The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.

すべての手順は、承認され、ヴァンダービルト施設内動物管理使用委員会に従って行われました。 フルオロフォアで1ラベリングCOI（オプション） <ol><li>マイクロスフェアの貨物を可視化するために、このようなスクシンイミジルエステルまたはフルオレセイン誘導体として（タンパク質に、 例えば ）無料の第一級アミンと反応する蛍光色素を、選択してください。ジメチルスルホキシド（DMSO）200μlの中に蛍光体の（COIのモル数に対して）8倍速モル過剰に溶解します。 </li><li>再懸濁ビヒクル溶液中の800μlの最終容量（62.5 ngの/μlの最終濃度）までのCOI 50mgの。ビヒクル溶液はCOIのソースに依存して変化します。 注：典型的なビヒクル溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）またはDMSOを含みます。 </li><li>ステップ1.1からフォア/ DMSO溶液のすべてを追加し、COIを懸濁します。ボルテックス4℃で一晩。あるいは、反応混合物を室温でボルテックス4時間（RT）。 </li><li>標識反応の後、脱塩カラムを使用して、過剰な蛍光団を削除します。 <ol><li>脱塩カラムから保存バッファーを排出し、脱イオン水16ミリリットルですすいでください。介してすべてのフローを捨てます。 </li><li>脱塩カラムに蛍光標識されたCOIを追加します。脱イオン水1.2ミリリットルで溶出し、フロースルーを収集します。 </li><li>反復溶出工程をさらに4回、毎回脱イオン水1.2 mlで添加し、別個のサンプルとしてフロースルーを集めます。 </li><li> -80℃でサンプルを介して収集されたすべてのフローを凍結し、24時間、製造業者の説明書に従って凍結乾燥。 </li></ol></li></ol> 2.水中油中水エマルション液中乾燥法を介してマイクロスフェアの準備をCOI-ロード<ol><li>最初の水相（W1）を形成するために脱イオン水100μlに1ミリグラムの蛍光標識されたCOIを追加します。 </li><li>ポリ（乳酸 - コ - グリコールACIの65ミリグラムを溶解させますD）（50:50ラクチド：グリコリド、分子量が54000 - 69000）マイクロ遠心チューブ中のジクロロメタン750μlのインチ10 Ultrasonicate - 30秒（160 Wで）完全にPLGAを溶解します。これは、油相（O）を形成します。 </li><li>滴下方法でO相にステップ2.1で生成されたW1段階のすべてを追加します。 W1 / O相を形成するために30秒間20,000rpmで手持ち式ホモジナイザーを用いて乳化します。 </li><li> 30秒間20,000rpmで1％15mlの（重量/体積）水性ポリ（ビニルアルコール）（PVA）の溶液に滴下様式でW1 / O相のすべてを追加し、手持ち式ホモジナイザーを用いて乳化。 </li><li>溶媒を除去し、水相を生成するために1時間ロータリーエバポレーターを用いて635 mmHgで真空200 mlの丸底フラスコに、被験者を、ステップ2.4において生成乳剤の全てを転送します。 </li><li>アリコート14マイクロ遠心チューブにステップ2.5で生成された水相の1ミリリットル。 7500でのマイクロ遠心チューブ中の水溶液を遠心分離8分間のXG。 注：このステップでは、マイクロスフェアは、残りの水溶液中に存在し、マイクロチューブの底部に集中しています。 </li><li>マイクロチューブの底にマイクロスフェアを乱さないように注意しながら、マイクロピペットでマイクロ遠心チューブからピペット操作を水溶液の900μLを削除します。 <ol><li>各マイクロチューブに脱イオン水を1ミリリットルを添加することにより、過剰PVAのマイクロスフェアを洗います。マイクロチューブの底にマイクロスフェアを乱さないように、8分間の7500×gで遠心分離し、そして再び慎重に、マイクロピペットでマイクロ遠心チューブからピペット操作を水溶液の900μLを削除します。 注：残りの100μlの水溶液が生成されたマイクロスフェアが含まれています。 </li></ol></li><li> -80℃でのステップ2.7で生成された水性マイクロスフェア液をフリーズします。 </li><li>メーカーのに従って凍結乾燥機を使用して凍結乾燥マイクロスフェア-20℃での命令とストア。 注：完全にPLGAミクロスフェアを溶解し、遊離タンパク質7の標準曲線にタンパク質濃度を相対的に決定することにより、COIの積載効率を測定します。 </li><li>陰性対照として、（以下、コントロールミクロスフェアとも呼ばれる）「ブランク」微小球のバッチを生成します。 注：コントロール微小球の生成はステップ1.2でビヒクル溶液800μlのに無COI加えて、親水性のCOIを充填したミクロスフェアの生成と同じです。 β細胞マイトジェンアッセイのためのCOI-ロードPLGAミクロスフェアへのPLGAの質量濃度のマッチ制御粒子。 </li></ol>膵島培養培地とプレ検定メディアの調製<ol><li>無傷のマウスの膵島の培養のために200ミリリットルのメディアを準備します。あるとして11 mMグルコース、10％ウマ血清、100 U / mlのペニシリンGおよび100μg/ mlのストレプトマイシン（を加えたRPMI 1640培地は、以下に言及）培地をしましょう。 注1：ウシ胎児血清（FBS）とは異なり、ウマ血清は、胎盤ラクトゲン、増殖アッセイにおいて分析し混乱させるβ細胞増殖の誘導因子を欠いています。 注2：PLGAミクロスフェアを使用する前に滅菌されていないように、培地に抗生物質の添加は、微生物汚染を避けるために重要です。 </li><li> 50ミリリットルコニカルチューブの電子ピペッターと場所で膵島培養培地の25ミリリットルを削除します。予備アッセイ培地を生成するために0.2mMのEGTAの最終濃度で50mlコニカルチューブ中の膵島培養培地25mlのを補います。 注：EGTAの添加は、穏やか膵島アーキテクチャを変更することなく、膵島における細胞 - 細胞接触を緩めます。これは、島の内側の細胞に到達することができCOIを確保することができますし、中央の島の壊死を防ぐのに役立ちます。 </li></ol>無傷のマウス膵島の4培養<ol><li>事前に選択された菌株、性別、AGから無傷の膵島を分離しますE、および膵臓8,9のルーチンコラゲナーゼ消化後のマウスの遺伝子型。プールは一緒にサンプルなどから膵島。 </li><li>アリコート膵島培養培地200μl中、96ウェル組織培養プレートの1ウェルに40小島。ウェルあたり視覚サイズマッチ小島（サンプル間の膵島等価（IEQ）の正確な評価は必要ありません）。蒸発バッファを提供するために、200μlの滅菌水で小島を有するウェルのすぐ隣に空の井戸を埋めます。培養物は、95％空気および5％CO 2の雰囲気下で一晩37℃で培地中で膵島。 </li></ol> COI-ロードされ、制御PLGAミクロスフェアの5.再サスペンション<ol><li>一晩膵島回復した後、再懸濁したマイクロスフェアマイクロチューブ内のCOIの最終濃度は、所与の量では10ng /μlの（COIの存在量であるように、凍結乾燥COI-ロードPLGAミクロスフェアの1つのアリコートに予め検定メディアを追加することにより、生成されたマイクロpheresはステップ2.9）で決定しました。 4℃で10秒の長いパルスで160 Wで10分間、氷水浴中で再懸濁COIを充填したミクロスフェアを超音波処理します。 </li><li>凍結乾燥制御PLGAミクロスフェアの等質量にプリアッセイ培地の同じボリュームを追加することによって再懸濁制御PLGAミクロスフェア。 4℃での10秒の長いパルスを160 Wで10分間、氷水浴中で再懸濁制御PLGAミクロスフェアを超音波処理します。 </li><li>視覚的にマイクロスフェアは、2をカバーガラスの間に再懸濁させたマイクロスフェアの2μLをピペットで分散していることを確認します。落射蛍光または明視野顕微鏡で40倍の対物レンズを用いたマイクロスフェアを可視化します。 </li><li>微小球の有意な凝集がまだ表示されている場合は、4℃で10秒の長パルスおよび再懸濁したマイクロスフェアの繰り返し可視化とW 160でさらに10分間、氷水浴中で超音波処理。 </li></ol> COI-ロードまたは制御PLGAミクロスフェアと島の6治療&lt;/ P&gt; <ol><li>よくCOIを充填したミクロスフェアを用いて治療される毎に、100μlの及び予め決め最終濃度の最終体積を10ng /プレアッセイ培地で再懸濁COIマイクロスフェアのμLを希釈することによってアッセイ培地を調製します。 注：タンパク質の最適な最終濃度は、このアッセイに使用される各COIごとに異なります。理想的には、最終濃度の範囲を試験します。 </li><li>各ウェルをコントロールとして使用されるためには、ステップ6.1でCOIを充填したミクロスフェアを希釈するために使用したのと同じ希釈体積のステップ5.2で生成された再懸濁した制御PLGAミクロスフェアを希釈することによって制御アッセイ培地を準備。 注：コントロールアッセイ培地で処理された膵島は、ブランクマイクロスフェアは、実験結果に持つかもしれない影響の検出を可能にするために、陰性対照として機能します。 </li><li>慎重に何の膵島をウェルから除去されないように、マイクロピペットで各ウェルからの膵島培養培地100μlのを削除します。静かに100μを追加各ウェルにアッセイ培地またはコントロールアッセイ培地100μlをリットル。 </li><li>三日間、95％空気および5％CO 2の雰囲気下、37℃で島をインキュベートします。 </li></ol> 7.顕微鏡スライド上に無傷の膵島を分散<ol><li> 3日後、膵島を除去しないように慎重にすべてのウェルからアッセイ培地を除去し、廃棄するためにマイクロピペットを使用しています。ゆっくりアッセイ培地のそれらを洗浄する小島に200μlのPBSを追加します。慎重に取り外し、マイクロピペットでPBSを捨て、ゆっくりと追加の200μlのPBSで再び島を洗います。 </li><li>削除し、マイクロピペットでPBSを破棄し、0.025％トリプシンを100μl、2mMのEDTA溶液を追加します。 3分間室温でインキュベートします。ピペットは、トリプシン-EDTA溶液アップと小島が視覚的に単一細胞に分散していることが確認されるまで、ダウン2分ごとに島を光学顕微鏡を用いて、（細胞のいくつかの小さな塊がまだ存在していてもよいことに注意してください）。各ウェルの個々のボリューム全体を転送LY標識 - マイクロ遠心チューブに。 </li><li>トリプシン媒介細胞解離を停止するには、各マイクロチューブに膵島培養培地400μlのを追加します。 </li><li>微量遠心管の底に膵島細胞をペレット化するために4℃で100×gで5分間遠心サンプル。 </li><li>静かにマイクロピペットを用いて上清を除去し、200μlの新鮮膵島培養培地中でペレットを再懸濁。 </li><li> CYTO-遠心分離機を用いて、遠心分離は、帯電した顕微鏡スライド上に3分間140×gで島を解離しました。 </li><li>室温で空気乾燥したスライドは、10分間、その後、疎水性マーキングペンで解離した島の周りにボックスを描画します。 </li><li>室温で10分間75μlの4％パラホルムアルデヒド（PFA）で細胞を固定してください。 4％PFAを外し、静かに75μlのPBS 2回で細胞を洗浄します。洗浄後、75μlの0.2％トリトンX-100 PBS中で10分間で細胞を透過性。その後、75μlのPBSで細胞を洗浄。 注意：PFAは、アレルギー性の発癌性、および毒性があることが知られています。 </li></オール&gt; インスリンおよび細胞増殖マーカー、Ki67について解離島の8免疫蛍光標識化<ol><li> 100スライド容量顕微鏡スライドボックスの下部に2湿った紙タオルを置くことによって、湿潤チャンバーを準備します。 </li><li>場所は、加湿チャンバー内でダウンフラット（上を向い細胞）をスライドさせます。検体に対する抗体の非特異的結合をブロックするために、各スライドに（PBS中の5％正常ロバ血清（NDS））マイクロピペットを用いて、前の洗浄段階からPBSを吸引し、ブロッキング溶液の75μlのを追加することによって、標識化のためのサンプルを準備します。 RTで1時間ブロッキング溶液中でスライドをインキュベートします。 </li><li>静かに吸引マイクロピペットを使用し、モルモット抗インスリン及びウサギ抗Ki67の抗体を含む一次抗体溶液の75μlを添加するブロッキング溶液、PBS中の5％NDS中に1μg/ mlで希釈しました。室温で1時間インキュベートします。 注：細胞増殖の代替マーカーは、増殖細胞核抗原（PCNA）およびホスホが含まれますohistone H3（PH 3）、 </li><li>静かにマイクロピペットを用いて一次抗体溶液を吸引し、75μlのPBSで細胞を洗浄します。吸引除去し、PBSは、マイクロピペットを使用し、75μLのPBSで、細胞を毎回2回以上すすいでください。 RTで1時間ブロッキング溶液中の2μg/ mlに希釈した75μlの抗モルモットCy5の二次抗体と抗ウサギのCy3二次抗体と、各サンプルをインキュベートします。 注：すでにマイクロスフェアを標識するために使用したのと同じまたはスペクトル重複フルオロフォアで標識された二次抗体を使用しないでください。 </li><li>マイクロピペットを用いて吸引し、二次抗体溶液を、室温で3分間、PBS中の300 nmのDAPI75μlの中でインキュベートします。吸引しDAPIは、マイクロピペットを用いて、5分間脱イオン水ですすぎます。 </li><li>静かにマイクロピペットを用いてサンプルから水を吸引除去します。ガラスカバースリップ上の退色防止剤を含む速乾性マウントソリューションの滴（約100μl）をスポット。 O、ダウン顕微鏡スライドのサンプル側を反転マウントソリューションNtoを。ゆっくりと気泡を除去し、ソフトなクリーニングティッシュで余分な液体を拭き取るためにピペットチップを使用して、スライドに対するカバーガラスを押してください。カバースリップを室温で一晩乾燥することができます。 </li></ol> 9.画像取得と解析<ol><li>画像取得のため取り付けられたカメラと落射蛍光顕微鏡を使用してください。各フルオロフォアについて、最適露光時間（ - Ki67にインスリンのための80ミリ秒、250ミリ秒DAPIための典型的には20ミリ秒、40）を決定します。画像取得パラメータは、すべての試料について同じであることを確認してください。 </li><li>各サンプルについて、手動で3000インスリン陽性細胞をカウントし、それらのまたのKi67陽性であり、どのように多く数えます。明確に定義されたと明らかに目に見える核を持っているインスリン陽性細胞のみをカウントします。インスリン陽性細胞の総数でのKi67陽性/インスリン陽性細胞の数を割り、100を掛けることにより、各サンプルのβ細胞増殖の割合を計算します。 </li><li> Dの後、各サンプルについて、β細胞増殖の割合をetermining、β細胞増殖の統計的に有意な差は市販の統計ソフトを使用して、一方向ANOVAを用いた結果を分析することにより制御し、実験試料との間に存在するかどうかを決定します。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

培養中のβ細胞増殖の研究は、一般的にいくつかの困難によって妨げられています。まず、不死化β細胞株は、生膵島における内因性β細胞で見られるものよりも、増殖の高い程度によって特徴付けられます。さらに、これらの不死化細胞株は通常のβ細胞機能のための重要な正常な構造を欠いています。これらの2つの事実は、結果が、インビボまたは全体の島で試験したとき、真の保?...

膵β細胞は体内で唯一のインスリン産生細胞であり、血中グルコース恒常性を維持するために重要です。健康な個体は、十分なβ細胞塊を有し、適切に血糖値を調節するように機能するが、糖尿病を有する個体は、不十分なβ細胞の質量および/または機能1,2を特徴とします。 β細胞の増殖を誘導することは、最終的にβ細胞量を増加させ、糖尿病の3を有する個体においてグルコース恒常性を復元することができることが提案されています。効果的な治療法が開発される前に、しかし、無傷の膵島における潜在的なβ細胞増殖性化合物の評価と検証が必要です。糖尿病を持つ個人に死体ヒト膵島の移植はしばらくの間、血中グルコース恒常性を復元しますが、この実験手順の可用性と成功は、移植のために利用可能なヒト膵島の不足によりおよび膵島の後方におけるβ細胞死によって妨げられていますER移植4。でもインスリン産生細胞の増殖を誘導する因子の発見で、主な課題は、まだin vivoでの関連サイトにこれらの要因を配信中に存在します。 β細胞増殖化合物の持続的局所送達のための1つの戦略は、ポリ（乳酸 - コ - グリコール酸）（PLGA）です。 PLGAは、高い安全性、生分解性、および持続放出動態5による薬物送達製品を承認FDAに使用の歴史を有します。具体的には、PLGAは、 インビボまたは天然に体内で代謝産物を発生している乳酸およびグリコール酸への培養物のいずれかの水で加水分解により劣化ラクチドとグリコリドの共重合体です。封入された薬物化合物は、拡散および/または分解制御放出機序の両方によって、周囲の環境に放出することができます。 COIのカプセル化はunencapsulaに比べ試薬の生物学的利用能を向上させる、酵素分解に対する保護を提供していますテッドCOI 5。我々は、PLGAミクロスフェアは、培養において、最終的にインビボで無傷の膵島に候補化合物を投与するために使用され得ることを示唆しています。移植プロトコルが模索される前に、ex vivoでの膵島するβ細胞マイトジェンを管理するためにPLGAの有効性をテストすることが重要です。 現在、生きた動物におけるβ細胞の増殖を測定するために何の技術がありません。 in vivoでの潜在的な増殖性化合物の有効性を評価するための実験は、したがって、免疫標識のための膵臓のその後の解剖および処理で、動物を生きるために、これらの化合物の投与を必要とします。そのようなプロトコルは、高価で面倒であり、そしてそれらは島に到達するという保証なしに、全身的に投与される化合物を必要とします。逆に、いくつかの不死化β細胞株は、培養物中のインスリン産生細胞の研究に利用可能であるが、これらの細胞株は、膵島アーキテクチャとenvironmenを欠きますtは生物6で見つかりました。不死化β細胞株はまた、このようにして増殖を誘導する化合物の分析を複雑に、 インビボでの内因性のβ細胞よりも複製の非常に高い程度を有することを特徴とします。本研究では、成体マウスから単離された無傷の膵島を使用するプロトコルを記述します。 β細胞株とは異なり、無傷の膵島は、通常の膵島アーキテクチャを保持しています。同様に、培養された無傷の膵島に直接増殖性化合物を投与すること、in vivoで行った実験とは対照的には、かなり正確にβ細胞増殖を測定する必要がある試薬の量を減少させます。 現在の研究は、この例では、COIを投与するためにPLGAを使用し、組換えヒト結合組織成長因子（rhCTGF）。それは目への化合物の継続的な放出を可能にするとして、ここで説明する方法は、培養された膵島への原料化合物を投与する上で重要な利点を付与します電子メディア。特に、このアッセイは、タンパク質と、無傷島に対する目的の抗体の多種多様を投与するために改変することができます。 α細胞を含む他の内分泌細胞型への影響も分析することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="819">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">O6149</td>
			<td style="width:307px;">For labeling COI with fluorophore</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td style="width:179px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">BP231-1</td>
			<td>For dissolving fluorophore in step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Disposable PD-10 Desalting Columns</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0851-01</td>
			<td>Desalting column used in step 1</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000-69,000</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">739960</td>
			<td>Used in generation of microspheres in step 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000-98,000</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">341584</td>
			<td>Used in generation of microspheres in step 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11879-020</td>
			<td>For culturing islets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dextrose Anhydrous</td>
			<td style="width:179px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">200-075-1</td>
			<td>Supplement for islet media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td>Antibiotics for islet media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Normal horse serum</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">008-000-121</td>
			<td>Supplement for islet media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well tissue culture plate</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3603</td>
			<td>For culturing islets</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4378</td>
			<td>Supplement for pre-assay islet media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytospin 4 Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A78300003</td>
			<td>For spinning cells onto microscope slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EZ Single Cytofunnel</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A78710020</td>
			<td>For spinning cells onto microscope slides</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:179px;">Fisher BioReagents</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td>Used in dissociating islets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>For fixing cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton&#160; X-100</td>
			<td style="width:179px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">BP151</td>
			<td>For permeabilizing cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Normal donkey serum</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">017-000-121</td>
			<td>Blocking reagents for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Ki67 antibody</td>
			<td style="width:179px;">abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab15580</td>
			<td>For Ki67 immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin</td>
			<td style="width:179px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">A0564</td>
			<td>For insulin immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">711-165-152</td>
			<td>For Ki67 immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">706-175-148</td>
			<td>For insulin immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>For nuclei visualization in immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aqua-Mount</td>
			<td style="width:179px;">Lerner Laboratories</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13800</td>
			<td>Fast drying mounting media</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">FreeZone -105&#176;C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System</td>
			<td style="width:179px;">Labconco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">7382020</td>
			<td>For lyophilization of microspheres</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sustained administration of &#946;-cell mitogens to intact mouse islets ex vivo using biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres

生体材料の開発は、膵臓β細胞を含む、細胞および組織型の様々な標的化薬物送達の可能性を大幅に増加しています。また、生体材料の粒子、ヒドロゲル、および足場はまた、培養及び移植された組織モデルでβ細胞に対する持続的な、制御可能な薬物送達を管理するためのユニークな機会を提供します。これらの技術は、無傷の膵島と翻訳関連システムを使用して、候補β細胞増殖因子の研究を可能にします。また、培養系でβ細胞増殖を刺激するための候補因子の有効性と実現可能性を決定することは、in vivoモデルを楽しみに移動する前に重要です。ここで、我々は、関心のある生分解性化合物（COI）で無傷のマウスの膵島は、その場放出 O の持続的効果を評価する目的で、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA）ミクロスフェア-loaded共培養する方法が記載さβ細胞の増殖に対するF分裂促進要因。この技術は、市販の試薬を用いて所望のカーゴを含有PLGA微小球を生成する方法を詳細に記載しています。記載された技術は、例えば、組換えヒト結合組織成長因子（rhCTGF）を使用しながら、COIの多種多様を容易に使用することができます。さらに、この方法は、β細胞増殖を評価するために必要な試薬の量を最小限にするために96ウェルプレートを使用します。このプロトコルは、容易にそのような細胞生存および分化の状態のような代替の生体材料及び他の内分泌細胞の特徴を使用するように適合させることができます。

図1は、上記のプロトコルを使用して生成されたマイクロスフェアを視覚的に表現したものです。ここで説明するプロトコルは、様々なサイズのrhCTGFを充填したミクロスフェアが得られます。いくつかのマイクロスフェアは、（ 図 2）大きいかもしれませんが微小球の最大の画分は、直径が1〜10μmの間であろう。所望の場合、マ?...

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Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

無傷のマウスの膵島のβ細胞のマイトジェンの持続的投与<em&gt; ex vivoで</em&gt;生分解性ポリ（乳酸-co-グリコール酸）微小球を使用して

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

sustained-administration-cell-mitogens-to-intact-mouse-islets-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.2K ビュー.  Vanderbilt University Medical Center. Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.

ビデオ: Sustained Administration of β-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

の高分解能3次元イメージング生体外</emマイクロCTによる>生物試料

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

生物工学

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で</em大動脈心臓弁の>研究

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional (3D) tissue wherein hematopoiesis is regulated by spatially organized cellular microenvironments termed niches2-4. The organization of the BM niches is critical for the function or dysfunction of normal or malignant BM5. Therefore a better understanding of the in vivo microenvironment using an ex vivo mimicry would help us elucidate the molecular, cellular and microenvironmental determinants of leukemogenesis6.
Currently, hematopoietic cells are cultured in vitro in two-dimensional (2D) tissue culture flasks/well-plates7 requiring either co-culture with allogenic or xenogenic stromal cells or addition of exogenous cytokines8. These conditions are artificial and differ from the in vivo microenvironment in that they lack the 3D cellular niches and expose the cells to abnormally high cytokine concentrations which can result in differentiation and loss of pluripotency9,10.
Herein, we present a novel 3D bone marrow culture system that simulates the in vivo 3D growth environment and supports multilineage hematopoiesis in the absence of exogenous growth factors. The highly porous scaffold used in this system made of polyurethane (PU), facilitates high-density cell growth across a higher specific surface area than the conventional monolayer culture in 2D11. Our work has indicated that this model supported the growth of human cord blood (CB) mononuclear cells (MNC)12 and primary leukemic cells in the absence of exogenous cytokines. This novel 3D mimicry provides a viable platform for the development of a human experimental model to study hematopoiesis and to explore novel treatments for leukemia.

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

A 3D culture system for hematopoiesis is described using human cord blood and leukemic bone marrow cells. The method is based on the use of a porous synthetic polyurethane scaffold coated with extracellular matrix proteins. This scaffold is adaptable to accommodate a wide range of cells.

正常と異常ヒト造血のex vivoでの擬態

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional ...

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia6,8-10.
Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways16,23 and parenchyma17,22 of animal models and in vivo human airway14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)18. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described19. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface17.
While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology24. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

A method to image ex vivo pulmonary resection specimens with optical frequency domain imaging (OFDI) and obtain precise correlation to histology is described, which is essential to developing specific OFDI interpretation criteria for pulmonary pathology. This method is applicable to other tissue types and imaging techniques to obtain precise imaging to histology correlation for accurate image interpretation and assessment. Imaging criteria established with this technique would then be applicable to image assessment in future in vivo studies.

の光周波数領域イメージング<em&gt;エクスビボ</em&gt;肺切除標本：組織病理相関へのOne to Oneイメージの入手

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

使用プラ​​センタアクロス異物およびナノ材料の輸送速度の決定<em&gt; ex vivoで</em&gt;ヒト胎盤灌流モデル

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, heart attack or peripheral arterial diseases. Direct delivery of angiogenic growth factors has the potential to stimulate new blood vessel growth, but is often associated with limitations such as lack of targeting and short half-life in vivo. Gene therapy offers an alternative approach by delivering genes encoding angiogenic factors, but often requires using virus, and is limited by safety concerns. Here we describe a recently developed strategy for stimulating vascular growth by programming stem cells to overexpress angiogenic factors in situ using biodegradable polymeric nanoparticles. Specifically our strategy utilized stem cells as delivery vehicles by taking advantage of their ability to migrate toward ischemic tissues in vivo. Using the optimized polymeric vectors, adipose-derived stem cells were modified to overexpress an angiogenic gene encoding vascular endothelial growth factor (VEGF). We described the processes for polymer synthesis, nanoparticle formation, transfecting stem cells in vitro, as well as methods for validating the efficacy of VEGF-expressing stem cells for promoting angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

We describe the method of programming stem cells to overexpress therapeutic factors for angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Processes described include polymer synthesis, transfecting adipose-derived stem cells in vitro, and validating the efficacy of programmed stem cells to promote angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

生分解性ポリマーナノ粒子を用いた治療的血管形成のためのプログラミング幹細胞

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Intra-lymph Node Injection of Biodegradable Polymer Particles

Generation of adaptive immune response relies on efficient drainage or trafficking of antigen to lymph nodes for processing and presentation of these foreign molecules to T and B lymphocytes. Lymph nodes have thus become critical targets for new vaccines and immunotherapies. A recent strategy for targeting these tissues is direct lymph node injection of soluble vaccine components, and clinical trials involving this technique have been promising. Several biomaterial strategies have also been investigated to improve lymph node targeting, for example, tuning particle size for optimal drainage of biomaterial vaccine particles. In this paper we present a new method that combines direct lymph node injection with biodegradable polymer particles that can be laden with antigen, adjuvant, or other vaccine components. In this method polymeric microparticles or nanoparticles are synthesized by a modified double emulsion protocol incorporating lipid stabilizers. Particle properties (e.g.&#160;size, cargo loading) are confirmed by laser diffraction and fluorescent microscopy, respectively. Mouse lymph nodes are then identified by peripheral injection of a nontoxic tracer dye that allows visualization of the target injection site and subsequent deposition of polymer particles in lymph nodes. This technique allows direct control over the doses and combinations of biomaterials and vaccine components delivered to lymph nodes and could be harnessed in the development of new biomaterial-based vaccines.

Lymph nodes are the immunological tissues that orchestrate immune response and are a critical target for vaccines. Biomaterials have been employed to better target lymph nodes and to control delivery of antigens or adjuvants. This paper describes a technique combining these ideas to inject biocompatible polymer particles into lymph nodes.

生分解性高分子粒子のリンパ節内注入

Generation of adaptive immune response relies on efficient drainage or trafficking of antigen to lymph nodes for processing and presentation of these ...

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the subsequent attachment and activation of platelets, monocyte/macrophage adhesion, and inflammatory cell signaling events, leading to post-procedural complications. The Chandler Loop Apparatus is an experimental system that allows researchers to study the molecular and cellular interactions that occur when large volumes of blood are perfused over polymeric conduits. To that end, this apparatus has been used as an ex vivo model allowing the assessment of the anti-inflammatory properties of various polymer surface modifications. Our laboratory has shown that blood conduits, covalently modified via photoactivation chemistry with recombinant CD47, can confer biocompatibility to polymeric surfaces. Appending CD47 to polymeric surfaces could be an effective means to promote the efficacy of polymeric blood conduits. Herein is the methodology detailing the photoactivation chemistry used to append recombinant CD47 to clinically relevant polymeric blood conduits and the use of the Chandler Loop as an ex vivo experimental model to examine blood interactions with the CD47 modified and control conduits.

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

の使用<em&gt;生体外</em&gt;チャンドラーループ装置は、改質ポリマー血液導管の生体適合性を評価するための

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

音響セパレータを用いたCHO採取細胞培養液の一次解明

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome formulation, liposomes may be preferentially taken up by different cell types in the body. This may influence the efficacy of the therapeutic particle as progression of different diseases is tissue- and cell-type-specific. In this protocol, we present one method for synthesizing and fluorescently labeling liposomes using DSPC, cholesterol, and PEG-2000 DSPE and the lipid dye DiD as a fluorescent label. This protocol also presents an approach for delivering liposomes in vivo and assessing cell-specific uptake of liposomes using flow cytometry. This approach can be used to determine the types of cells that take up liposomes and quantify the distribution and proportion of liposome-uptake across cell types and tissues. While not mentioned in this protocol, additional assays such as immunofluorescence and single-cell fluorescence imaging on a cytometer will strengthen any findings or conclusions made as they permit assessment of intracellular staining. Protocols may also need to be adapted depending on the tissue(s) of interest.

The goal of this protocol is to synthesize fluorescently-labeled liposomes and use flow cytometry to identify in vivo localization of liposomes at a cellular level.

蛍光色素標識リポソームのin vivo組織特異的細胞取り込みの調製、投与、および評価

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...