The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.

모든 절차가 승인 밴더빌트 기관 동물 관리 및 사용위원회에 따라 수행 하였다. 형광 1. 레이블 COI (선택 사항) <ol><li> 미세화물을 시각화와 같은 숙신 이미 딜 에스테르 또는 플루오 레세 인 유도체 (단백질에서 예) 자유 급 아민과 반응하여 형광 염료를 선택. 디메틸 술폭 시드 200 ㎕의 (DMSO)에 형광 물질 (COI의 몰에 대해) 8 배 몰 과량을 녹인다. </li><li> 재현 탁 차량 용액 800 μL의 최종 부피 (62.5 NG / μL의 최종 농도)까지 COI 50mg을. 차량 용액 COI의 소스에 따라 달라진다. 참고 : 일반 차량 솔루션은 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 또는 DMSO를 포함한다. </li><li> 단계 1.1에서 형광 / DMSO 용액을 모두 추가하고 COI를 재현 탁. 소용돌이 밤새 4 ° C에서. 대안 적으로, 반응 혼합물에 실온에서 와동4 시간 동안 (RT). </li><li> 라벨 반응에 따라, 탈염 컬럼을 사용하여 여분의 형광을 제거합니다. <ol><li> 탈염 칼럼으로부터 축적 버퍼 드레인 증류수 16 ㎖로 헹군다. 를 통해 모든 흐름을 폐기하십시오. </li><li> 탈염 컬럼에 형광 표지 된 COI를 추가합니다. 탈 이온수 120 ㎖로 용출하고 통한 흐름을 수집한다. </li><li> 용출 단계를 반복하여 추가로 네 번마다 탈 이온수 1.2 ㎖에 첨가하고, 별도의 샘플 등을 통해 유동을 수집. </li><li> -80 ° C에서 샘플을 통해 수집 된 모든 흐름을 정지하고 24 시간 동안 제조업체의 지침에 따라 동결 건조. </li></ol></li></ol> 2. 물 -에 - 중유 에멀젼 용매 증발 방법을 통해 마이크로 스피어 준비 COI로드 <ol><li> 제 수상 (W1)을 형성 증류수 100 ㎕의 1 mg의 형광 표지 COI 추가. </li><li> 폴리 65 mg을 용해 (락트산 - 코 - 글리콜 ACI라) (50 : 50 락 티드 : 글리콜, 분자량 54,000 - 미세 원심 관에 디클로로 메탄 750 μL에서 69,000). 10 초음파 처리 - (160 W에서) 30 초 완전히 PLGA를 용해한다. 이 유상 (O)를 형성한다. </li><li> 드롭 현명한 방식으로 O 단계로 단계 2.1에서 생성 된 W1 단계의 모든를 추가합니다. W1 / O 상을 형성하기 위해 30 초 동안 20,000 rpm에서 휴대용 균질기를 사용하여 유화시킨다. </li><li> 30 초 동안 20,000 rpm에서 1 %의 15 ㎖ (중량 / 부피) 수성 폴리 (비닐 알콜) (PVA) 용액에 적가 방식으로 W1 / O상의 모든 추가 휴대용 균질화기를 사용하여 유화 . </li><li> 용매를 제거하고, 수성 상을 생성하기 위해 1 시간 동안 회전 증발기를 사용하여 635 mmHg의 진공을 200 ml의 둥근 바닥 플라스크 피사체 단계 2.4에서 생성 된 에멀젼의 모든 전송. </li><li> 수성 단계의 나누어지는 1 ml의 단계 2.5 열네에의 microcentrifuge 튜브에서 발생. 7500에서 마이크로 원심 튜브의 수용액을 원심8 분 XG. 주 :이 단계에서, 미소 나머지 수용액에 존재하고 microcentrifuge 관의 바닥에 집중된다. </li><li> microcentrifuge 관의 바닥에 미소를 방해하지 않도록 조심스럽게, 마이크로 피펫으로의 microcentrifuge 튜브에서 피펫을 수용액 900 μl를 제거합니다. <ol><li> 각 microcentrifuge 관에 물을 탈 1ml를 추가하여 초과 PVA의 미소를 씻으십시오. microcentrifuge 관의 바닥에 미소를 방해하지 않도록 8 분 동안 7,500 XG에 원심 분리기, 다시 조심스럽게, 마이크로 피펫으로의 microcentrifuge 튜브에서 피펫을 수용액 900 μl를 제거합니다. 참고 : 나머지 100 ㎕의 수용액이 생성 된 마이크로 스피어가 포함되어 있습니다. </li></ol></li><li> -80 ° C에서 270 단계에서 생성 된 미세 수성 용액을 동결. </li><li> 에 따른 동결 건조기를 사용하여 동결 건조 된 마이크로 스피어의 제조-20 ° C에서 지침 및 저장. 주 : 완전히 PLGA 미립자를 용해시키고 유리 단백질 (7)의 표준 곡선의 단백질 농도를 상대적으로 판단하여 COI의 적재 효율을 측정한다. </li><li> 네거티브 대조군으로서, (이하 제어 미립자라고도 함) &quot;빈&quot;미소의 배치를 생성한다. 주 : 제어 미립자의 생성 단계 1.2 비히클 용액 800 μL없이 COI 첨가 친수성 COI로드 미립자의 생성과 동일하다. β 세포 미토 겐 분석을위한 COI 로딩 된 PLGA 미립자에 PLGA의 질량 농도 대전 조정 입자. </li></ol> 작은 섬 문화 미디어와 사전 분석 미디어 3. 준비 <ol><li> 본래 마우스 아일렛의 배양에 200㎖의 용지를 준비 : RPMI 11 mM의 글루코오스, 10 % 말 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린 G, 100 μg의 보충 1640 미디어 것은 ml의 스트렙토 마이신 (이하이다라고 /) 문화 미디어를 할 수 있습니다. 주 1 : 소 태아 혈청 (FBS)과 달리, 말 혈청 태반 락토 겐, 증식 분석에서 분석을 교란 β 세포 증식의 유도 없다. 주 2 : PLGA 미립자가 사용 전에 멸균되어 있지 않으므로, 배양액을 항생제 첨가가 미생물 오염을 방지하기 위해 중요하다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브의 전자 피펫과 장소와 섬 문화 매체의 25ml를 제거합니다. 예비 분석 미디어를 생성하기 위해 0.2 mM의 EGTA의 최종 농도로 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 섬 배양 배지의 25 ㎖를 보완. 주 : EGTA의 추가는 약간 섬 아키텍처를 변경하지 않고 섬에서 세포 - 세포 연락처를 풀어. 이 섬의 내부 세포에 도달 할 수 COI을 보장하고 중앙 섬의 괴사를 방지하는 데 도움이됩니다. </li></ol> 본래 마우스 독도 4. 배양 <ol><li> 미리 선택된 균주, 성별, AG에 그대로 섬 격리췌장의 8,9의 일상 콜라게나 소화 다음 마우스의 전자 및 유전자형. 풀 함께 샘플 등으로부터 섬. </li><li> 분취 아일렛 배양액 200 μL의 96 웰 조직 배양 플레이트의 한 웰에 40 아일렛. 물론 당 시각적으로 크기 일치 섬 (샘플 사이의 섬 상당 (IEQ)의 정확한 평가는 필요하지 않습니다). 증발 버퍼를 제공하는 200 ㎕의 멸균 수와 섬에 우물 바로 옆에 빈 우물을 입력합니다. 배양은 95 % 공기 및 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 하룻밤 미디어 아일렛. </li></ol> COI로드 및 제어 PLGA 미소 구의 제 다시 현탁 <ol><li> 밤새 섬 복구 후 동결 건조 COI 로딩 된 PLGA 미립자의 하나의 분취 량을 사전에 분석 배지를 첨가하여 재현 탁 미립자 등의 microcentrifuge 튜브 COI의 최종 농도가 10 ng의 / μL (주어진 양 COI 존재 량이라고 생성 된 마이크로pheres 단계 2.9)에서 산출 된 것입니다. 4 ℃에서 10 초의 긴 펄스를 W (160)에서 10 분 동안 빙수 욕에서 재현 탁 COI로드 미세 초음파 처리. </li><li> 동결 건조 제어 PLGA 미립자의 동일한 질량을 사전에 분석 배지의 동일한 양을 첨가함으로써 재현 탁 제어 PLGA 미립자. 4 ℃에서 10 초의 긴 펄스를 W (160)에서 10 분 동안 빙수 욕에서 재 부유 제어 PLGA 미립자 초음파 처리. </li><li> 시각 미소가 두 커버 글라스 사이에 재현 탁 미소의 2 μl를 피펫 팅에 의해 분산 확인합니다. 표면 형광 또는 시야 현미경에 40X 목표를 사용하여 미소를 시각화합니다. </li><li> 미소 구체의 현저한 응집이 여전히 보이면 4 ° C에서 10 초의 긴 펄스 및 재 부유 미립자의 반복 시각화 W (160)에서 추가로 10 분 동안 빙수 조에서 초음파 처리. </li></ol> COI로드 또는 제어 PLGA 마이크로 스피어와 독도 6. 치료 &lt;/ P&gt; <ol><li> 각 웰은 COI로드 미세 처리 될 때까지 100 ㎕의 최종 부피 및 소정의 최종 농도 미리 분석 미디어 재현 탁 COI 미소 구의 10 NG / μL 희석 분석 매체를 준비한다. 참고 : 단백질의 최적의 최종 농도는이 분석에 사용되는 각각의 COI에 따라 다를 것입니다. 이상적으로는, 최종 농도 범위는 시험된다. </li><li> 웰 각각은 대조군으로 사용되기 위해서는, 단계 6.1에서 COI로드 미립자를 희석하기 위해 사용한 것과 동일한 희석 부피 단계 5.2에서 생성 된 재 부유 제어 PLGA 미립자를 희석하여 제어 분석 매체를 준비한다. 참고 : 제어 분석 매체로 처리 독도는 빈 미소가 실험 결과에 미칠 수있는 영향의 탐지를 가능하게하는 음성 대조군 될 것입니다. </li><li> 조심스럽게에는 독도가 우물에서 빠질 수없는되도록 마이크로 피펫으로 각 우물에서 섬 배양 배지 100 μl를 제거합니다. 조심스럽게 100 μ를 추가분석 매체 또는 각 웰에 제어 분석 배지 100 ㎕의 L. </li><li> 사흘 동안 95 % 공기 및 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 인큐베이션을 섬. </li></ol> 7. 현미경 슬라이드 상에 본래 독도 분산제 <ol><li> 삼일 후, 섬을 제거하지 않도록주의 깊게 우물에서 분석 미디어를 제거하고 폐기 마이크로 피펫을 사용합니다. 조심스럽게 분석 미디어 그들을 씻어 독도에 PBS μL (200)를 추가합니다. 조심스럽게 제거하고 마이크로 피펫으로 PBS를 무시하고 부드럽게 추가 200 μl의 PBS 다시 섬을 씻는다. </li><li> 제거하고 마이크로 피펫으로 PBS를 버리고 0.025 % 트립신 100 ㎕, 2 mM의 EDTA 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 3 분 동안 실온에서 품어. 피펫은 트립신 EDTA 용액 위로 독도가 육안으로 단일 세포로 분산 확인 될 때까지 아래로 매 2 분에 독도 광학 현미경을 사용하여 (세포의 일부 작은 덩어리가 여전히 존재할 수 있습니다). 각각의 웰에 개개의 전체 볼륨을 전송LY labeled-의 microcentrifuge 튜브로. </li><li> 트립신 매개 세포 분리를 중지 각 microcentrifuge 관에 섬 문화 매체의 400 μl를 추가합니다. </li><li> 4 ° C에서 100 XG에 5 분 원심 분리기 샘플의 microcentrifuge 튜브의 바닥에 작은 섬 세포 펠렛합니다. </li><li> 부드럽게 200 μL 신선한 섬 문화 매체에 마이크로 피펫을 이용하여 상층 액과에 resuspend 펠렛을 제거합니다. </li><li> 사이토 원심 분리기를 사용하여, 원심 분리기 청구 현미경 슬라이드에 3 분 140 XG에 독도 해리. </li><li> 실온에서 공기 건조 슬라이드는 10 분 동안, 다음 소수성 마킹 펜으로 해리 섬 주위에 상자를 그립니다. </li><li> 실온에서 10 분 동안 75 ㎕의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 세포를 고정한다. 4 % PFA를 제거하고 부드럽게 PBS 75 μL에 두 번 세포를 씻으십시오. 세정 후, 75 ㎕의 0.2 % 트리톤 X-100의 PBS에서 10 분간 세포와 Permeabilize 하시려면. 그런 다음, 75 μl의 PBS로 세포를 씻어. 주의 : PFA는 알레르기 발암 및 독성 것으로 알려져있다. </li></올&gt; 8. 면역 형광 인슐린에 대한 해리 독도 라벨링 및 세포 증식 마커, 사료된다 <ol><li> 100 슬라이드 용량 현미경 슬라이드 상자의 바닥이 젖은 종이 타월을 배치하여 습기 챔버를 준비합니다. </li><li> 장소는 습기 챔버에서 아래로 평면 (위를 향 세포)를 슬라이드. 마이크로 피펫을 이용하여 이전의 세척 단계에서 PBS를 흡입 및 차단 용액 75 μl를 첨가하여 표지 용 시료 준비 (5 % 정상 당나귀 혈청 PBS에서 (NDS)) 시료에 대한 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위해 각 슬라이드. RT에서 1 시간 동안 차단 용액에 슬라이드를 부화. </li><li> 부드럽게 흡 마이크로 피펫을 사용하여 기니아 피그 인슐린과 항 토끼 항 사료된다 항체를 포함하는 차 항체 용액 75 μL를 추가 차단 용액, PBS에서 5 % 1 μg의 NDS / mL로 희석 하였다. 1 시간 동안 실온에서 품어. 참고 : 세포 증식의 대안 마커는 세포 핵 항원 (PCNA)과 phosph 증식 포함ohistone H3 (PH3), </li><li> 부드럽게 마이크로 피펫 차 항체 용액을 흡인하고 75 ㎕의 PBS로 세포를 헹군다. 대기음 PBS는 마이크로 피펫을 사용하여 세포를 두 번 이상, 75 μL PBS와 각 시간을 씻어. 실온에서 1 시간 동안 차단 솔루션 2 μg의 / ㎖로 희석 75 μl를 방지 기니 돼지 Cy5에 차 항체 및 항 - 토끼를 Cy3 차 항체와 각 샘플을 품어. 참고 : 이미 미소를 라벨에 사용 된 동일하거나 스펙트럼 중복 형광으로 표지 된 이차 항체를 사용하지 마십시오. </li><li> 마이크로 피펫을 사용하여 실온에서 3 분 동안 PBS에서 300 nm의 DAPI의 75 μL에 품어 대기음 이차 항체 솔루션입니다. 대기음 DAPI는 마이크로 피펫을 사용하여 5 분 동안 탈 이온수로 헹군다. </li><li> 조심스럽게 마이크로 피펫을 사용하여 샘플에서 물을 대기음. 드롭 유리 커버 슬립에 antifade 시약을 포함하는 빠른 건조 장착 용액 (약 100 μl를) 발견. 오, 아래 현미경 슬라이드 샘플 측 전환장착 솔루션 NTO. 부드럽게 거품을 제거하고 부드럽고 깨끗한 티슈로 물기를 닦아 피펫 팁을 사용하여 슬라이드에 대해 커버 슬립을 누릅니다. 커버 슬립 실온에서 하룻밤 건조하도록 허용합니다. </li></ol> 9. 이미지 수집 및 분석 <ol><li> 이미지 획득을위한 부착 된 카메라와 함께 표면 형광 현미경을 사용합니다. 각 형광의 경우, 최적의 노출 시간 (- 사료된다 인슐린 80 밀리, 250 밀리 초 DAPI에 대한 일반적으로 20 밀리 초 40)을 결정한다. 이미지 수집 매개 변수를 모든 샘플에 대해 동일해야합니다. </li><li> 각 샘플의 경우, 수동으로 3,000 인슐린 양성 세포 수를 계산하고 그의 또한 사료된다 양성 얼마나 많은 계산합니다. 만 잘 정의하고 명확하게 보이는 핵이 인슐린 양성 세포를 계산합니다. 인슐린 양성 세포의 총 수에 의해 사료된다 양성 / 인슐린 양성 세포의 수를 나누고 100을 곱하여 샘플마다 β 세포 증식의 비율을 계산한다. </li><li> D 후,β 세포의 증식에 유의 한 차이는 제어 및 일방향 ANOVA 시판 통계 소프트웨어를 사용과 결과를 분석함으로써 실험 샘플 사이에 존재하는 경우, 각 샘플은 β 세포 증식의 비율 etermining 결정. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-based+technologies+for+osteoarthritis+detection+and+therapy.">Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy.</a> Drug Deliv Transl Res. , (2015).</li><li>Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+pH-+and+temperature-responsive+microparticles+for+protein+delivery+to+ischemic+tissues.">Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues.</a> Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).</li><li>Poole, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-responsive+microspheres+for+on+demand+antioxidant+therapy+in+a+model+of+diabetic+peripheral+arterial+disease.">ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease.</a> Biomaterials. 41, 166-175 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

문화의 β 세포 증식의 연구는 일반적으로 여러 가지 어려움에 의해 방해된다. 우선, β 불멸화 세포주 라이브 아일렛 내인성 β 세포에서 발견 된 것보다 더 높은 정도의 증식을 특징으로한다. 또한 이러한 불멸화 세포주 정상 β 세포 기능에 중요한 일반 아키텍처 부족하다. 이 두 가지 사실이 결과는 생체 내에서 또는 전체 섬에서 시험했을 때 성립됩니다 불후의 β 세포 라인을 사용하여 얻...

췌장 β 세포는 몸의 유일한 인슐린 생산 세포이며 혈당 항상성을 유지하는 것이 중요하다. 건강한 사람이 충분한 β 세포 질량을 적절히 혈당을 조절하는 역할을하지만, 당뇨병을 가진 개인이 불충분 β 세포 질량 및 / 또는 1,2- 기능을 특징으로한다. 이 β 세포 증식을 유도하여 궁극적으로 β 세포 질량을 증가시키고 당뇨병 3 개인 글루코스 항상성을 복원 할 수 있도록 제안되어있다. 효과적인 치료법이 개발되기 전에 그러나, 평가, 그대로 섬에 잠재적 인 β 세포 증식 화합물의 확인이 필요합니다. 당뇨병을 가진 개인에 사체 인간의 독도의 이식은 몇 시간 동안 혈당 항상성을 복원되지만 가용성이 실험 절차의 성공은 섬의 후방에 이식 가능한 인간 섬의 부족에 의해 베타 세포 사멸에 의해 방해된다어 이식 4. 에도 인슐린 생성 세포의 증식을 유도하는 인자를 발견하여, 주요 문제는 여전히 생체 관련 사이트에 이들 인자를 전달 존재한다. β 세포 증식 화합물의 지속 로컬 배달을 위해 하나의 전략은 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜) 산 (PLGA)입니다. PLGA는 FDA에서 사용의 역사는 높은 안전성, 생분해 성 및 확장 릴리스 역학 5 때문에 약물 전달 제품을 승인했다. 즉, PLGA는 생체 내에서 자연적으로 또는 체내에서 대사를 발생하는 젖산 및 글리콜 산으로 배양 중 물로 가수 분해를 통해 락 타이드와 글리콜 라이드의 공중 합체이다. 캡슐화 된 약물 화합물의 확산 및 / 또는 변형 - 방출 조절기구 모두 주위 환경에 방출 될 수있다. COI의 캡슐화 unencapsula 비교 시약의 생체 이용률을 개선 효소 분해에 대한 보호를 제공테드 COI 5. 우리는 PLGA 미세 문화에 그대로 섬에 후보 화합물을 관리하는 데 사용 될 수 있으며, 궁극적으로 생체 내에서하는 것이 좋습니다. 이식 프로토콜을 탐험하기 전에 생체을 섬에 β 세포 분열 촉진 물질을 관리하는 PLGA의 효능을 테스트하는 것은 매우 중요하다. 현재 살아있는 동물의 β 세포 증식을 측정하는 기술도 없다. 실험 따라서 immunolabeling에 대한 pancreata의 다음 해부 및 가공과, 동물을 사는 이들 화합물의 투여를 필요로 생체 내에서 잠재적 인 증식 성 화합물의 효과를 평가합니다. 이러한 프로토콜은 비싸고 힘들고, 그리고 그들이 아일렛 도달 할 어떤 보장없이 전신적으로 투여되는 화합물을 필요로한다. 반대로, 여러 β 불멸화 세포주 배양 인슐린 생성 세포의 연구에 사용할 수 있지만, 이들 세포주는 섬 구조와 environmen 부족t는 유기체 (6) 생활에서 발견. β 불멸화 세포주는, 따라서, 생체 내에서 내인성 β 세포 복제보다 훨씬 높은 수준을 갖는 증식을 유도하는 화합물의 분석이 복잡 특징으로한다. 이 연구에서 우리는 성인 쥐에서 분리 된 그대로 독도를 사용하는 프로토콜을 설명합니다. β 세포주 달리 그대로 섬 정상 섬 구조를 유지한다. 마찬가지로, 직접 배양 그대로 섬에 증식 화합물을 투여하는, 생체 내에서 실시한 실험 달리 상당히 정확하게 β 세포 증식을 측정하기 위해 필요한 시약의 양을 감소시킨다. 현재의 연구는이 예에서는, COI를 관리 할 PLGA를 활용, 재조합 인간의 결합 조직 성장 인자 (rhCTGF). 이 일에 화합물의 지속적인 방출을 허용 여기에 기술 된 방법은 배양 섬에 원료 화합물의 관리를 통해 상당한 이점을 부여E 매질. 특히,이 시험은 단백질이 그대로 섬에 관심 항체의 다양한 관리하도록 변형 될 수있다. α 세포를 포함하는 다른 내분비 세포 유형에 효과가 또한 분석 될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="819">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">O6149</td>
			<td style="width:307px;">For labeling COI with fluorophore</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td style="width:179px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">BP231-1</td>
			<td>For dissolving fluorophore in step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Disposable PD-10 Desalting Columns</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0851-01</td>
			<td>Desalting column used in step 1</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000-69,000</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">739960</td>
			<td>Used in generation of microspheres in step 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000-98,000</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">341584</td>
			<td>Used in generation of microspheres in step 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11879-020</td>
			<td>For culturing islets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dextrose Anhydrous</td>
			<td style="width:179px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">200-075-1</td>
			<td>Supplement for islet media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td>Antibiotics for islet media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Normal horse serum</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">008-000-121</td>
			<td>Supplement for islet media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well tissue culture plate</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3603</td>
			<td>For culturing islets</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4378</td>
			<td>Supplement for pre-assay islet media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytospin 4 Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A78300003</td>
			<td>For spinning cells onto microscope slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EZ Single Cytofunnel</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A78710020</td>
			<td>For spinning cells onto microscope slides</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:179px;">Fisher BioReagents</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td>Used in dissociating islets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>For fixing cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton&#160; X-100</td>
			<td style="width:179px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">BP151</td>
			<td>For permeabilizing cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Normal donkey serum</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">017-000-121</td>
			<td>Blocking reagents for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Ki67 antibody</td>
			<td style="width:179px;">abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab15580</td>
			<td>For Ki67 immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin</td>
			<td style="width:179px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">A0564</td>
			<td>For insulin immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">711-165-152</td>
			<td>For Ki67 immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">706-175-148</td>
			<td>For insulin immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>For nuclei visualization in immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aqua-Mount</td>
			<td style="width:179px;">Lerner Laboratories</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13800</td>
			<td>Fast drying mounting media</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">FreeZone -105&#176;C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System</td>
			<td style="width:179px;">Labconco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">7382020</td>
			<td>For lyophilization of microspheres</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sustained administration of &#946;-cell mitogens to intact mouse islets ex vivo using biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres

생체 재료의 개발은 췌장 β 세포를 포함한 세포 및 조직 유형의 다양한 표적 약물 전달의 가능성을 증가 현저했다. 또한, 생체 재료 입자, 하이드로 겔 및 비계는 독특한 기회를 제공하는 것은 유지 관리하려면 제어 약물 전달은 β 세포를하는 문화와 이식 조직 모델에서. 이러한 기술은 본래 섬과 병진 관련 시스템을 이용하여 후보 β 세포 증식 인자에 대한 연구를 허용한다. 또한, 배양 시스템에서 β 세포 증식을 자극 후보 인자의 효과 및 타당성을 결정하는 것은 생체 내 모델 전진 전에 중요하다. 여기서 우리가 관심있는 생분해 성 화합물 (COI) -loaded 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) 인 시츄 이형 O에서 유지의 효과를 평가하기위한 목적으로 (PLGA) 마이크로 스피어와 본래 마우스 아일렛 배양 공동하는 방법을 서술β 세포 증식에 ​​F 분열 촉진 인자. 이 기술은 상업적으로 입수 가능한 시약을 사용하여 원하는화물을 함유하는 PLGA 미립자를 생성하는 방법에 대해 상세히 설명한다. 설명 된 기술은 예를 들어 재조합 인간 결합 조직 성장 인자 (rhCTGF)를 사용하지만, COI 다양한 용이하게 사용될 수있다. 또한,이 방법은 β 세포 증식을 평가하는 데 필요한 시약의 양을 최소화하기 위하여 96 웰 플레이트를 사용한다. 이 프로토콜은 용이하게 다른 생체 물질 및 세포 생존 및 분화 상태와 같은 다른 내분비 세포의 특성을 이용하도록 구성 될 수있다.

도 1은 위의 프로토콜을 사용하여 생성 된 마이크로 스피어의 시각적 표현이다. 여기에 설명 된 프로토콜은 다양한 크기의 rhCTGF로드 미소를 산출한다. 약간의 미소가 더 큰 (그림 2)있을 수 있지만 마이크로의 가장 큰 부분은 직경이 1 ㎛ 내지 10이됩니다. 원하는 경우, 미세 크기 조정 및 균질화 속도 및 시간, 사용되는 계면 활성제의 ?...

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Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

본래 마우스 독도에 β 세포 분열 촉진 물질의 지속적인 관리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 생분해 성 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) 마이크로 스피어를 사용하여

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

sustained-administration-cell-mitogens-to-intact-mouse-islets-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.2K 조회수.  Vanderbilt University Medical Center. Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.

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High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

고해상도 3D 영상의 전 VIVO</em마이크로 중부 표준시로> 생물 학적 샘플

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

연구

생체공학

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional (3D) tissue wherein hematopoiesis is regulated by spatially organized cellular microenvironments termed niches2-4. The organization of the BM niches is critical for the function or dysfunction of normal or malignant BM5. Therefore a better understanding of the in vivo microenvironment using an ex vivo mimicry would help us elucidate the molecular, cellular and microenvironmental determinants of leukemogenesis6.
Currently, hematopoietic cells are cultured in vitro in two-dimensional (2D) tissue culture flasks/well-plates7 requiring either co-culture with allogenic or xenogenic stromal cells or addition of exogenous cytokines8. These conditions are artificial and differ from the in vivo microenvironment in that they lack the 3D cellular niches and expose the cells to abnormally high cytokine concentrations which can result in differentiation and loss of pluripotency9,10.
Herein, we present a novel 3D bone marrow culture system that simulates the in vivo 3D growth environment and supports multilineage hematopoiesis in the absence of exogenous growth factors. The highly porous scaffold used in this system made of polyurethane (PU), facilitates high-density cell growth across a higher specific surface area than the conventional monolayer culture in 2D11. Our work has indicated that this model supported the growth of human cord blood (CB) mononuclear cells (MNC)12 and primary leukemic cells in the absence of exogenous cytokines. This novel 3D mimicry provides a viable platform for the development of a human experimental model to study hematopoiesis and to explore novel treatments for leukemia.

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

A 3D culture system for hematopoiesis is described using human cord blood and leukemic bone marrow cells. The method is based on the use of a porous synthetic polyurethane scaffold coated with extracellular matrix proteins. This scaffold is adaptable to accommodate a wide range of cells.

정상과 비정상적인 인간 조혈의 전직 생체내 흉내

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional ...

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia6,8-10.
Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways16,23 and parenchyma17,22 of animal models and in vivo human airway14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)18. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described19. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface17.
While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology24. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

A method to image ex vivo pulmonary resection specimens with optical frequency domain imaging (OFDI) and obtain precise correlation to histology is described, which is essential to developing specific OFDI interpretation criteria for pulmonary pathology. This method is applicable to other tissue types and imaging techniques to obtain precise imaging to histology correlation for accurate image interpretation and assessment. Imaging criteria established with this technique would then be applicable to image assessment in future in vivo studies.

의 광 주파수 도메인 영상<em&gt; 예 생체</em&gt; 폐 절제술의 표본 : 조직 병리학 간 상관 관계에 하나에 하나의 이미지를 얻기

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

태반의 맞은 편에 생체이 물과 나노 물질의 전송 속도의 결정을 사용하여<em&gt; 생체</em&gt; 인간 태반 관류 모델

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, heart attack or peripheral arterial diseases. Direct delivery of angiogenic growth factors has the potential to stimulate new blood vessel growth, but is often associated with limitations such as lack of targeting and short half-life in vivo. Gene therapy offers an alternative approach by delivering genes encoding angiogenic factors, but often requires using virus, and is limited by safety concerns. Here we describe a recently developed strategy for stimulating vascular growth by programming stem cells to overexpress angiogenic factors in situ using biodegradable polymeric nanoparticles. Specifically our strategy utilized stem cells as delivery vehicles by taking advantage of their ability to migrate toward ischemic tissues in vivo. Using the optimized polymeric vectors, adipose-derived stem cells were modified to overexpress an angiogenic gene encoding vascular endothelial growth factor (VEGF). We described the processes for polymer synthesis, nanoparticle formation, transfecting stem cells in vitro, as well as methods for validating the efficacy of VEGF-expressing stem cells for promoting angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

We describe the method of programming stem cells to overexpress therapeutic factors for angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Processes described include polymer synthesis, transfecting adipose-derived stem cells in vitro, and validating the efficacy of programmed stem cells to promote angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

생분해 성 고분자 나노 입자를 사용하여 치료 혈관 신생에 대한 프로그래밍 줄기 세포

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Intra-lymph Node Injection of Biodegradable Polymer Particles

Generation of adaptive immune response relies on efficient drainage or trafficking of antigen to lymph nodes for processing and presentation of these foreign molecules to T and B lymphocytes. Lymph nodes have thus become critical targets for new vaccines and immunotherapies. A recent strategy for targeting these tissues is direct lymph node injection of soluble vaccine components, and clinical trials involving this technique have been promising. Several biomaterial strategies have also been investigated to improve lymph node targeting, for example, tuning particle size for optimal drainage of biomaterial vaccine particles. In this paper we present a new method that combines direct lymph node injection with biodegradable polymer particles that can be laden with antigen, adjuvant, or other vaccine components. In this method polymeric microparticles or nanoparticles are synthesized by a modified double emulsion protocol incorporating lipid stabilizers. Particle properties (e.g.&#160;size, cargo loading) are confirmed by laser diffraction and fluorescent microscopy, respectively. Mouse lymph nodes are then identified by peripheral injection of a nontoxic tracer dye that allows visualization of the target injection site and subsequent deposition of polymer particles in lymph nodes. This technique allows direct control over the doses and combinations of biomaterials and vaccine components delivered to lymph nodes and could be harnessed in the development of new biomaterial-based vaccines.

Lymph nodes are the immunological tissues that orchestrate immune response and are a critical target for vaccines. Biomaterials have been employed to better target lymph nodes and to control delivery of antigens or adjuvants. This paper describes a technique combining these ideas to inject biocompatible polymer particles into lymph nodes.

생분해성 폴리머 입자의 림프절 내 주입

Generation of adaptive immune response relies on efficient drainage or trafficking of antigen to lymph nodes for processing and presentation of these ...

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the subsequent attachment and activation of platelets, monocyte/macrophage adhesion, and inflammatory cell signaling events, leading to post-procedural complications. The Chandler Loop Apparatus is an experimental system that allows researchers to study the molecular and cellular interactions that occur when large volumes of blood are perfused over polymeric conduits. To that end, this apparatus has been used as an ex vivo model allowing the assessment of the anti-inflammatory properties of various polymer surface modifications. Our laboratory has shown that blood conduits, covalently modified via photoactivation chemistry with recombinant CD47, can confer biocompatibility to polymeric surfaces. Appending CD47 to polymeric surfaces could be an effective means to promote the efficacy of polymeric blood conduits. Herein is the methodology detailing the photoactivation chemistry used to append recombinant CD47 to clinically relevant polymeric blood conduits and the use of the Chandler Loop as an ex vivo experimental model to examine blood interactions with the CD47 modified and control conduits.

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 챈들러 루프 장치 수정 된 고분자 혈액 도관의 생체 적합성을 평가하기 위해

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

음향 분리기사용 CHO 수확세포 배양액의 1차 해명

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome formulation, liposomes may be preferentially taken up by different cell types in the body. This may influence the efficacy of the therapeutic particle as progression of different diseases is tissue- and cell-type-specific. In this protocol, we present one method for synthesizing and fluorescently labeling liposomes using DSPC, cholesterol, and PEG-2000 DSPE and the lipid dye DiD as a fluorescent label. This protocol also presents an approach for delivering liposomes in vivo and assessing cell-specific uptake of liposomes using flow cytometry. This approach can be used to determine the types of cells that take up liposomes and quantify the distribution and proportion of liposome-uptake across cell types and tissues. While not mentioned in this protocol, additional assays such as immunofluorescence and single-cell fluorescence imaging on a cytometer will strengthen any findings or conclusions made as they permit assessment of intracellular staining. Protocols may also need to be adapted depending on the tissue(s) of interest.

The goal of this protocol is to synthesize fluorescently-labeled liposomes and use flow cytometry to identify in vivo localization of liposomes at a cellular level.

형광 염료 표지 리포솜의 In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake의 준비, 투여 및 평가

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...