El hígado es un sitio primario para el trasplante en el entorno clínico de los islotes humanos. El trasplante intrahepático de islotes de ratón es técnicamente desafiante, y un alto porcentaje de ratones podría morir por complicaciones quirúrgicas, especialmente sangrado. En este estudio, los dos métodos que mostramos podrían prevenir eficazmente la muerte del ratón inducida por sangrado.
Nuestro método se puede aplicar a la investigación en cáncer de hígado y otras enfermedades hepáticas al permitir la inyección de células cancerosas, células madre mesenquimales y hepatocitos directamente al hígado. Para comenzar, separe una cultura de islotes humanos con un rascado suave. Use una jeringa de 1 centímetro cúbico para recoger de 300 a 350 islotes en tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mililitros en hielo.
Cuando se hayan recogido todos los islotes, centrífugue los tubos durante 10 segundos para sedimentar las células. Deseche todos menos un pequeño volumen de sobrenadante para evitar la pérdida de pellets y resuspenda los islotes en 200 microlitros HBSS que contienen 5% de BSA. Cargue los islotes resuspendidos en una jeringa de insulina de 5 mililitros y gire el extremo de la aguja de la jeringa durante 1 minuto para dejar que los islotes se asienten en el émbolo.
Presione el émbolo para eliminar cualquier burbuja, manteniendo aproximadamente de 100 a 150 microlitros de solución en la jeringa e invierta la jeringa con un golpeteo suave para distribuir uniformemente los islotes. Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal, aplique ungüento en los ojos para evitar que se sequen. Afeitar el abdomen del ratón anestesiado para retirar el pelaje y desinfectar la zona quirúrgica con tres toallitas alternas de 2% de yodo y 75% de alcohol.
A continuación, haga una incisión de 1 a 1,5 centímetros en el abdomen y abra la cavidad peritoneal. Coloque un trozo estéril de gasa alrededor de la incisión y use fórceps o puntas de algodón para transferir suavemente el intestino a la gasa. Luego cubren el intestino con un trozo de gasa empapada en solución salina y exponen la vena porta.
Para detener el sangrado inducido por la transferencia de islotes usando espuma de gel, sostenga la aguja con el bisel hacia abajo y coloque la punta de la aguja con la abertura paralela a la pared de la vena porta antes de insertar la aguja en la vena porta. Retraiga el émbolo para extraer de 20 a 50 microlitros de sangre en la jeringa para mezclarlos con los islotes antes de infundir los islotes en la vena porta mientras presiona y retrae repetidamente el émbolo. Cuando se hayan entregado todos los islotes, coloque una pieza de espuma de gel de aproximadamente 5 por 5 centímetros sobre el sitio de inyección.
Use una punta de algodón para presionar la espuma de gel hacia abajo mientras retira la aguja de la vena porta. Mantenga el gel en su lugar durante aproximadamente 2 minutos, enrollando la espuma de gel para asegurarse de que cubra la vena porta. Una vez que se detiene el sangrado, devuelva suavemente el intestino a la cavidad peritoneal en la posición original e inyecte 500 microlitros de solución salina tibia en la cavidad abdominal.
Use suturas para cerrar las capas musculares y de la piel. Luego coloque el ratón en una jaula limpia sobre una almohadilla térmica con monitoreo hasta la recuperación completa de la anestesia, administrando analgesia cada 12 horas y calentando durante 48 horas. Para detener el sangrado inducido por la transferencia de islotes usando una almohadilla de grasa, después de exponer la vena porta como se ha demostrado, use dos puntas de algodón para sostener la vena expuesta en los lados izquierdo y derecho y ubicar la almohadilla de tejido graso entre el duodeno y la vena porta.
Penetre la almohadilla de grasa con la punta de la aguja antes de insertarla en la vena porta. Infundir los islotes en la vena porta como se ha demostrado. Cuando se hayan entregado todos los islotes, presione el tejido graso con una punta de algodón durante aproximadamente 1 minuto mientras retira la aguja de la vena.
Luego devuelva el intestino a la cavidad abdominal y realice el resto de los procedimientos de atención postquirúrgica como se ha demostrado. Los efectos del trasplante de islotes dependen de la dosis, ya que la glucemia normal se observa 30 días después del trasplante de islotes singénicos cuando se transfieren 500 islotes, pero solo se observa normoglucemia transitoria cuando se administran 250 islotes, y los ratones vuelven a la hiperglucemia a los 10 días después del trasplante. Se observa un aumento del peso corporal en ambos grupos y respuestas idénticas observadas cuando los islotes humanos se trasplantan a ratones diabéticos NOD-SCID, con normoglucemia observada cuando se trasplantan un mayor número de equivalentes de islotes, pero no un número menor.
La mayoría de los ratones que tienen sangrado después de la transferencia mueren después de la cirugía, mientras que los ratones sin sangrado sobreviven. A los 28 días después del trasplante, la tinción de insulina revela una distribución uniforme del islote humano en todo el hígado, principalmente cerca de los vasos sanguíneos. Además de la insulina, la fibrina y la filtración de células polimorfonucleares también se observan dentro de los islotes humanos trasplantados.
El trasplante intrahepático de islotes generará un gran orificio en la vena porta que puede causar sangrado. El uso de nuestros dos procedimientos mejorados puede prevenir el sangrado y reducir la mortalidad después del trasplante de islotes. El modelo de trasplante intraportal de islotes puede imitar el trasplante clínico de islotes humanos.
Nuestros procedimientos refinados pueden conducir a tasas de supervivencia más altas para los receptores, lo que permite un mayor estudio de la función de los islotes después del trasplante.
