cito-centrífuga, centrífuga disociado islotes a 140 xg durante 3 min en portaobjetos de microscopio cargados. </li><li> Air secar los portaobjetos a TA durante 10 minutos, a continuación, dibuje un cuadro alrededor de los islotes disociadas con un rotulador hidrófobo. </li><li> Fijar las células con 75 l 4% de paraformaldehído (PFA) a TA durante 10 min. Retire el 4% PFA y lavar suavemente las células en 75 l de PBS dos veces. Después del lavado, permeabilizar las células con 75 l 0,2% de Triton X-100 en PBS durante 10 min. A continuación, lavar las células con 75 l de PBS. Precaución: PFA se sabe que es alergénica cancerígenos y tóxicos. </li></ol&gt; 8. La inmunofluorescencia etiquetado de los islotes disociada de la insulina y el marcador de proliferación celular, Ki67 <ol><li> Preparar una cámara húmeda mediante la colocación de dos toallas de papel húmedo en el fondo de una caja portaobjetos de microscopio capacidad 100 de diapositivas. </li><li> Lugar se desliza hacia abajo planas (células hacia arriba) en la cámara húmeda. Preparar las muestras para el etiquetado mediante la aspiración de la PBS de la etapa de lavado anterior utilizando una micropipeta y la adición de 75 l de solución de bloqueo (5% normal burro suero (NDS) en PBS) a cada diapositiva para bloquear la unión no específica de anticuerpos a las muestras. Incubar los portaobjetos en solución de bloqueo durante 1 hora a RT. </li><li> Suavemente aspirado de solución de bloqueo utilizando una micropipeta y añadir 75 l de solución de anticuerpo primario que contiene de cobaya anti-insulina y anticuerpos de conejo anti-Ki67, se diluyó 1 mg / ml en 5% NDS en PBS. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hr. NOTA: Los marcadores alternativos de proliferación celular incluyen la proliferación de núcleos de células antígeno (PCNA) y phosphohistone H3 (PH3), </li><li> Se aspira suavemente la solución de anticuerpo primario utilizando una micropipeta y enjuagar las células con 75 l de PBS. Aspirar PBS utilizando una micropipeta y enjuagar las células dos veces más, cada vez con 75 l de PBS. Incubar cada muestra con 75 l anti-conejillo de indias Cy5 y anticuerpo secundario anti-conejo Cy3 anticuerpo secundario diluido a 2 g / ml en solución de bloqueo durante 1 hora a RT. NOTA: No utilizar anticuerpos secundarios marcados con el mismo o superposición espectral fluoróforo que ya se utiliza para etiquetar las microesferas. </li><li> solución de anticuerpo secundario Aspirar utilizando una micropipeta y se incuban en 75 l de 300 nM DAPI en PBS durante 3 min a TA. Aspirar DAPI utilizando una micropipeta y enjuague en agua desionizada durante 5 min. </li><li> Se aspira suavemente el agua de las muestras utilizando una micropipeta. Detectar una gota (aproximadamente 100 l) de la solución de montaje de secado rápido que contiene antifade reactivo sobre un cubreobjetos de vidrio. Invertir el lado microscopio muestra de deslizarse hacia abajo, ore a la solución de montaje. Presione suavemente el cubreobjetos contra el portaobjetos con una punta de pipeta para eliminar las burbujas y limpie el exceso de líquido con un tejido suave de limpieza. Permitir cubreobjetos de secar durante la noche a TA. </li></ol> 9. Adquisición de imágenes y análisis <ol><li> Utilizar un microscopio de epifluorescencia con una cámara adjunta para la adquisición de imágenes. Para cada fluoróforo, determinar el tiempo óptimo de exposición (normalmente 20 ms para DAPI, 40 - 80 mseg para la insulina, y 250 ms para Ki67). Asegúrese de parámetros de adquisición de imágenes son iguales para todas las muestras. </li><li> Para cada muestra, contar manualmente 3.000 células positivas para insulina y de los que contar cuántas son también Ki67 positivo. Sólo contar las células positivas para insulina que tienen un núcleo bien definido y claramente visible. Calcular el porcentaje de la proliferación de las células ß para cada muestra dividiendo el número de las células Ki67 positivas / positivas para insulina por el número total de células positivas para insulina y multiplicando por 100. </li><li> después dara determinar el porcentaje de la proliferación de las células ß para cada muestra, determinar si existe una diferencia estadísticamente significativa en la proliferación de células β entre el control y las muestras experimentales mediante el análisis de los resultados con un ANOVA de una vía utilizando el software estadístico comercialmente disponible. </li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-responsive+microspheres+for+on+demand+antioxidant+therapy+in+a+model+of+diabetic+peripheral+arterial+disease.">ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease.</a> Biomaterials. 41, 166-175 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

El estudio de la proliferación de células β en cultivo típicamente se ve obstaculizada por varias dificultades. En primer lugar, las líneas de células inmortalizadas β se caracterizan por grados más altos de proliferación de lo que se encuentra en las células beta en los islotes endógenos en vivo. Además, estas líneas celulares inmortalizadas carecen de la arquitectura normal crítico para la función de las células β normal. Estos dos hechos hacen que sea difícil determinar si los resultados obtenidos u...

células ß pancreáticas son las únicas células productoras de insulina en el cuerpo y son críticos para mantener la homeostasis de glucosa en sangre. Mientras que los individuos sanos tienen suficiente masa de células β y la función de regular adecuadamente la glucosa en sangre, las personas con diabetes se caracteriza por la masa de células β insuficiente y / o función 1,2. Se ha propuesto que la inducción de la proliferación de células β última instancia, puede aumentar la masa de células β y restaurar la homeostasis de la glucosa en individuos con diabetes 3. Sin embargo, la evaluación y validación de los posibles compuestos de proliferación de células β en los islotes intactos es necesario antes de terapias eficaces se pueden desarrollar. El trasplante de islotes de cadáveres humanos en los individuos con diabetes restaura la homeostasis de la glucosa en sangre durante un tiempo, pero la disponibilidad y el éxito de este procedimiento experimental se ve obstaculizada por la escasez de islotes humanos disponibles para el trasplante y la muerte de las células beta en los islotes de popatrasplante er 4. Incluso con el descubrimiento de los factores que inducen la multiplicación de las células productoras de insulina, un reto importante todavía existe en la entrega de estos factores a sitios relevantes in vivo. Una estrategia para la entrega local sostenida de compuestos de proliferación de células β es el poli (láctico-co-glicólico) (PLGA). PLGA tiene una historia de uso en productos aprobados por la FDA de administración de fármacos debido a su alta seguridad, biodegradabilidad, y la cinética de liberación prolongada 5. Específicamente, PLGA es un copolímero de lactida y glicolida que se degrada por hidrólisis con agua, ya sea in vivo o en cultivo en ácido láctico y ácido glicólico, que son metabolitos de origen natural en el cuerpo. El compuesto fármaco encapsulado puede ser liberado en el medio ambiente circundante tanto por difusión y / o mecanismos de liberación de degradación controlada. La encapsulación de COI proporciona protección contra la degradación enzimática, mejorar la biodisponibilidad del reactivo en comparación con unencapsulaTed COI 5. Sugerimos que microesferas de PLGA se pueden utilizar para administrar compuestos candidatos a islotes intactos en cultivo, y en última instancia en vivo. Prueba de la eficacia de PLGA para administrar los mitógenos de las células β de los islotes ex vivo es crítico antes se exploran los protocolos de trasplante. Actualmente, no existe una técnica para medir la proliferación de células β de animales vivos. Los experimentos para evaluar la eficacia de los compuestos potenciales de proliferación in vivo, por tanto, requiere la administración de estos compuestos a los animales vivos, con la disección posterior y el procesamiento de los páncreas de inmunomarcación. Tales protocolos son caros y laboriosos y requieren que el compuesto se administra por vía sistémica, sin ninguna garantía de que van a llegar a los islotes. Por el contrario, varias líneas de células inmortalizadas β están disponibles para el estudio de las células productoras de insulina en la cultura, pero estas líneas celulares carecen de la arquitectura de los islotes y ambient encuentra en los organismos que viven 6. Líneas de células inmortalizadas β también se caracterizan por tener un grado mucho más alto de replicación de las células beta endógenas in vivo, por lo tanto el análisis de compuestos que inducen la proliferación de complicación. En este estudio, se describe un protocolo que utiliza islotes intactos aisladas de ratones adultos. A diferencia de las líneas de células β, islotes intactos conservan la arquitectura normal de los islotes. Asimismo, en contraste con los experimentos llevados a cabo in vivo, la administración de compuestos proliferativos directamente a islotes intactos cultivadas reduce significativamente la cantidad de reactivos que es necesario medir con precisión la proliferación de células β. El estudio actual utiliza PLGA para administrar un COI, en este ejemplo, el factor recombinante humano de crecimiento de tejido (rhCTGF). El método descrito aquí confiere una ventaja significativa sobre la administración del compuesto en bruto a los islotes cultivadas ya que permite una liberación continua del compuesto en THmedios electrónicos. En particular, este ensayo puede ser modificado para administrar una amplia variedad de proteínas y anticuerpos de interés a los islotes intactos. Efectos en otros tipos de células endocrinas, incluyendo las células alfa, también pueden analizarse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="819">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">O6149</td>
			<td style="width:307px;">For labeling COI with fluorophore</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td style="width:179px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">BP231-1</td>
			<td>For dissolving fluorophore in step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Disposable PD-10 Desalting Columns</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0851-01</td>
			<td>Desalting column used in step 1</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000-69,000</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">739960</td>
			<td>Used in generation of microspheres in step 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000-98,000</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">341584</td>
			<td>Used in generation of microspheres in step 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11879-020</td>
			<td>For culturing islets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dextrose Anhydrous</td>
			<td style="width:179px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">200-075-1</td>
			<td>Supplement for islet media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td>Antibiotics for islet media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Normal horse serum</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">008-000-121</td>
			<td>Supplement for islet media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well tissue culture plate</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3603</td>
			<td>For culturing islets</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4378</td>
			<td>Supplement for pre-assay islet media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytospin 4 Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A78300003</td>
			<td>For spinning cells onto microscope slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EZ Single Cytofunnel</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A78710020</td>
			<td>For spinning cells onto microscope slides</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:179px;">Fisher BioReagents</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td>Used in dissociating islets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>For fixing cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton&#160; X-100</td>
			<td style="width:179px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">BP151</td>
			<td>For permeabilizing cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Normal donkey serum</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">017-000-121</td>
			<td>Blocking reagents for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Ki67 antibody</td>
			<td style="width:179px;">abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab15580</td>
			<td>For Ki67 immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin</td>
			<td style="width:179px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">A0564</td>
			<td>For insulin immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">711-165-152</td>
			<td>For Ki67 immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">706-175-148</td>
			<td>For insulin immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>For nuclei visualization in immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aqua-Mount</td>
			<td style="width:179px;">Lerner Laboratories</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13800</td>
			<td>Fast drying mounting media</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">FreeZone -105&#176;C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System</td>
			<td style="width:179px;">Labconco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">7382020</td>
			<td>For lyophilization of microspheres</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sustained administration of &#946;-cell mitogens to intact mouse islets ex vivo using biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres

El desarrollo de biomateriales ha aumentado significativamente el potencial para la entrega dirigida de fármacos a una variedad de tipos de células y tejidos, incluyendo las células ß pancreáticas. Además, las partículas de biomateriales, hidrogeles, andamios y también proporcionan una oportunidad única para administrar sostenida, la administración de fármacos controlable para ß-células en cultivo y en modelos de tejidos trasplantados. Estas tecnologías permiten el estudio de los factores de proliferación de células β candidato utilizando islotes intactos, así como un sistema de traslación correspondiente. Por otra parte, la determinación de la eficacia y la viabilidad de los factores de candidatos para estimular la proliferación de las células β en un sistema de cultivo es fundamental antes de seguir adelante con los modelos in vivo. Aquí se describe un método para co-cultivo de islotes de ratón intactas con el compuesto biodegradable de interés (CDI) poli RESORTE (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) con el fin de evaluar los efectos de la liberación sostenida in situ ofactores mitogénicos f sobre la proliferación de las células β. Esta técnica se describe en detalle cómo generar microesferas de PLGA que contienen una carga deseada usando reactivos disponibles comercialmente. Mientras que la técnica descrita utiliza el factor recombinante humano de crecimiento de tejido (rhCTGF) como un ejemplo, fácilmente se podría utilizar una amplia variedad de COI. Además, este método utiliza placas de 96 pocillos para reducir al mínimo la cantidad de reactivos necesarios para evaluar la proliferación de células β. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para utilizar biomateriales alternativos y otras características de las células endocrinas, tales como la supervivencia celular y el estado de diferenciación.

La Figura 1 es una representación visual de las microesferas generadas utilizando el protocolo anterior. El protocolo descrito aquí produce microesferas cargadas con rhCTGF de varios tamaños. La mayor fracción de microesferas estará entre 1 y 10 micras de diámetro, aunque algunas microesferas pueden ser más grandes (Figura 2). Si se desea, el tamaño de las microesferas se puede ajustar y optimizado sobre la base de parámetros de...

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Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Administración sostenida de mitógenos de células β de los islotes intactos mouse<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Uso Biodegradable poli (ácido láctico-co-glicólico) Microesferas

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

sustained-administration-cell-mitogens-to-intact-mouse-islets-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.2K vistas.  Vanderbilt University Medical Center. Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.

Video: Sustained Administration of β-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

3D de alta resolución de imagen de Ex-Vivo Muestras Biológicas por Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Investigación

Bioingeniería

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional (3D) tissue wherein hematopoiesis is regulated by spatially organized cellular microenvironments termed niches2-4. The organization of the BM niches is critical for the function or dysfunction of normal or malignant BM5. Therefore a better understanding of the in vivo microenvironment using an ex vivo mimicry would help us elucidate the molecular, cellular and microenvironmental determinants of leukemogenesis6.
Currently, hematopoietic cells are cultured in vitro in two-dimensional (2D) tissue culture flasks/well-plates7 requiring either co-culture with allogenic or xenogenic stromal cells or addition of exogenous cytokines8. These conditions are artificial and differ from the in vivo microenvironment in that they lack the 3D cellular niches and expose the cells to abnormally high cytokine concentrations which can result in differentiation and loss of pluripotency9,10.
Herein, we present a novel 3D bone marrow culture system that simulates the in vivo 3D growth environment and supports multilineage hematopoiesis in the absence of exogenous growth factors. The highly porous scaffold used in this system made of polyurethane (PU), facilitates high-density cell growth across a higher specific surface area than the conventional monolayer culture in 2D11. Our work has indicated that this model supported the growth of human cord blood (CB) mononuclear cells (MNC)12 and primary leukemic cells in the absence of exogenous cytokines. This novel 3D mimicry provides a viable platform for the development of a human experimental model to study hematopoiesis and to explore novel treatments for leukemia.

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

A 3D culture system for hematopoiesis is described using human cord blood and leukemic bone marrow cells. The method is based on the use of a porous synthetic polyurethane scaffold coated with extracellular matrix proteins. This scaffold is adaptable to accommodate a wide range of cells.

Ex vivo mimetismo de la hematopoyesis humano normal y anormal

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional ...

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia6,8-10.
Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways16,23 and parenchyma17,22 of animal models and in vivo human airway14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)18. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described19. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface17.
While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology24. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

A method to image ex vivo pulmonary resection specimens with optical frequency domain imaging (OFDI) and obtain precise correlation to histology is described, which is essential to developing specific OFDI interpretation criteria for pulmonary pathology. This method is applicable to other tissue types and imaging techniques to obtain precise imaging to histology correlation for accurate image interpretation and assessment. Imaging criteria established with this technique would then be applicable to image assessment in future in vivo studies.

Frecuencia de imagen óptica de dominio de<em&gt; Ex vivo</em&gt; Piezas de resección pulmonar: Obtención de One to One de imagen para estudio histopatológico de correlación

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Determinación de la velocidad de transporte de xenobióticos y Nanomateriales través de la placenta mediante el<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo perfusión placentaria humana

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, heart attack or peripheral arterial diseases. Direct delivery of angiogenic growth factors has the potential to stimulate new blood vessel growth, but is often associated with limitations such as lack of targeting and short half-life in vivo. Gene therapy offers an alternative approach by delivering genes encoding angiogenic factors, but often requires using virus, and is limited by safety concerns. Here we describe a recently developed strategy for stimulating vascular growth by programming stem cells to overexpress angiogenic factors in situ using biodegradable polymeric nanoparticles. Specifically our strategy utilized stem cells as delivery vehicles by taking advantage of their ability to migrate toward ischemic tissues in vivo. Using the optimized polymeric vectors, adipose-derived stem cells were modified to overexpress an angiogenic gene encoding vascular endothelial growth factor (VEGF). We described the processes for polymer synthesis, nanoparticle formation, transfecting stem cells in vitro, as well as methods for validating the efficacy of VEGF-expressing stem cells for promoting angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

We describe the method of programming stem cells to overexpress therapeutic factors for angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Processes described include polymer synthesis, transfecting adipose-derived stem cells in vitro, and validating the efficacy of programmed stem cells to promote angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

Células Madre Programación para Terapéutico Angiogénesis Uso Biodegradable polimérico nanopartículas

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Intra-lymph Node Injection of Biodegradable Polymer Particles

Generation of adaptive immune response relies on efficient drainage or trafficking of antigen to lymph nodes for processing and presentation of these foreign molecules to T and B lymphocytes. Lymph nodes have thus become critical targets for new vaccines and immunotherapies. A recent strategy for targeting these tissues is direct lymph node injection of soluble vaccine components, and clinical trials involving this technique have been promising. Several biomaterial strategies have also been investigated to improve lymph node targeting, for example, tuning particle size for optimal drainage of biomaterial vaccine particles. In this paper we present a new method that combines direct lymph node injection with biodegradable polymer particles that can be laden with antigen, adjuvant, or other vaccine components. In this method polymeric microparticles or nanoparticles are synthesized by a modified double emulsion protocol incorporating lipid stabilizers. Particle properties (e.g.&#160;size, cargo loading) are confirmed by laser diffraction and fluorescent microscopy, respectively. Mouse lymph nodes are then identified by peripheral injection of a nontoxic tracer dye that allows visualization of the target injection site and subsequent deposition of polymer particles in lymph nodes. This technique allows direct control over the doses and combinations of biomaterials and vaccine components delivered to lymph nodes and could be harnessed in the development of new biomaterial-based vaccines.

Lymph nodes are the immunological tissues that orchestrate immune response and are a critical target for vaccines. Biomaterials have been employed to better target lymph nodes and to control delivery of antigens or adjuvants. This paper describes a technique combining these ideas to inject biocompatible polymer particles into lymph nodes.

Inyección de ganglios intra-linfáticos de partículas de polímero biodegradables

Generation of adaptive immune response relies on efficient drainage or trafficking of antigen to lymph nodes for processing and presentation of these ...

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the subsequent attachment and activation of platelets, monocyte/macrophage adhesion, and inflammatory cell signaling events, leading to post-procedural complications. The Chandler Loop Apparatus is an experimental system that allows researchers to study the molecular and cellular interactions that occur when large volumes of blood are perfused over polymeric conduits. To that end, this apparatus has been used as an ex vivo model allowing the assessment of the anti-inflammatory properties of various polymer surface modifications. Our laboratory has shown that blood conduits, covalently modified via photoactivation chemistry with recombinant CD47, can confer biocompatibility to polymeric surfaces. Appending CD47 to polymeric surfaces could be an effective means to promote the efficacy of polymeric blood conduits. Herein is the methodology detailing the photoactivation chemistry used to append recombinant CD47 to clinically relevant polymeric blood conduits and the use of the Chandler Loop as an ex vivo experimental model to examine blood interactions with the CD47 modified and control conduits.

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

El uso de la<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aparato Chandler Loop para evaluar la biocompatibilidad de los conductos sanguíneos poliméricos modificados

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

Clarificación primaria del fluido de cultivo celular cosechado con CHO utilizando un separador acústico

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome formulation, liposomes may be preferentially taken up by different cell types in the body. This may influence the efficacy of the therapeutic particle as progression of different diseases is tissue- and cell-type-specific. In this protocol, we present one method for synthesizing and fluorescently labeling liposomes using DSPC, cholesterol, and PEG-2000 DSPE and the lipid dye DiD as a fluorescent label. This protocol also presents an approach for delivering liposomes in vivo and assessing cell-specific uptake of liposomes using flow cytometry. This approach can be used to determine the types of cells that take up liposomes and quantify the distribution and proportion of liposome-uptake across cell types and tissues. While not mentioned in this protocol, additional assays such as immunofluorescence and single-cell fluorescence imaging on a cytometer will strengthen any findings or conclusions made as they permit assessment of intracellular staining. Protocols may also need to be adapted depending on the tissue(s) of interest.

The goal of this protocol is to synthesize fluorescently-labeled liposomes and use flow cytometry to identify in vivo localization of liposomes at a cellular level.

Preparación, administración y evaluación de la captación celular in vivo específica del tejido de liposomas marcados con colorante fluorescente

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...