El saco endolinfático es necesario para el desarrollo normal del oído interno. Dado que es inaccesible in situ para estudios estructurales, fisiológicos y moleculares, su disección a partir de modelos animales, especialmente modelos de ratón, es esencial. La disección y preparación del saco endolinfático es extremadamente difícil debido a su estructura epitelial delgada y delicada, y a su proximidad y adherencia a los tejidos adyacentes.
Nuestro enfoque facilita la visualización e identificación de un saco y su separación de los tejidos adyacentes. Las enfermedades y trastornos que afectan el funcionamiento normal del saco endolinfático pueden provocar la pérdida de la audición y el equilibrio. Nuestra técnica es esencial para dilucidar los procesos celulares, moleculares y fisiológicos que subyacen a las funciones del saco endolinfático.
El demostrará el procedimiento Hyun Jae Lee, un becario visitante postdoctoral de mi laboratorio. Comience organizando la preparación del oído interno en una placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros que contenga PBS con la raíz del octavo nervio craneal orientada hacia arriba. Con una pinza n.º 4, sujete el tejido en la cóclea e identifique el acueducto vestibular, los canales semicirculares anterior y posterior, el crus común y el seno sigmoideo.
A continuación, utilice una aguja de calibre 27 montada en una jeringa de un mililitro para incidir la duramadre y el acueducto vestibular, así como los tejidos conectivos subyacentes que rodean el saco endolinfático. Después de hacer una incisión en el tejido conectivo lateral al saco endolinfático, use fórceps para sujetar el tejido conectivo y pelarlo tirando de él para separarlo del hueso temporal. Retire con cuidado cualquier residuo restante y separe el epitelio del saco endolinfático de los tejidos circundantes.
Para la disección del saco endolinfático abierto, sostenga la parte del tallo de la preparación para observar la sección transversal del lumen. A continuación, inserte una aguja de calibre 27 en el lumen y muévala para cortar el saco endolinfático en dos hojas. Sostenga el borde de cada pañuelo en forma de lámina con pinzas y sepárelos entre sí.
En el análisis representativo, se visualizó una sección sagital media del cráneo de estos ratones antes y después de la extracción de la mitad del cerebro con fluorescencia tdTomato. El saco endolinfático era fácilmente visible incluso sin disección. Se aislaron los oídos internos de los ratones en el día embrionario 16,6, así como en los días 5 y 30 postnatales.
Los sacos endolinfáticos se observaron con mayor aumento. Para los ratones P30, el conducto endolinfático es difícil de aislar debido a su encapsulación en el hueso. Se estudió la inmunohistoquímica de los sacos endolinfáticos intactos de E16.5 y P5 con marcadores de anticuerpos anti-SLC26A4 y faloidina.
La faloidina se utilizó para resaltar el saco endolinfático y el tejido conjuntivo que lo rodea. Las imágenes de gran aumento del epitelio del saco endolinfático abierto en P5 muestran que el SLC26A4 marcado en verde se localiza en la región apical de un subconjunto de células. Lo más importante que hay que recordar al intentar este procedimiento es ser muy cuidadoso para evitar dañar el saco endolinfático.
Un tejido de saco endolinfático fijo aislado por este enfoque se puede utilizar para la hibridación in situ, el endoscopio de ARN y la inmunohistoquímica. El tejido vivo se puede utilizar para preparar ARN para el análisis del transcriptoma y para la fisiología. Este enfoque se ha utilizado para estudiar el transcriptoma del saco endolinfático, ya sea en su conjunto o en análisis de RNA-seq de una sola célula para contribuir a la caracterización de sus diferentes tipos de células.
