Agradecemos Laurent Limozin, Pierre Dillard e Astrid Wahl para continuar discussões frutíferas sobre aplicações celulares. Agradecemos também Frederic Bedu de instalação de sala limpa PLANETE por sua ajuda com as observações SEM. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Conselho Europeu de Investigação através da concessão No. 307.104 FP / 2007-2013 / ERC.

1. A limpeza dos vidros Capa-slides e câmaras de observação <ol><li> Organizar as coberturas de lâminas de vidro sobre um tabuleiro multi-deslizante feito de um material inerte tal como o politetrafluoroetileno (PTFE). </li><li> Mergulha-se o tabuleiro com lâminas e a câmara de observação numa solução de agente tensioactivo (qualquer produto recomendado para a limpeza de cuvetes de quartzo é apropriado). </li><li> Utilizando um banho de ultra-sons, ultra-sonicado na solução de surfactante durante 30 min à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C). </li><li> Lavar 5 vezes com água ultrapura (18,2 MΩ.cm, 0,059 S / cm). </li><li> Ultra-sonicado em solução surfactante durante 30 min à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C). </li><li> Lavagem de 10 vezes com água ultrapura. </li><li> Repita os passos 1.5 e 1.6, duas vezes. </li><li> Armazenar em água à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C) durante até uma semana. </li></ol> 2. Fabricação de proteína Nano-pontos <ol><li> Deposição de contas <ol><li> deposit a suspensão de contas de sílica (2% v / v, 70 mL) gota a gota em um-corrediça de cobertura (24 x 24 mm, espessura de 170 um), realizada com uma inclinação de 15 graus. </li><li> Deixe a suspensão espalhada durante cerca de 1 min, enquanto que lança o vidro de 90 ° a cada 15 s. </li><li> Permitir que o líquido se evaporar sob condições ambiente. </li><li> Armazenar em um vidro limpo ou câmara de PTFE em condições ambientais durante até 2 dias. </li></ol></li><li> Deposição de alumínio <ol><li> Colocar as lâminas (preparada na secção 2.1) dentro de uma frequência de rádio de pulverização catódica equipamento (RF) magnetrão 8, sobre uma mesa rotativa a uma distância de cerca de 105 mm a partir de uma lata de alumínio (99%): silício (1%) alvo. </li><li> Bombeiam para baixo a câmara de deposição de 2,6 x 10 -4 Pa através de uma bomba turbomolecular. Esta etapa é importante para a remoção de possíveis impurezas gasosas. </li><li> Introduzir puro atmosfera de Árgon (5N, 99,999%) com um fluxo de 10 sccm a uma pressão de 0,8 Pa (6,6 mTorr). <br/&gt; NOTA: O fluxo de árgon de entrada é controlado por um controlador de fluxo de massa e a pressão do processo é monitorizado utilizando um medidor de pressão. O fluxo de gás árgon é contínua e é controlado por um equilíbrio entre a entrada e válvulas de abertura de saída. </li><li> Ligue o gerador de energia RF. NOTA: Aqui, foi utilizada uma gama típica de 400-600 W de energia de radiofrequência a 13,56 MHz de frequência. O gerador de RF é utilizada com uma Rede de adaptao de um modo de acoplamento do plasma capacitiva. A energia reflectida é monitorado e minimizado utilizando a adaptação da rede. </li><li> Após o plasma é estabilizado, de descarga eléctrica durante dois minutos, mantendo o obturador fechado para remover possíveis impurezas da superfície do alvo. </li><li> Abrir o obturador e permitir a pulverização continue durante 60 min a depositar alumínio sobre a lâmina de vidro até uma espessura de 200 nm. </li><li> Cortar o fluxo de árgon, fechar a válvula de gaveta para isolar a bomba turbomolecular a partir da câmara de deposição e ventilar a câmara com n limpoitrogen para obter a pressão ambiente. Recuperar as lâminas revestidas com alumínio. Armazenar por até um mês em uma caixa de vidro ou PTFE limpo e hermeticamente fechado em condições ambientais. </li></ol></li><li> de deposição de vapor de organossilano <ol><li> Imergir a lâmina revestida de alumínio preparado no passo 2.2.6 em água ultrapura, à temperatura ambiente e ultra-sonicação durante 30 s num banho de ultra-sons (50 W, 50/60 Hz, entre 20 e 30 ° C). </li><li> Depósito de 0,5 mL de (3-aminopropil) -triethoxysilane (APTES) na parte inferior de um exsicador. CUIDADO: APTES é um organossilano, que evapora facilmente e é tóxico. APTES deve ser manuseado apenas sob um fluxo-capuz e com luvas. </li><li> Coloque as lâminas de vidro (preparadas em 2.3.1) em uma grade de cerâmica e coloque dentro do secador. </li><li> Ligue o exsicador para uma bomba de membrana e na potência máxima durante 30 min para gerar um vácuo baixo. </li><li> Fechar a válvula do exsicador e desligar a bomba. </li><li> Aquecer o secadora cerca de 50 ° C durante 1 h. </li><li> Abra o exsicador e recolher os slides. </li><li> Transferir para outro exsicador limpo para armazenamento de até 48 horas à temperatura ambiente (20 a 30 ° C). </li></ol></li><li> Deposição de primeira camada de proteína - albumina de soro bovino marcada com biotina (BSA-biotina) <ol><li> Coloque uma das lâminas preparadas na seção 2.3 sobre um suporte de PTFE. </li><li> Depósito 1 mL de 25 ug / mL de BSA-biotina dissolvida em tampão fosfato salino (PBS). Deixar durante 30 minutos à temperatura ambiente (20 a 30 ° C). </li><li> Enxaguar 10 vezes com PBS. Armazenar a amostra durante até 24 h a 4 ° C para longe da fonte de luz. </li></ol></li><li> Remoção de máscara de alumínio <ol><li> Incubar as lâminas numa solução de NaOH em PBS (preparado por adição gota a gota de NaOH 1 M a cerca de 100 mL de PBS para se obter pH≈12) durante a noite à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C). CUIDADO. NaOH é corrosivo e deve ser manuseado com luvas. </li><li> Rinse10 vezes em água ultrapura. </li></ol></li></ol> 3. A deposição de Compatível Lipid Bilayer (SLB) <ol><li> Limpeza da calha Langmuir <ol><li> Remover a água no compartimento de PTFE da calha de Langmuir utilizando uma bomba. </li><li> Limpo com uma toalha descartável não tecido que não solte fiapos embebido em clorofórmio. CUIDADO. O clorofórmio é tóxico e deve ser manipulada numa área bem ventilada, com uma máscara (ou sob um fluxo-capa) e com luvas apropriadas. </li><li> Limpos 4 vezes com água ultrapura morna (40-50 ° C). </li><li> Limpas pelo menos 6 vezes com água ultrapura frio. </li></ol></li><li> A deposição da primeira camada de lípido <ol><li> Coloque bandejas de PTFE no recinto de PTFE da calha de Langmuir e depois enchê-lo com água ultrapura. </li><li> Usar o software de controlo do aparelho de Langmuir para definir a pressão medida a 0 mN / m. </li><li> Usar uma seringa estanque a gases de vidro / metal a depositar 30 uL de uma solução de lípidos de 1 mg / mL (1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) em clorofórmio) sobre a superfície da água. O clorofórmio e evapora-se as moléculas de lípidos formam espontaneamente uma monocamada. </li><li> Usar o software de controlo para comprimir a monocamada de lípidos, fechando a barreira de PTFE até que a pressão desejada (27 mN / m para DOPC) é alcançado. </li><li> Usar o software de controlo para mergulhar a lâmina de vidro preparado na secção 2.5.2 para dentro do invólucro de PTFE utilizando uma braçadeira motorizado. </li><li> Segurar a corrediça, na braçadeira, perpendicular à interface ar-água. Usar o software de controlo para elevá-lo lentamente (15 mm / min) através da interface, enquanto se mantém uma pressão constante a 27 mN / m. </li><li> Lugar num ambiente seco, quer para uso imediato ou para armazenamento até 24 horas à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C). </li></ol></li><li> A deposição da segunda camada lipídica <ol><li> Manter a pressão de superfície na tina de Langmuir no valor desejado de 27 mN / m. Comprimir usando osoftware do aparelho de Langmuir e / ou controlo de adicionar uma pequena quantidade de lípido para alcançar a pressão desejada. </li><li> Colocar as lâminas de vidro que transportam a monocamada de lípidos, preparada na secção 3.2.6, na horizontal sobre a superfície da água. Assegure-se que cada lâmina está a flutuar por cima de um tabuleiro de PTFE. </li><li> Empurrar as lâminas de vidro para baixo, uma lâmina de cada vez, para a sua bandeja de PTFE correspondente utilizando PTFE ou metal pinça de tal modo que eles são imersos na água. Evite inclinar os slides enquanto empurra. </li><li> Use PTFE ou metal pinças para transferir as bandejas de PTFE contendo os deslizamentos em um cristalizador preenchido com água ultrapura certificando-se de que as lâminas não são expostas ao ar. </li><li> Use PTFE ou metal pinças para transferir, durante o trabalho debaixo de água, uma bicamada revestido lâmina de vidro para uma câmara de observação. NOTA: A câmara de observação é colocado debaixo de água no interior do cristalizador. A câmara de observação é feito sob medida e consiste de um anel de PTFE com um uma junta de borrachainvólucros de aço d, que podem ser montados debaixo de água para fazer uma câmara estanque à água, cuja superfície inferior é feita a partir da lâmina de vidro revestida previamente com a bicamada lipídica. </li><li> Fechar a câmara, continuando a trabalhar com água e assegurando que cerca de 1 mL de água é preso no interior da câmara. </li><li> Levar a câmara montada fora da água. Certifique-se de que ele é livre à prova de água e vazamento. </li><li> Substituir o 1 ml de água ultrapura presente na câmara de observação com PBS por adição e remoção de 500 ul de PBS 10 vezes. Assegurar que a câmara nunca é desprovida de líquido. </li></ol></li><li> etapa de bloqueio SLB <ol><li> Introduzir 100 ug / mL de albumina de soro bovino (BSA) na câmara de observação contendo a corrediça preparada na secção 3.3.6 e incubar durante 30 min à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C). </li><li> Lavar a camada dupla por eliminação e adição de 500 ul de PBS 10 vezes. A bicamada pode ser mantido 24 horas a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 4. A funcionalização com ligantes <ol><li> Adicionar fluorescente ou não fluorescente neutravidina (NAV, uma versão desglicosilada de avidina não carregado a pH 7) a 2 ug / mL para a câmara contendo a corrediça preparada na secção 3.4.2, durante 30 min à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C). </li><li> Lavar por adição e remoção de 500 ul de PBS 10 vezes. </li><li> Adicionar biotinilado anti-CD3 a 2 ug / mL para a câmara que contém a corrediça preparada na secção 3.4.2. Para dupla funcionalização do SLB e os pontos, adicionar Fc-ICAM1 His-tag, a 5 ug / ml (aqui, a bicamada é feita de DOPC + 1% de ácido nitrilotriacético (NTA) lípidos). Deixar durante 30 minutos à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C). </li><li> Lavar por adição e remoção de 500 ul de PBS 10 vezes </li><li> Substituir o PBS com meio celular (PBS + BSA a 0,1%) por adição e remoção de 500 mL do meio de células 10 vezes. </li><li> Deixar 200 uL de meio de células no chamber com a corrediça. </li><li> Coloque a câmara durante 10 minutos a 37 ° C antes da adição de células. </li></ol> 5. Célula de deposição (ver referência 7 para detalhes) <ol><li> depositar cuidadosamente 400 ul da suspensão de células para dentro da câmara. Incubar as culas durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Fixar a célula com 2% de paraformaldeído (PFA) durante 15 min a 37 ° C. Substituir o PFA com PBS por remoção repetida e a adição de 500 uL de PBS. </li></ol> 6. Observação <ol><li> Proteo-lipídico Nano-padrão e SLB fluidez <ol><li> Usar um microscópio de fluorescência para a imagem do padrão de proteínas no modo de epi-fluorescência usando comprimento de onda apropriado iluminação (639 nm) e cubos de filtro (por exemplo, aqui, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688). NOTA: A intensidade do sinal pode ser quantificada para estimar a quantidade de proteína dentro e fora do ponto. Usar um comprimento de onda apropriado iluminação (330 nm) e fcubo ILTER a imagem da bicamada (BP 365/12, FT 395, LP 397), que aparece brilhante com buracos escuros. </li><li> Use foto contínuo de branqueamento (CEC) técnica 13, 15 para medir a constante de difusão de lípidos de traçador na bicamada. Esta observação é, de preferência feito apenas após a deposição SLB. NOTA: De modo a quantificar a constante de difusão, dois parâmetros são medidos durante o processo de CEC: o tempo de branqueamento específica do corante (tenso) e o comprimento de decaimento do perfil fluorescente do halo formado em torno da área branqueada (taud). O primeiro é obtido através da representação gráfica da evolução no tempo da intensidade de fluorescência no centro do campo iluminado durante o processo de CPB. A segunda é obtido por traçado do perfil de intensidade na borda da zona iluminada (média de mais de 12 linhas e 5 depois as imagens em estado estacionário é atingido). As curvas são montados para obter tenso e taud. A constante de difusão é dada por tauD 2 / tenso (D = <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55060/55060eq1.jpg" /> ). </li></ol></li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Os passos críticos dentro do protocolo descrito acima estão relacionadas com a formação da proteína nano-pontos ou a parte de trás de enchimento do espaço em torno dos pontos por uma bicamada lipídica suportado. O primeiro passo crítico com respeito a proteína nano-pontos é a preparação do grânulo-máscara. A limpeza da tampa a corrediça é crítica. As lâminas têm de ser limpas, quer com uma solução de detergente que é recomendado para a limpeza de cuvetes de quartzo, ou com plasma de oxigénio. Out...

<html> A adesão celular tem lugar através de moléculas de adesão de células especializadas (CAMs), proteínas presentes na membrana de células que são capazes de se ligar a sua contraparte na matriz extra celular ou noutra célula. Em culas aderentes, a maioria das moléculas de adesão incluindo a integrina ubíqua e caderina, encontram-se na forma de agregados 1. A interacção dos linfócitos T (células T) com as células apresentadoras de antígenos (APCs) fornece uma ilustração particularmente notável da importância dos aglomerados de receptores formados na interface entre as duas células - muitas vezes chamada uma sinapse imunológica. Após a formação do primeiro contacto com os receptores de células APC, T (TCRs) sobre a superfície dos agregados de escala forma célula micron T que servem de sinalização plataformas 2, 3, 4, e, eventualmente, são centralizados para formar um agrupamento supramolecular central maior (cSMAC )lass = &quot;xref&quot;&gt; 5, 6, 7. Recentemente, foi mostrado que no lado do APC, os ligandos de TCR também estão agrupados 8. No contexto de células T-APC interacção, a implementação de sistemas híbridos, onde o APC é mimetizado por uma superfície artificial funcionalizadas com proteínas relevantes, avançou significativamente a nossa compreensão da interface sináptica 2, 3, 4, 5, 6, 7 . Neste contexto, é altamente relevante para desenhar superfícies miméticos APC que capturam um ou mais aspectos da célula alvo. Por exemplo, se os ligandos são enxertados em bicamadas lipídicas com suporte, que pode difundir-se no plano da bicamada, mimetizar a situação na superfície da APC e ao mesmo tempo permitir que a formação dacSMAC 6, 7. Da mesma forma, os aglomerados sobre o APC foram imitada através da criação de ilhas de ligandos num mar de polímeros 9, 10, 11, 12, 13, 14. No entanto, estas duas características têm até agora não foram combinados. Aqui, descrevemos uma nova técnica para criar nano-pontos de anti-CD3 (um anticorpo que tem como alvo o complexo TCR) rodeado por uma bicamada lipídica com os lípidos que se difundem. A bicamada é depositada utilizando Langmuir-Blodgett / técnica de Langmuir-Schaefer 7, 15, 16 e, se desejado, pode ser funcionalizado com uma proteína específica - por exemplo, o ligando da integrina da célula T (chamado ICAM1). Além disso, os anti-CD3 pontos proteína could ser substituído com um outro anticorpo ou CAM. Enquanto nós escolhemos as proteínas para uso futuro como plataforma para estudos de adesão de células T, a estratégia detalhado aqui pode ser adaptado para qualquer proteína e mesmo DNA.

<table><tbody><tr><td>Glass coverslips</td><td>Assistent, Karl Hecht KG&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Observation chamber</td><td>Home made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex)</td><td>Hella Analytics</td><td>9-307-011-4-507</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-sonicator</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Labbox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystallizer&amp;nbsp;</td><td>Shott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutravidine</td><td>Thermo Fischer Scientifique</td><td>84607</td><td></td></tr><tr><td>PBS&amp;nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Water MQ&amp;nbsp;</td><td>ELGA, Veolia France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silica beads</td><td>Corpuscular Inc</td><td>147114-10</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Biotin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Dansyl-PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810330C</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-aldrich</td><td>650471</td><td></td></tr><tr><td>Gastight syringe&amp;nbsp;</td><td>Dominique Dustcher , France</td><td>74453</td><td></td></tr><tr><td>Film balance</td><td>NIMA</td><td>Medium</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss, Germany</td><td>TIRF-III system</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium Target&amp;nbsp;</td><td>Kurt J. Lesker Compagny, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Radio Frequency Magnetron sputtering Syst&amp;egrave;me&amp;nbsp;</td><td>modified SMC 600 tool by ALCATEL , France</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ligand nano-cluster arrays in a supported lipid bilayer

Actualmente há um grande interesse em criar matrizes ordenadas de ilhas de proteínas adesivas num mar do superficial passivada para estudos de biologia celular. Nos últimos anos, tornou-se cada vez mais claro que as células vivas responder, não só para a natureza bioquímica das moléculas que lhes são apresentados, mas também à maneira como essas moléculas são apresentados. Criando proteína micro-padrões é, portanto, agora um padrão em muitos laboratórios de biologia; nano-padrões também são mais acessíveis. No entanto, no contexto de interacções célula-célula, existe uma necessidade de padrão não só proteínas, mas também bicamadas lipídicas. Tal padronização dupla proteo-lipídica até agora não tem sido facilmente acessível. Oferecemos uma técnica fácil para criar proteínas nano-pontos suportados em vidro e propor um método para aterrar o espaço inter-ponto com uma bicamada lipídica suportado (SLB). A partir de foto-branqueamento de traçador lipídios fluorescentes incluídos no SLB, demonstramos que a bicamada exibe considerável-plfluidez ane. Funcionalização os pontos de proteínas com grupos fluorescentes nos permite imagem los e mostrar que eles são ordenados em uma rede hexagonal regular. O tamanho típico ponto é de cerca de 800 nm e o espaçamento aqui demonstrada é de 2 micra. Estes substratos são esperados para servir como plataformas úteis para a adesão celular, a migração e estudos mecano-sensores.

As imagens de fluorescência foram analisados ​​para medir o espaçamento e o tamanho dos pontos. Espaçamento típico verificou-se ser 1,900 ± 80 nm e dot-tamanho típico foi de 600 ± 100 nm (Figura 1 g). O espaçamento é definido pelo tamanho das contas utilizadas para a máscara. O ponto de tamanho é definido pelo, bem como condições de deposição do grânulo de tamanho. O SLB é depositada unicamente em torno dos pontos de proteína e não sobre elas <stro...

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Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Apresenta-se um protocolo para funcionalizar vidro com manchas proteicas nanométricas rodeado por uma bicamada lipídica fluida. Estes substratos são compatíveis com microscopia óptica avançado e espera-se para servir como plataforma para estudos de adesão celular e de migração.

Matrizes ligando Nano-fragmentação em uma bicamada lipídica Compatível

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

ligand-nano-cluster-arrays-in-a-supported-lipid-bilayer

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.9K visualizações.  CNRS, UMR 7325, CINaM.  Apresenta-se um protocolo para funcionalizar vidro com manchas proteicas nanométricas rodeado por uma bicamada lipídica fluida. Estes substratos são compatíveis com microscopia óptica avançado e espera-se para servir como plataforma para estudos de adesão celular e de migração. 

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Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Método para visualizar e analisar proteínas de interação de membrana por microscopia eletrônica de transmissão

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Bioquímica

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions between lymphocytes and antigen presenting cells, we use Ni2+-chelating lipids to anchor recombinant cell adhesion and MHC proteins to the upper leaflet of a bilayer with poly-histidine tags. Planar bilayers are generated by preparing lipid, treating the glass surfaces where the bilayer will form, and then forming the bilayer in a specialized chamber containing a flow-cell where the lymphocytes will be added.  Then, bilayers are charged with Ni and his-tagged recombinant proteins are added.  Finally,  lymphocytes are injected into the flow cell and TIRF microscopy can be used to image synapse formation and the mechanisms that control T cell locomotion, sites of receptor sorting,  and sites of receptor degradation.

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse. Here, we show methods for anchoring cell adhesion proteins known to modulate synapse formation to the upper leaflet of the lipid bilyer and visualize synapse formation using TIRF microscopy.

Suportados Bicamadas Planar para a Formação do Estudo da Sinapses imunológicas e Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions ...

Biologia

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Formação de biomembrana Microarrays com um método de montagem baseada em Rodo

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Bioengenharia

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparação de Mica Apoiado Lipid Bicamadas para alta resolução Microscopia Óptica de Imagem

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown into highly ordered two-dimensional (2D) crystals under favorable conditions. The quality of the grown 2D crystals is crucial to the resolution of the final reconstruction via 2D image processing. Over the years, lipid monolayers have been used as a supporting layer to foster the 2D crystallization of peripheral membrane proteins as well as soluble proteins. This method can also be applied to 2D crystallization of integral membrane proteins but requires more extensive empirical investigation to determine detergent and dialysis conditions to promote partitioning to the monolayer. A lipid monolayer forms at the air-water interface such that the polar lipid head groups remain hydrated in the aqueous phase and the non-polar, acyl chains, tails partition into the air, breaking the surface tension and flattening the water surface. The charged nature or distinctive chemical moieties of the head groups provide affinity for proteins in solution, promoting binding for 2D array formation. A newly formed monolayer with the 2D array can be readily transfer into an electron microscope (EM) on a carbon-coated copper grid used to lift and support the crystalline array. In this work, we describe a lipid monolayer methodology for cryogenic electron microscopic (cryo-EM) imaging.

Lipid monolayers have been used as a foundation for forming two-dimensional (2D) protein crystals for structural studies for decades. They are stable at the air-water interface and can serve as a thin supporting material for electron imaging. Here we present the proven steps on preparing lipid monolayers for biological studies.

Preparação da amostra usando um método de monocamadas lipídica para estudos cristalográficos eletrônicos

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

Difusão e Montagem de Molécula Única em Membranas Lipídicas Repletas de Polímeros

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It is not only passively generated by cellular activities, but also actively regulates protein interactions and is involved in many intracellular signaling. Thus, it is of great value to examine the role of membrane curvature in regulating the distribution and dynamics of proteins and lipids. Recently, many techniques have been developed to study the relationship between the curved membrane and protein in vitro. Compared to traditional techniques, the newly developed nanobar-supported lipid bilayer (SLB) offers both high-throughput and better accuracy in membrane curvature generation by forming a continuous lipid bilayer on patterned arrays of nanobars with a pre-defined membrane curvature and local flat control. Both the lipid fluidity and protein sensitivity to curved membranes can be quantitatively characterized using fluorescence microscopy imaging. Here, a detailed procedure on how to form a SLB on fabricated glass surfaces containing nanobar arrays&#160;and the characterization of curvature-sensitive proteins on such SLB are introduced. In addition, protocols for nanochip reusing and image processing are covered. Beyond the nanobar-SLB, this protocol is readily applicable to all types of nanostructured glass chips for curvature sensing studies.

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Here, a nanobar-supported lipid bilayer system is developed to provide a synthetic membrane with a defined curvature that enables the characterization of proteins with curvature sensing ability in vitro.

Um Sistema de Bicamada Lipídica Suportado por Nanobar para o Estudo de Proteínas de Detecção de Curvatura de Membrana in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

Montagem de Modelos de Bicamadas lipídicas apoiadas e suspensas para o estudo de interações moleculares

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...