Name: dissection of the auditory bulla in postnatal mice: isolation of the middle ear bones and histological analysis
Uploaded: 2017-01-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis at JoVE.com

The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.

Todos los animales procedimientos realizados en este estudio son aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad de Keio (IACUC - número de homologación: 09221) y siguen las directrices institucionales en la Experimentación Animal de la Universidad de Keio para el uso de animales en la investigación. muestras humanas fueron aisladas de un cadáver donado al Departamento de Anatomía de la Facultad de Medicina de la Universidad de Keio, y fueron utilizados de conformidad con las regulaciones institucionales. 1. Aislamiento del Bulla auditivo y de la cápsula <ol><li> La eutanasia a los ratones en un frasco que contiene una plataforma por encima de toallas de papel empapadas en isoflurano o sevoflurano hasta que la ventilación respiratoria deja durante más de un minuto y a continuación, realizar la dislocación cervical. Tenga cuidado para evitar el contacto directo de los ratones con las toallas de papel empapadas. </li><li> Hacer una pequeña incisión transversal en el lado dorsal del cuello y tirar de la piel, aparte hacia la cabeza y la cola con las dos manos para exponer el cuello mu subyacenteEscleritos tejido. </li><li> Decapitar a los ratones en la región cervical, utilizando 14 cm tijeras quirúrgicas agudas. </li><li> Pelar la piel por completo hacia la nariz. Cortar toda la piel junto con el hocico y los incisivos. </li><li> Inserte tijeras en la boca y cortar los músculos maseteros en ambos lados. </li><li> Abrir la mandíbula con cuidado y retire la lengua y la mandíbula inferior juntos. </li><li> Con unas tijeras afiladas, cráneo y fractura de base de cráneo en dos mitades a lo largo del plano medio sagital (Figura 1A, B). </li><li> Con unas pinzas, retire los hemisferios cerebrales y el cerebelo y el tronco cerebral. La bulla auditiva y la cápsula están situados lateralmente al cerebelo y el tronco cerebral. Tenga en cuenta que la bulla auditiva es lateral adicional a la cápsula auditivo (Figura 1C, D). </li><li> Diseccionar la bulla y la cápsula con el hueso del cráneo circundante (Figura 1E). </li><li> Introducir el espécimen en un plato que contiene buffer fosfato salino (PBS) pH 7,4 a temperatura ambiente. </li><li> Tnder un microscopio de disección binocular, el uso de fórceps de separar los huesos que rodean y tijeras para cortar el límite aflojado alrededor de la bulla y la cápsula (Figura 1F). Los huesos que rodean retirados son los basioccipital (borde ventral), exoccipital (frontera ventro-posterior), supraoccipital (borde posterior), interparietal, parietal (borde dorsal), escamoso (frontera dorso-anterior), alisphenoid (borde anterior), y basisphenoid (frontera antero-ventral) huesos. Tenga en cuenta que el proceso styliform (Sp), que apoya la apertura del tímpano de la trompa de Eustaquio 41, es distinta de la apófisis estiloides del hueso temporal. </li></ol> 2. Aislamiento de los huesecillos auditivos: martillo, yunque y estribo <ol><li> Maleo <ol><li> Con las dos tijeras y pinzas pequeñas, retire la parte lateral del conducto auditivo externo al tympanicus surco de modo que la membrana timpánica es visible (Figura 2 A, B). </li><li> Retire parte de la membrana timpánica y hueso timpánico cerca de la malleal processus brevis (apófisis orbicular, ver Discusión), tanto en la ventral (de puntos) y posterior (#) paredes (Figura 2C). El músculo tensor del tímpano martillo y ahora debe ser expuesto (Figura 2D, E). </li><li> Levantar el martillo (Figura 2F) y cortar el músculo tensor del tímpano con el borde biselado de una aguja G 27 (Figura 2G). Tenga en cuenta que el manubrio malleal se fija firmemente a la membrana timpánica, como se ve en otros mamíferos. </li><li> Desprender la membrana timpánica con cuidado del manubrio, que es frágil. Quitar el hueso timpánico para revelar los tres huesecillos del oído. </li><li> Dislocar el martillo del yunque en la articulación de huesecillos (Figura 2H). </li><li> Aislar el malleus fracturando el proceso anterior en el goniale. </li></ol></li><li> Yunque y estribo <ol><li> aislar tque incus cortando el ligamento posterior del yunque en el corto crus (Figura 3A). </li><li> Aislar el estribo por el corte de la arteria estapedial cerca del estribo con el borde biselado de una aguja G 27 (Figura 3 B, C). Si es necesario, cortar el tendón del músculo estapedial en el proceso muscular del estribo con la aguja. </li><li> Insertar una aguja de coser (o una aguja de grabado) en el agujero obturador de estribo y levantar el estribo. Después de retirar el estribo, la abertura de la ventana ovalada debe ser claramente visible (Figura 3D). </li></ol></li></ol> 3. Incorporación de Bulla auditivo y de la cápsula <ol><li> Preparación para incrustar en bloques de parafina <ol><li> Aislar la bulla y la cápsula como se describe en la Sección 1. </li><li> Cortar el extremo anterior de la bulla (el proceso styliform) con unas tijeras, sumerja la bulla y la cápsula en el 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS a 4 °C, y permitir que el fijador para entrar en la bulla. Si el aire queda atrapado en la bulla, quitarlo con una aguja y una jeringa. Deja la bulla y la cápsula en el fijador a 4 ° CO / N en un rotador tubo. Precaución: PFA es tóxico y debe ser manejado con cuidado. </li><li> Lavar una vez con PBS. </li><li> Descalcificar bulla y cápsula para una semana a 4 ° C en 10% de dihidrato de sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA-2Na), base Tris 100 mM, pH 7,0, en un tubo de 2 ml. Cambiar el tampón cada dos días. </li><li> Lavar una vez con PBS. Las muestras se pueden almacenar en 70% de etanol en agua a 4 ° C. Opcionalmente, la transferencia a 70% de etanol a través de una serie graduada de alcohol (30%, 50%, 70% en agua). </li><li> En un procesador de tejidos, deshidratar especímenes en una serie graduada de soluciones de etanol (70%, 2x 95%, 3x 100%, cada uno 1 h), claras en xileno (4x, cada 1 h a 40 ° C), y de infiltrarse en las muestras con cera de parafina fundida 42. Opcionalmente, sustituto de xileno con clearin tejido comercialg de solución (por ejemplo, Histo-Clear). </li><li> Descargar especímenes del procesador, y sacarlos de sus casetes. </li><li> En un sistema de consola tejido incrustación, lugar especímenes en moldes llenos de cera de parafina fundida. Proceder a la incrustación (Sección 4). </li></ol></li><li> Preparación para empotrar en los bloques congelados (método de la película de Kawamoto) 43 <ol><li> Aislar la bulla y la cápsula como se describe en la Sección 1. </li><li> Cortar el extremo anterior de la bulla (el proceso styliform) con unas tijeras, sumergir la bulla y la cápsula en fijador (2% o 1% en lugar de PFA 4% en PBS para conservar la antigenicidad) a 4 ° C. Si queda aire dentro de bulla, y eliminar el uso de una aguja y una jeringa. Deja la bulla y la cápsula en el fijador a 4 ° CO / N en un rotador tubo. </li><li> Lavar bulla y la cápsula de forma rápida en PBS y se sumerja inmediatamente en el compuesto crio-incrustación de líquido a 4 ° C. </li><li> Importante: Eliminar las burbujas de aire en su caso en el medioy oído externo a través de la aspiración con una aguja, y añadiendo el compuesto de la incrustación con fórceps. Proceder a la incrustación (Sección 4). </li></ol></li></ol> 4. Orientación de la muestra e incrustación NOTA: El conjunto bulla y de la cápsula deben ser dispuestos en una orientación particular durante la incrustación para cortar secciones deseadas. Los procedimientos descritos a continuación se utilizan para la sección del martillo en distintas orientaciones. <ol><li> Longitudinal (parasagital) seccionamiento del martillo <ol><li> Coloque la cara lateral de la bulla o meato auditivo externo hacia abajo en parafina caliente (o compuesto de la crio-incrustación). Ajuste la orientación de manera que el cuello y transversal lámina del martillo son paralelas a la parte inferior horizontal de la placa de la incrustación (Figura 4A - C). Tenga en cuenta que la membrana timpánica está inclinado en un ángulo de aproximadamente 30 ° con la vertical en la cabeza del ratón (Figura 4A; la Figura 59 en Kampen <sup&gt; 44). </li></ol></li><li> Seccionamiento Horizontal del martillo <ol><li> Coloque la cresta dorsal horizontalmente en parafina caliente (o compuesto crio-incrustación). Ajustar la orientación de la bulla y la cápsula de manera que el cuello y transversal lámina del martillo son perpendiculares a la parte inferior del plato de la incrustación (Figura 4D - F). </li></ol></li><li> Seccionamiento frontal (secciones transversales) del manubrio y la membrana timpánica 5 <ol><li> Coloque el manubrio malleal en parafina caliente (o compuesto de la crio-incrustación) de tal manera que es perpendicular a la parte inferior de la placa de la incrustación. </li></ol></li><li> Enfriar el bloque a temperaturas adecuadas para endurecer la cera de parafina en un sistema de la consola de tejido incrustación (otra alternativa es utilizar el compuesto crio-incrustación en un baño de hielo seco / hexano). </li><li> bloque de tejido proceso y secciones cortadas utilizando procedimientos de rutina. Por ejemplo, las secciones de parafina mancha con hematoxilina y eosina (H &amp; #38; E), safranina O (para el cartílago), o para la actividad de tartrato resistente a la fosfatasa ácida (TRAP) (por osteoclastos) 3, o por inmunohistoquímica. Cryosections undecalcified son adecuados para el etiquetado hueso utilizando fluorocromos 14, alizarina tinción con rojo para el calcio, y la inmunofluorescencia 42. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

A continuación, presentamos un método útil para aislar la bulla auditiva y de la cápsula en ratones postnatales. Antes de P12, los tejidos son frágiles y pueden dañarse durante el aislamiento. Después de P12, la bulla auditiva y la cápsula pueden ser fácilmente aislados de los tejidos circundantes. La disección de la bulla de la cabeza antes de seccionar tiene varias ventajas. En primer lugar, la cavitación y el crecimiento posnatal de la bulla auditiva se presentan con más activamente de P6 en adelante y están completos, por P14 50. El tejido mesenquimal entre la membrana timpánica y la pared coclear se sustituye por aire a través del proceso de cavitación. El aire resultante en la cavidad del oído medio puede impedir el contacto entre los tejidos y líquidos durante la fijación, la descalcificación y la incrustación. Es más fácil de eliminar el aire de la bulla auditiva aislados cortando el final (proceso styliform) anterior en lugar de intentar hacerlo en la bulla no aislado. En segundo lugar, la orientación del martillo (y la membrana timpánica) no es verticalEn la cabeza. Por tanto, es más fácil de la sección del martillo en planos deseados mediante la incorporación de la bulla auditiva aislado y la cápsula en una orientación determinada. Una vez aislado, bulla auditiva y cápsulas son útiles para numerosos análisis. Por ejemplo, la alta resolución de rayos X de micro-CT puede revelar la morfología de la microestructura del hueso tales como capilares osteogénicas en el martillo 14. El microscopio de disección stereofluorescence es una poderosa herramienta para visualizar estructuras en la evaluación de reportero ratones que expresan las proteínas fluorescentes en el oído medio o interno 33. Además, varios in vivo o ex vivo de fluorescencia métodos de marcaje y detección de inmunofluorescencia conjunto de montaje podrían llevarse a cabo. La microscopía de fluorescencia hoja de luz también es útil para el análisis tridimensional 51. Aunque no se describe aquí, las diversas estructuras anatómicas asociadas con la bulla auditiva y la cápsula tales como nervios periféricos, los vasos sanguíneos, yla membrana timpánica en el oído medio también se puede evaluar usando este protocolo. Tenga en cuenta que el seccionamiento de parafina requiere descalcificación de tejidos óseos antes de la incrustación y por lo tanto no permite el análisis de la mineralización. Por el contrario, el método de película Kawamoto 43 usado para preparar las secciones congeladas se puede realizar sin descalcificación y es adecuado para estudios de mineralización utilizando en técnicas de etiquetado de hueso in vivo o tinción especial tal como la tinción de alizarina. condiciones de crio-seccionamiento deben optimizarse según basada en la edad del ratón. Por ejemplo, se recomienda una temperatura de menos fresco dentro de la cámara del criostato para las muestras más antiguas de ratón para minimizar el daño a las secciones. En el ratón, el término correcto para el prominente protuberancia semiesférica del martillo es &quot;apófisis orbicular&quot;. Sin embargo, el término &quot;brevis processus&quot; ha sido ampliamente utilizado para indicar la apófisis orbicular para más THotros dos décadas, en particular entre los biólogos del desarrollo del ratón 16,20,22-25. &quot;Processus brevis&quot; originalmente se refería al proceso lateral (processus lateralis), que difiere de la apófisis orbicular. En los seres humanos, un proceso lateral se asemeja a una ligera proyección cónica forma la línea general de unión a la membrana timpánica, que se extiende desde el manubrio (no se ve en la figura 6B, la vista medial). En ratones, el proceso lateral es también una proyección del manubrio en el extremo opuesto a la umbo 48. La pars flaccida de la membrana timpánica está por encima del proceso lateral del martillo. apófisis orbiculares no es evidente en el martillo humano.

Los tres huesecillos del oído del oído medio, a saber los martillo, yunque y estribo, forman una cadena auditivo mamífero específico que transmite el sonido de la membrana timpánica en el oído interno, o cóclea 1,2. La función auditiva puede ser evaluada en ratones mediante la medición de la respuesta auditiva del tronco cerebral (ABR) Umbrales de 3-6, y la vibración del martillo detrás de la membrana timpánica pueden ser monitoreados utilizando láser Doppler vibrometría (LDV) 7. Mediante la combinación de la ABR, LDV, y mediciones de productos de distorsión de emisiones otoacústicas (DPOAE), pérdida de audición conductiva puede ser discriminado por deterioro neurosensorial 8. Se necesitan modelos animales de enfermedades del oído, dada la importancia de la audición y la salud del oído para el bienestar de los pacientes de todas las edades. Por ejemplo, la otitis media es una infección de oído muy común que se observa en lactantes y niños humanos, y graves, otitis media aguda y sus complicaciones puede ocurrir si la condición no se trata con antibióticos apropiados 9. Los modelos de ratón de la otitis media podrían resultar útiles en la comprensión de la patogénesis y en el desarrollo de tratamientos 10,11. Osículos murino, que (excepto por la parte goniale del martillo) se forman por osificación endocondral 12,13, son altamente relevantes para el estudio de metabolismo de los huesos y la morfogénesis. En primer lugar, su pequeño tamaño permite un análisis de alta resolución de los huesos con un periostio intacto el uso de rayos X o la microscopía de fluorescencia 14. En segundo lugar, el metabolismo óseo aberrantes, tales como la resorción ósea excesiva o deficiente, o interacciones con discapacidad entre las células óseas 15, puede ser analizada como un contribuyente potencial para la audición 3,4,7 pérdida. En tercer lugar, la morfogénesis de huesecillos anormal se informa en varios ratones con deficiencia de genes, tales como los animales que carecen Hoxa2 16-19, 20-22 MSX1, Prrx1 23, goosecoid(GSC) 24,25, Bapx1 13, 26 Tshz1, dusp6 (Mkp3) 27, Noggin (Nog) 28, 29 Fgfr1, receptores de hormonas tiroideas (Thra, thrB) 5, Bcl2 30 y otros 1,31, o en ratones que sobreexpresan Hoxa2 32. Por último, a pesar de su pequeño tamaño, las estructuras asociadas con huesecillos tales como los músculos y las articulaciones 33 34,35 son accesibles. huesecillos del ratón son más pequeños que los huesecillos humanos, pero hay que destacar que el oído medio del ratón no es una versión en miniatura de su homólogo humano. Por ejemplo, en ratones, la arteria estapedial, que pasa a través del anillo del estribo, persiste durante toda la vida 36, mientras que en los seres humanos, la arteria estapedial embrionario desaparece durante la gestación. Además, la morfología del martillo de ratón difiere de la de THhueso humano e (ver Figura 6). En ratones, la auditiva (timpánica) bulla encierra la cavidad del oído medio lleno de aire, mientras que en los seres humanos, las células mastoideas compuestas de hueso trabecular en el hueso temporal alberga la cadena de huesecillos en lugar de una bulla 37. En ambas especies, la cápsula auditiva (cápsula ótica, laberinto óseo) encierra la cóclea y los canales semicirculares del oído interno. La biología comparativa y evolutiva del oído medio ha sido revisado extensamente 38-40. El protocolo previsto inferior a la primera se describe cómo diseccionar la bulla auditiva y de la cápsula, que consisten principalmente en el oído medio y el oído interno, respectivamente. Este protocolo también demuestra cómo aislar el martillo, yunque y estribo de la bulla auditiva. Por último, muestra cómo orientar la bulla auditiva y de la cápsula para incrustar en preparación para seccionar los tejidos de los huesecillos del oído.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Tools/Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paper towel</td><td>Daio Paper Corporation</td><td>703347</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Glass Jar</td><td>Various</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>14 cm surgical scissors</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>91400-14</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Extra fine scissors-straight</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>14084-08</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Fine Forceps Angled 45&lt;b&gt;&amp;deg;&lt;/b&gt;</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>11063-07</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>for routine dissection</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>for movies&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Injection needle 27 G</td><td>TERUMO</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>Syringe (1 mL)</td><td>TERUMO</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Marking Pin</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator RT-50</td><td>TAITEC</td><td>0000165-000</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/</td></tr><tr><td>TC-65 Tungsten blade</td><td>Leica</td><td>14021626379</td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Stainless containers</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Cryofilm type IIC</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Silane coated slide (New Silane II)</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>511617</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Matsunami</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Tissue processor</td><td>Sakura Finetek</td><td>VIP-5</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Tissue Embedding Console System</td><td>Sakura Finetek</td><td>Tissue-Tek TEC 5&amp;nbsp;</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sliding microtome for paraffin</td><td>Yamato Kohki Industrial</td><td>REM-710</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Path Blade+pro for hard tissue</td><td>Matsunami</td><td>PB3503C</td><td>for paraffin section</td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>RIGAKU</td><td>R_mCT2</td><td>http://www.rigaku.com/en</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Maruishi pharmaceutical Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>wako</td><td>191-01665</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>wako</td><td>285-14</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 12H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>wako</td><td>196-02835</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>wako</td><td>287-21</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA, EM Grade)</td><td>TAAB</td><td>P001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-2Na</td><td>wako</td><td>15111-45</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Super Cryoembedding Medium</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Dry Ice</td><td>Various</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Hexane</td><td>wako</td><td>080-03423</td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Super Cryomouting Medium type R2</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sakura Finetek</td><td>781001A0107</td><td></td></tr><tr><td>Histo-Clear</td><td>NDS</td><td>HS-200</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>DOJINDO</td><td>340-00433</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin&amp;nbsp;</td><td>wako</td><td>131-09665</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>wako</td><td>051-06515</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection of the auditory bulla in postnatal mice: isolation of the middle ear bones and histological analysis

En la mayoría de los mamíferos, huesecillos del oído medio, incluyendo el martillo, yunque y estribo, son los huesos más pequeños. En ratones, una estructura ósea llamada la bulla auditiva alberga la cadena de huesecillos, mientras que la cápsula auditiva encierra el oído interno, a saber, la cóclea y canales semicirculares. huesecillos murinos son esenciales para la audición y por lo tanto de gran interés para los investigadores en el campo de la otorrinolaringología, pero su metabolismo, el desarrollo y la evolución son altamente relevantes para otros campos. Metabolismo óseo alterado puede afectar la función de la audición en ratones adultos, y varios ratones de genes deficientes en mostrar cambios en la morfogénesis de los huesecillos del oído en el útero. A pesar de huesecillos del oído murinos son pequeñas, su manipulación es factible si uno entiende su orientación anatómica y la estructura 3D. A continuación, describimos cómo diseccionar la bulla auditiva y la cápsula de ratones postnatales y luego aislar huesecillos individuales mediante la eliminación de parte de la bulla. También discutimos cómo emcama la bulla y la cápsula en diferentes orientaciones para generar parafina o secciones congeladas adecuados para la preparación de secciones longitudinales, horizontales, o frontales del martillo. Por último, se apuntan las diferencias anatómicas entre el ratón y huesecillos del oído humano. Estos métodos serían útiles en el análisis de los aspectos patológicos, de desarrollo y evolutivas de huesecillos del oído y el oído medio en ratones.

Este protocolo presenta un método para aislar los huesecillos de la bulla auditiva ratón. En primer lugar, la bulla y la cápsula se diseccionaron en una sola pieza del cráneo (Figura 1). La bulla diseccionado se utiliza entonces para preparar el malleus (Figura 2) y el yunque y el estribo (Figura 3). Hitos de la bulla auditiva y la cápsula son el proceso styliform en el extremo anterior de la bulla, la cresta dorsal, el canal semicircular anterior, y la fosa subarcuate (Figura 1F). La tomografía de imágenes microtomografía (CT) revela huesecillos en la bulla auditiva, así como las orientaciones óptimas para seccionamiento longitudinal y horizontal de los osículos (Figura 4). Para seccionamiento parafina longitudinal del martillo, la bulla y la cápsula fueron descalcificadas en EDTA a 4 ° C durante una semana, incrustado en un pabloque raffin en la orientación mostrada en la Figura 4 A - C, se seccionaron a 4 micras, y luego teñidas utilizando H &amp; E. El martillo unido a la membrana timpánica en el bulla auditiva reveló osificación endocondral en curso en P14 (Figura 5A). Para visualizar la formación de hueso nuevo, calceína (30 mg / g de peso corporal) se inyectó intraperitoneal en un ratón P20, y la bulla y la cápsula se aislaron 24 h más tarde en P21. La muestra sin descalcificación se ha incrustado congelado y luego cryosectioned a 6 micras utilizando una película adhesiva basada en el método de Kawamoto 43. Después de la tinción nuclear con DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol), se observó la sección bajo un microscopio de fluorescencia. Señales de calceína (verde) revelaron la formación de hueso nuevo en el martillo (m), bulla y la cápsula (Figura 5B). Para seccionamiento horizontal del martillo, la bulla auditiva aislado de un ratón de 5 semanas de edad, se ha incrustado congelado sin descalcificación (para elOrientación ver Figura 4D - F), cryosectioned a los 6 micras utilizando el método de Kawamoto, y se tiñe usando H &amp; E. Seccionamiento horizontal de la brevis malleal processus (MPB) también muestra la cóclea (Figura 5C). Una vista medial de los huesecillos del oído derecho aisladas de un ratón P31 muestra las características típicas del martillo del ratón, (o persa 45 de espada) manubrio, un prominente brevis processus (apófisis orbicular a saber, el &quot;delta-gaviota-ala-como&quot; , ver Discusión), y la lámina transversal (Figura 6). Tenga en cuenta que el proceso anterior (processus anterior) fue fracturado en el procedimiento de disección alrededor de la goniale y se separó de la anillo timpánica (ectotimpánico). Esta muestra representativa exhibe una articulación intacta incudomalleolar entre el martillo y el yunque, mientras que la articulación incudoestapedial está dislocado. inserciones tendinosas en el malleal yprocesos musculares estapediales son detectables (Figura 6A, asteriscos). La Figura 6B compara ratón y huesecillos del oído humano con la misma ampliación. Las diferencias entre especies, aparte de tamaño, son los siguientes. El manubrio malleal es en forma de ala en ratones, pero parecido a un club en el ser humano. El ángulo entre el eje anatómico (o el eje de rotación, la línea a través del proceso anterior del martillo y la corta del yunque) y el manubrio es mucho menor en los ratones y los dos son casi paralelas, a diferencia de casi perpendicular en los seres humanos 6,46-48. En huesecillos humanos, los estudios revelan que vibrometric la articulación incudo-maleolar es móvil en lugar de funcionalmente fijado 49. El martillo de ratón exhibe una amplia y delgada y plana de la lámina transversal no es evidente en los seres humanos 47. En ratones, la parte anterior processus fusiona con los huesos membranosos, a saber, la goniale y el tímpanoel anillo C, mientras que en los seres humanos la anterior processus se reduce a una pequeña espícula de hueso 41. El estribo de ratones y seres humanos también difiere: en ratones, la crus anterior es curvo y la crus posterior es más recta mientras que en los seres humanos, la crus anterior es más recta que la crus posterior. Vale la pena señalar que la cabeza del martillo en relación con el tamaño del cuerpo se agranda de forma masiva en especies como el topo dorado, lo que demuestra una variabilidad significativa en las relaciones alométricas de &quot;los más pequeños&quot; huesos 48. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig1.jpg" /> Figura 1. La disección de la cápsula y auditiva Bulla. (A) el cráneo de un ratón P31 se divide en mitades derecha e izquierda. A, anterior; P, posterior; L, izquierda; R, derecha. (B) la superficie medial de la mitad derecha de la cabeza dividido en dos partes, sin piel. Cx, corteza cerebral; Cb, cerebelo; Bs, Brainstem. D, dorsal; V, ventral. (C) La eliminación del cerebro con fórceps. (D) vista medial de la cápsula auditiva en el cráneo derecha. La cresta dorsal (puntas de flecha) se encuentra entre la fosa craneal media (mpc) y la fosa craneal posterior (PCF) y separa las superficies ventro-posterior de la cápsula auditiva dorso-anterior y. Barra de escala, de 2 mm. (E) Un mayor aumento de la bulla auditiva y de la cápsula (vista medial). Co, cóclea; VII, del nervio facial; VIII, nervio vestíbulo; AC, anterior (superior) del canal semicircular; Sf, la fosa subarcuate, que alberga el paraflocculus cerebelosa. Barra de escala, 1 mm. (F) Micrografía de bulla auditiva aislados y la cápsula (vista medial). Sp, styliform proceso. Barra de escala, 1 mm. (A - E), ratón P31. (F), ratón P33. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig2.jpg" /> Figura 2. Disección del martillo. (A) Vista ventrolateral de una bulla auditiva derecha y de la cápsula. El tympanicus surco (ST, flecha de trazos) es el sitio de unión de la membrana timpánica. El lateral hueso a la ST es parte del oído externo y el medial hueso a la ST forma el suelo de la cavidad del oído medio. A, anterior; P, posterior; D, dorsal; V, ventral. (B) Vista después de la eliminación del conducto auditivo externo para revelar la membrana timpánica (TM) incluyendo la pars flaccida (PF) y pars tensa (Pt). (C) La eliminación de partes del hueso timpánico (líneas de puntos y #) cerca de la malleal processus brevis (MPB). m, martillo; mM, manubrio malleal. Flecha, burbuja de aire en la cavidad del oído medio visto a través de la membrana timpánica. (D) martillo expuesto. Martillo de cabeza se indica. Punteadolínea indica la superficie articular del yunque. (E) tendón del músculo tensor del tímpano (TT) unido al martillo. (F) El tensor del tímpano se tira cuando se levanta el martillo. *, Proceso muscular. (G) tensor del tímpano se corta mediante una aguja. (H) Tres huesecillos del oído después de la eliminación de la membrana timpánica. La articulación incudo-maleolar está dislocado. m, martillo; i, yunque; s, estribo; Ir, goniale (fusionado al anillo de martillo y del tímpano, TR). Todas las barras de escala, de 0,5 mm. (A, H), de ratón P33. (B - G), ratón P31. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig3.jpg" /> Figura 3. La disección del yunque y el estribo. (A) y Incusestribo después de la eliminación del martillo. La arteria estapedial (SA) pasa a través del estribo (s). La línea punteada indica la superficie articular del yunque. Tenga en cuenta que el corto crus (ICB, crus breve) del yunque (i) se fija por el ligamento posterior (no mostrado). Asterisco, proceso muscular del estribo. (B) del estribo después de la eliminación del yunque. punta de la aguja se utiliza para cortar la arteria estapedial (SA). Flecha, dirección del flujo sanguíneo. La línea punteada indica la superficie articular del estribo. (C) La arteria estapedial se elimina de estribo. X indica el extremo del corte de la arteria estapedial (SA). (D) La ventana oval (Ow, ventana oval o vestibular fenestra) es visible después de la retirada del estribo. Rw, ventana redonda (fenestra rotunda o cócleas fenestra). Las barras de escala, de 0,5 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta</a>figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig4.jpg" /> Figura 4. La orientación de la Bulla auditiva y la cápsula durante la incrustación de Longitudinal (parasagital, A - C) y horizontal (D - E) seccionamiento del martillo. (A - C) El cuello y transversal lámina del martillo se colocan en paralelo a la parte inferior de la incrustación de plato. (A) Vista lateral: Imagen micro-CT para mostrar la incrustación del martillo justo en la bulla (pseudocoloreada azul). El martillo y el yunque se pseudocoloreada verde. La línea, el plano de corte deseado. línea continua, parte inferior de la incrustación de plato. m, martillo; puntas de flecha, la cresta dorsal. M, medial; L, lateral; D, dorsal; V, ventral. (B) Vista superior: Imagen micro-CT. Tenga en cuenta que el extremo anterior de la bulla (proceso styliform) se eliminó. i, yunque. (C) Vista superior: micrografía (tomada con unafiltro de color). AC, anterior (superior) del canal semicircular; Sf, la fosa subarcuate; Sp, styliform proceso. A, anterior; P, posterior; D, dorsal; V, ventral. (D - F) El brevis processus del martillo se coloca perpendicular a la parte inferior de la incrustación de plato. (D) Vista lateral: Imagen micro-CT para mostrar la incrustación del martillo derecha. La línea, el plano de corte deseado. línea continua, parte inferior de la incrustación de plato. (E) Vista superior: Imagen micro-CT. mM, manubrio malleal. (F) Vista superior: micrografía (tomada con un filtro de color). Las barras de escala, 1 mm. Imágenes Micro-CT se obtuvieron a una resolución voxel de 5 micras, tal como se describe previamente 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig5.jpg" /> Figura 5. Histología. (A) tinción H &amp; E. Sección longitudinal (parasagital) del martillo incrustado en parafina derecha (m) en la bulla auditiva (línea de puntos) en P14. TM, la membrana timpánica. Etiquetado de hueso (B) calceína. Sección longitudinal del martillo congelado, sin descalcificar izquierda (m) en la bulla auditiva en P21. Contratinción, DAPI. (C) tinción H &amp; E. Sección horizontal de la brevis congelado, sin descalcificar la izquierda malleal processus (MPB) en la bulla auditiva y la cápsula (5 semanas de edad del ratón). Co, cóclea. Las barras de escala, 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig6.jpg" /> Figura 6. Vista medial de huesecillos auditivos. (A) huesecillos del oído derecho de P31 ratón. A, anterior; P, posterior; D, dorsal; V, ventral. Barra de escala, 1 mm. martillo de cabeza (caput mallei, Capitulum mallei); cuello (Collum mallei); la lámina (lámina transversal); mM (manubrio mallei); asterisco negro (proceso muscular del martillo); MPa (Processus anterior, Processus gracilis); MPB (processus brevis); cuerpo de yunque (Corpus incudis); ICB (Crus breve, corta crus, proceso corto); ICL (longum Crus, a largo crus, proceso largo); iPL (lenticular Processus, proceso lenticular, Sylvian apófisis); la cabeza del estribo (Caput stapedis); asterisco blanco (proceso muscular del estribo); SCA (anterius Crus, crus anterior); SCP (Crus posterius, crus posterior); stapedis base (Base, footplate); SOF (agujero obturador, foramen intercrural). (B) huesecillos del oído derecho de un 76 años de edad, hembra humana (Cortesía del Departamento de Anatomía de la Keio University School of Medicine). Los huesecillos del ratón P31 (inferior derecha) se crean imágenes con el mismo aumento que el utilizado para la cadena de huesecillos humanos. curvflechas ed indican el ángulo entre el eje anatómico y el manubrio (líneas de puntos). Barra de escala, de 2 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

La disección de la Auditivo Bulla en ratones postnatales: Aislamiento de los huesos del oído medio y el análisis histológico

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

dissection-auditory-bulla-postnatal-mice-isolation-middle-ear-bones

Research

JoVE Journal

Biology

29.9K vistas.  Keio University School of Medicine. We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis. 

Video: Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current regenerative medicine strategies have focused on transplanting stem cells or genetic manipulation of surrounding support cells in the inner ear to encourage replacement of damaged stem cells to correct hearing loss. Yet, the extracellular matrix (ECM) may play a vital role in inducing and maintaining function of hair cells, and has not been well investigated. Using the cochlear ECM as a scaffold to grow adult stem cells may provide unique insights into how the composition and architecture of the extracellular environment aids cells in sustaining hearing function. Here we present a method for isolating and decellularizing cochleae from mice to use as scaffolds accepting perfused adult stem cells. In the current protocol, cochleae are isolated from euthanized mice, decellularized, and decalcified. Afterward, human Wharton&#39;s jelly cells (hWJCs) that were isolated from the umbilical cord were carefully perfused into each cochlea. The cochleae were used as bioreactors, and cells were cultured for 30 days before undergoing processing for analysis. Decellularized cochleae retained identifiable extracellular structures, but did not reveal the presence of cells or noticeable fragments of DNA. Cells perfused into the cochlea invaded most of the interior and exterior of the cochlea and grew without incident over a duration of 30 days. Thus, the current method can be used to study how cochlear ECM affects cell development and behavior.

The goal of this protocol is to demonstrate an effective method to decellularize and decalcify mouse cochleae for utilization as scaffolds for tissue engineering applications.

Un protocolo para Decellularizing ratón cócleas para ingeniería de tejidos del oído interno

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Investigación

Bioingeniería

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Todo el montaje La disección y de inmunofluorescencia del Adulto ratón cóclea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Neurociencias

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

El Enfoque del ratón Ronda-ventana para ototóxicos Agente de entrega: Una rápida y técnica fiable para la inducción de degeneración de las células cocleares

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

Medicina

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.

Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

Evaluación de planar-Cell-polaridad fenotipos en ciliopatía ratón mutante cóclea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Cryosectioning and Immunostaining Mouse Inner Ear Tissue: From Embryonic to Adult Stages

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is to provide a straightforward and standardized method for inner ear tissue processing for researchers, possibly new to the field, interested in working with the mouse cochlea. Included here are protocols for dissection, fixation, embedding, cryosectioning, and immunostaining. Section immunostaining is one of the best methods for examining individual cells within the context of the entire cochlea.
Key steps include dissecting the inner ear away from the skull, fixing the tissue using 4% paraformaldehyde, embedding with Optimal Cutting Temperature compound, cryosectioning, and immunostaining with antibodies targeting specific proteins expressed by the cochlea.
Included in our methods are special considerations made for the cochlea given its 
shape and structure.&#160;Reasonably good focus and dissection skills are needed, as tissue damage can affect the quality of immunostaining and consistency among samples. However, with the procedures we outline, most users can be trained in a few weeks to make beautiful preparations. Overall, this protocol offers a valuable way to promote research to understand auditory development, function, and disease in mouse models.

This protocol, intended for novice users of mouse inner ear tissue, comprehensively details steps for processing mouse inner ears at different developmental stages for section immunostaining.

Criosección e inmunotinción de tejido del oído interno de ratón: desde la etapa embrionaria hasta la adulta

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is ...

Biología del Desarrollo

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of hearing. Improvement of the implant technology is needed if CI users are to perceive music and perform in more natural environments, such as hearing out a voice with competing talkers, reflections, and other sounds. Such improvement requires experimental animals to better understand the mechanisms of electric stimulation in the cochlea and its responses in the whole auditory system. The mouse is an increasingly attractive model due to the many genetic models available. However, the limited use of this species as a CI model is mainly due to the difficulty of implanting small electrode arrays. More details about the surgical procedure are therefore of great interest to expand the use of mice in CI research.
In this report, we describe in detail the protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in the C57BL/6 mouse strain. We demonstrate the functional efficacy of this procedure with electrically-evoked auditory brainstem response (eABR) and show examples of facial nerve stimulation. Finally, we also discuss the importance of including a deafening procedure when using a normally hearing animal. This mouse model provides a powerful opportunity to study genetic and neurobiological mechanisms that would be of relevance for CI users.

Animal models of cochlear implants can advance knowledge of the technological bases of treating permanent sensorineural hearing loss with electrical stimulation. This study presents a surgical protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in mice as well as the functional assessment with auditory brainstem response.

Cirugía de implante coclear y eléctricamente evocada médula oblonga auditivo respuesta grabaciones en ratones C57BL/6

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

Evaluación morfológica y funcional de sinapsis de cinta en regiones de frecuencia específica de la Cóclea de Ratones

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Preparación de la superficie coclear en el ratón adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the human phenotypes. Although important progress has been done in the understanding of the development and function of the neurosensory epithelia of the cochlea and vestibula, limited knowledge is available regarding the development, cellular composition, molecular pathways and functional characteristics of the endolymphatic sac. This is, in large part, due to the difficulty of visualizing and microdissecting this tissue, which is an epithelium comprised of only one cell layer. The study presented here describes an approach to access and microdissect the endolymphatic sac from the wild-type mouse inner ear at different ages. The result of a similar dissection is shown in a pendrin-deficient mouse model of enlargement of the vestibular aqueduct. A transgenic mouse with a fluorescent endolymphatic sac is presented. This reporter mouse can be used to readily visualize the endolymphatic sac with limited dissection and determine its size. It can also be used as an educational tool to teach how to dissect the endolymphatic sac. These dissection procedures should facilitate further characterization of this understudied part of the inner ear.

<meta charset="utf8"></head><body>Disección del saco endolinfático de ratones

This study describes how to dissect the endolymphatic sac from the inner ear of the mouse at different ages. The result of a similar dissection is shown in an Slc26a4-null mouse model of enlargement of the endolymphatic sac. A transgenic mouse with a fluorescent reporter expressed in the endolymphatic sac is presented as a model to readily visualize the endolymphatic sac, and educational tool.

Disección del saco endolinfático de ratones

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...

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Disección del saco endolinfático de ratones

Disección del saco endolinfático de ratones