Name: ligand nano-cluster arrays in a supported lipid bilayer
Uploaded: 2017-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
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우리는 휴대 전화 응용 프로그램에 대한 유익한 토론을 계속하기위한 로랑 Limozin, 피에르 딜라드와 아스트리드 월합니다. 우리는 또한 SEM 관찰 그의 도움을 PLANETE 클린 룸 시설에서 프레데릭 베두합니다. 이 작품은 부분적으로 허가 번호 307104 FP / 2007년부터 2013년까지 / ERC를 통해 유럽 연구위원회에 의해 투자되었다.

1. 청소 유리 커버 - 슬라이드와 관측 챔버 <ol><li> 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)와 같은 불활성 물질로 이루어진 멀티 슬라이드 트레이 유리 커버 슬라이드 배열. </li><li> 계면 활성제 용액 슬라이드 트레이 및 관찰 챔버 (적합한 석영 큐벳을 세정 추천 어떤 제품)을 담근다. </li><li> (20, 30 ° C 사이)을 실온에서 30 분 동안 활성제 용액을 초음파 욕 울트라 초음파 처리를 사용. </li><li> 초순수로 5 회 (18.2 MΩ.cm, 0.059 μS / cm)을 헹군다. </li><li> (20, 30 ° C 사이의)을 실온에서 30 분 동안 활성제 용액 울트라 초음파 처리. </li><li> 초순수로 10 회를 씻어. </li><li> 반복 두 번 1.5 및 1.6 단계를 반복합니다. </li><li> 최대 1 주일 동안 실온 (20 ° ~ 30 C) 물에 보관할 것. </li></ol> 단백질 나노 점의 2 제작 <ol><li> 구슬의 증착 <ol><li> Deposit 15 °의 경사각으로 유지 (170 μm의 두께를 24 X 24mm) 실리카 비드 (2 % V / V를 70 μL) 은폐 슬라이드 적가의 현탁액. </li><li> 90 °마다 15 초에 의해 유리를 틀지 동안 정지가 약 1 분간 확산 보자. </li><li> 액체가 주위 조건하에 증발 할 수있다. </li><li> 최대 2 일 동안 주위 조건에서 깨끗한 유리 또는 PTFE 실에 보관하십시오. </li></ol></li><li> 알루미늄 증착 <ol><li> 알루미늄 (99 %)에서 약 105 mm의 거리에서 회전 테이블 (RF) 마그네트론 스퍼터링 장치 (8), 무선 주파수 내부 슬라이드 (섹션 2.1에서 제조)를 넣 실리콘 (1 %) 타겟. </li><li> 터보 분자 펌프를 이용하여 2.6 × 10 -4 파에 상기 증착 챔버를 펌프 다운. 이 단계는 가능한 기체 불순물의 제거를 위해 중요하다. </li><li> 0.8 파 (6.6 mTorr 이하)의 압력에서 10 sccm의 유량으로 순수 아르곤 분위기 (5N, 99.999 %)를 소개한다. <br/&gt; 주 : 수신 아르곤 유속은 질량 유량 제어기에 의해 제어되며, 프로세스 압력은 압력 게이지를 사용하여 모니터된다. 아르곤 가스의 유량은 연속적이며, 입구 및 출구 밸브의 개방 사이의 균형에 의해 제어된다. </li><li> RF 전력 생성기에 스위치. 주 : 여기에서, 13.56 MHz의 주파수에서 400 내지 600 W의 고주파 전력의 전형적인 범위를 사용 하였다. 상기 RF 발생기는 용량 성 결합 플라즈마 모드의 매칭 네트워크와 함께 사용된다. 반사 전력을 모니터링하고 네트워크를 이용하여 적응 최소화된다. </li><li> 상기 플라즈마가 안정화 된 후에, 2 분의 타겟 표면에서 가능한 불순물을 제거하기 위해 셔터가 닫힌 상태를 유지하기위한 스퍼터. </li><li> 셔터를 열어 60 분, 200 nm의 두께로 유리 슬라이드에 알루미늄을 증착하기 위해 스퍼터링을 계속 할 수있다. </li><li> 아르곤의 유동을 차단 증착 챔버로부터 터보 분자 펌프를 격리하는 게이트 밸브를 폐쇄하고 깨끗한 N과 벤트 챔버itrogen 방 압력을 얻었다. 알루미늄 코팅 된 슬라이드를 복구. 한 달까지 주변 조건에서 깨끗하고 밀폐 된 유리 또는 PTFE 상자에 대한 보관하십시오. </li></ol></li><li> 유기 실란의 증기 증착 <ol><li> (20, 30 ° C 사이에 50 W, 50 ㎐,) 초음파 조에서 30 초 동안 실온 울트라 초음파 처리에 초순수의 단계 2.2.6에서 제조 한 알루미늄 - 코팅 슬라이드 담근다. </li><li> 건조기의 하단 (3- 아미노 프로필) -triethoxysilane (APTES) 0.5 mL를 입금. 주의 : APTES 쉽게 증발 독성 유기 실란이다. APTES에만 흐름 후드와 장갑으로 취급해야한다. </li><li> 데시 케이 터 내부의 세라믹 그리드와 장소에 (2.3.1 준비) 유리 슬라이드를 넣습니다. </li><li> 멤브레인 펌프에 연결하고, 데시 케이 터를 30 분은 저 진공을 발생하기위한 최대 전력에서 실행. </li><li> 데시 케이 터의 밸브를 닫고 펌프를 끕니다. </li><li> 데시 케이 터를 가열1 시간 동안 50 ° C이다. </li><li> 데시 케이 터를 열고 슬라이드를 수집합니다. </li><li> 실온에서 최대 48 시간 (20 ~ 30 ° C)에 대한 저장을 위해 다른 청정 건조기로 옮긴다. </li></ol></li><li> 단백질의 제 1 층의 증착 - 비오틴으로 표지 소 혈청 알부민 (BSA 비오틴) <ol><li> PTFE를 지원에 2.3에서 제조 된 슬라이드 중 하나를 놓습니다. </li><li> 인산 완충 식염수 (PBS)에 용해 된 25 ㎍ / ㎖의 BSA 비오틴 기탁 한 용액. 실온 (20 내지 30 °의 C)에서 30 분 동안 남겨. </li><li> PBS로 10 회를 씻어. 멀리 광원에서 4 ° C에서 최대 24 시간 동안 샘플을 저장합니다. </li></ol></li><li> 알루미늄 마스크를 제거하여 <ol><li> 상온 (20 ° C 내지 30)의 위에 박 (pH≈12을 수득 약 100 ㎖의 PBS에 1 M NaOH를 적가하여 제조) PBS 중의 NaOH의 용액에 슬라이드를 인큐베이션. 주의. NaOH를 부식 및 장갑을 사용하여 처리해야한다. </li><li> 헹구기초순수의 10 배. </li></ol></li></ol> 지원되는 지질 이중층 3. 증착 (SLB) <ol><li> 랭 뮤어 통을 청소 <ol><li> 펌프를 사용하여 랭 뮤어 통의 PTFE 인클로저에서 물을 제거합니다. </li><li> 클로로포름에 적신 보풀이없는 부직포 일회용 수건으로 닦으십시오. 주의. 클로로포름 독성 및 (또는 유동 후드) 마스크를 적절한 장갑, 통풍이 잘되는 곳에서 조작되어야한다. </li><li> 미지근한 초순수 (40 ~ 50 °의 C)와 4 번 면도. </li><li> 차가운 초순수 청소 적어도 6 회. </li></ol></li><li> 제 지방층 증착 <ol><li> 랭 뮤어 통의 PTFE 인클로저 PTFE 트레이를 배치 한 후, 초순수로 채운다. </li><li> 0 mN의 / m로 측정 된 압력을 설정 랭 뮤어 장치의 제어 소프트웨어를 사용한다. </li><li> (1 ㎎ / ㎖ 지질 용액 30 μL를 증착하는 제 1 기밀 유리 / 금속 주사기를 사용하여물 표면에 2 dioleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 클로로포름 (DOPC)). 클로로포름을 증발 지질 분자가 자발적으로 단층을 형성한다. </li><li> 도달 (DOPC 27 mN의 / m)을 원하는 압력까지 PTFE 배리어를 폐쇄함으로써 지질 단층을 압축하는 제어 소프트웨어를 사용한다. </li><li> 전동 클램프를 사용하여 PTFE 인클로저에 섹션 2.5.2에서 제조 된 유리 슬라이드를 찍어 제어 소프트웨어를 사용한다. </li><li> 수직 한 공기 - 물 계면에, 상기 클램프에 슬라이드를 잡아. / m에서 27 mN의 일정 압력을 유지하면서, 인터페이스를 통해 천천히 (15mm / 분)을 올리는 제어 소프트웨어를 사용한다. </li><li> 실온에서 최대 24 시간 (20 ° 내지 30 C) 중 하나를 즉시 사용 또는 저장을 위해 건조한 장소. </li></ol></li><li> 제 지방층 증착 <ol><li> / m 27 Mn의 목표 값에 랭 뮤어 통의 표면 압력을 유지한다. 를 사용하여 압축랭 뮤어 장치 및 / 또는 제어 소프트웨어가 원하는 압력을 달성하기 위해, 지질 소량의 추가. </li><li> 가로 물의 표면 섹션 3.2.6에서 제조 지질 단층을 운반하는 유리 슬라이드를 놓는다. 각 슬라이드는 PTFE 트레이 위에 떠있는 것을 확인. </li><li> 아래 유리 슬라이드를 넣거나, 이들은 물에 침지되도록 PTFE 또는 금속 핀셋을 사용하여 해당 PTFE 트레이에 한 번에 하나 개의 슬라이드. 누른 상태에서 슬라이드를 기울 마십시오. </li><li> 초순수는 슬라이드가 공기에 노출되지 않도록 만드는 가득 정석으로 슬라이드를 포함하는 PTFE 트레이를 전송하는 PTFE 또는 금속 핀셋을 사용합니다. </li><li> 관찰 챔버 내로, 이중층 코팅 된 유리 슬라이드를 수중 작업하는 동안, 전송 PTFE 또는 금속 핀셋을 사용한다. 주 : 관찰 챔버는 결정 화기 내부에 물 아래에 배치됩니다. 관찰 챔버는 맞춤 제작 및 고무 가스켓기로와 PTFE 고리로 구성되는그 저면 이전 지질 이중층 코팅 유리 슬라이드로 만들어진다 수밀 챔버를 만들기 위해 수중 조립 될 수 D 스틸 케이스. </li><li> 물 속에 계속 작업 물 1 ㎖를 상기 챔버 내부에 포획되는 것을 보장하면서도 상기 챔버를 닫는다. </li><li> 물에서 조립 된 챔버를 가져 가라. 그것은 방수 및 누수가 없는지 확인합니다. </li><li> 추가 및 PBS 10 배의 500 μL를 제거하여 PBS로 관찰 챔버 내의 초순수 존재하는 1 mL로 대체. 챔버는 액체의 결코 찾아 볼 수없는 있는지 확인하십시오. </li></ol></li><li> SLB 차단 단계 <ol><li> 섹션 3.3.6에서 제조 한 슬라이드를 포함하는 관찰 챔버 내에 소 혈청 알부민 100 ㎍ / ㎖ (BSA)를 도입하고, 실온에서 30 분 (20 ° 내지 30 C) 배양한다. </li><li> 제거하고 PBS 10 배의 500 μL를 첨가하여 이중층 린스. 이중층은 4 ℃에서 24 시간 동안 유지 될 수있다. </li></ol></li></ol> 리간드 4. 기능화 <ol><li> 20 및 30 ℃ 사이의 실온에서 30 분 동안 섹션 3.4.2에서 제조 된 슬라이드 (함유하는 챔버로 2 ㎍ / ㎖의에 형광 비 형광 비딘을 (NAV 아비딘의 탈글 라이코 실화 된 버전의 pH를 7로 충전되지 않은) 추가 기음). </li><li> 첨가하고 10 배 PBS 500 μL를 제거하여 씻어. </li><li> 섹션 3.4.2에서 제조 한 슬라이드를 포함하는 챔버에 2 ㎍ / ㎖의 비오틴 화 항에 CD3 추가. SLB와 도트의 이중 작용 들어, (여기서, 이중층는 니트릴 로트리 아세트산 (NTA) 지질의 + 1 % DOPC 이루어진다) 5 ㎍ / mL로하는 FC-ICAM1 그의 태그를 추가한다. 실온에서 30 분 (20 ° 내지 30 C) 떠난다. </li><li> 10 회를 추가하고 PBS의 500 μL를 제거하여 헹구어 </li><li> 10 배 첨가하여 세포 배지 500 μL를 제거하여 세포 매체와 PBS (PBS + 0.1 % BSA)을 대체. </li><li> chambe에서 세포 매체의 200 μL를 남겨슬라이드와 r에. </li><li> 세포를 첨가하기 전에 37 ℃에서 10 분 동안 실을 놓는다. </li></ol> 5. 셀 증착 (자세한 내용은 문헌 7 참조) <ol><li> 조심스럽게 챔버에 세포 현탁액 400 μL 증착. 37 ° C에서 30 분 동안 세포를 인큐베이션. </li><li> 37 ° C에서 15 분 동안 2 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 세포를 고정. 반복 제거하고 PBS 500 μL를 첨가하여 PBS와 함께 PFA를 교체합니다. </li></ol> 6. 관측 <ol><li> Proteo-지질 나노 패턴 및 SLB 유동성 <ol><li> BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 등 여기서, EX TBP 483 + 564 + 642 (적절한 조명 파장 (639 ㎚) 및 필터 큐브를 사용하여 이미지를 에피 형광 모드의 단백질 패턴을 형광 현미경을 사용하여 688). 주 : 신호의 강도는 내부 도트 외부 단백질의 양을 추정하기 위해 정량화 될 수있다. 적절한 조명 파장 (330 ㎚) 및 F를 사용하여이미지 ilter 큐브 어두운 구멍 밝다 이중층 (BP 12분의 365, FT (395), LP (397)). </li><li> 이중층의 트레이서 지질의 확산 상수를 측정하기 위해 연속 포토 블리치 (CPB)의 기술 (13), (15)를 사용한다. 이러한 결과는 바람직하게는 단지 SLB 증착 후에 이루어진다. 주 : 확산 상수를 정량화하기 위해, 두 개의 매개 변수가 CPB 공정 동안 측정된다 : 염료 (긴장) 및 표백 영역 (tauD) 주위에 형성된 할로 형광 프로파일의 붕괴 길이의 비 표백 시간. 첫번째는 CPB 공정 동안 조명 된 영역의 중심에서 형광 강도의 시간 변화를 플로팅함으로써 얻어진다. 두 번째는 (정상 상태에 도달 한 후 12 개 라인 5 개 이미지에 걸쳐 평균화)을 조사 영역의 에지의 강도 프로파일을 플로팅함으로써 얻어진다. 곡선은 팽팽하고 tauD을 얻었다 장착된다. 확산 상수 TA 주어진다UD 2 / 긴장된 (D = <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55060/55060eq1.jpg" /> ). </li></ol></li></ol>

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전술 한 프로토콜 내에서 중요한 단계는 지원 지질 이중층에 의해 단백질 나노 점 또는 점 주위 공간의 백 필러의 형성에 관련이있다. 단백질 나노 도트에 대한 제 1 임계 단계 비드 마스크의 제조 방법이다. 커버 슬라이드의 청소가 중요합니다. 슬라이드 중 하나, 또는 산소 플라즈마로 석영 큐벳을 청소 추천 된 세제를 청소해야합니다. 에탄올 또는 이소프로판올의 치료와 같은 다른 침지 세정 ?...

<html> 세포 유착은 세포 외 기질 또는 다른 셀에 그들의 상대에 결합 할 수있는 세포막에 존재하는 전문 세포 부착 분자 (CAM들) 단백질을 통해 일어난다. 접착 된 세포에 편재하는 인테그린과 카데 포함한 대부분의 접착 분자, 클러스터 (1)의 형태로 제공된다. 항원 제시 세포와 T 림프구 (T 세포)의 작용 (장갑차)이 두 셀 사이의 인터페이스에서 형성 수용체 클러스터의 중요성은 특히 현저한 설명을 제공한다 - 종종 면역 시냅스했다. cSMAC (큰 중앙 초분자 클러스터를 형성하도록 플랫폼 (2), (3, 4)에게 시그널링 역할을하고, 최종적으로 집중되는 T 세포 형태 마이크론 스케일 클러스터의 표면상의 APC, T 세포 수용체 (TCR도)와 제 접촉을 형성하면 )아가씨 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 5, 6, 7. 최근는 APC 측 것을 도시하고, TCR의 리간드는 또한 8 클러스터된다. 은 APC가 중요한 단백질 기능화 인공 표면에 의해 모방된다 T 세포 APC 상호 작용, 하이브리드 시스템의 배치의 상황에서, 시냅스 인터페이스 2, 3, 4, 5, 6, 7에 대한 이해를 전진 크게했다 . 이러한 맥락에서, 상기 타겟 셀의 하나 이상의 양상을 포착 APC 모방 표면을 설계하는 것이 매우 적합하다. 리간드가 지원되는 지질 이중층에 이식하는 경우 예를 들어, 그들은 이중층의 평면 확산은 APC 표면에 상황을 모방하고 동시에의 형성을 허용 할 수 있습니다cSMAC 6,7. 마찬가지로, APC의 클러스터는 중합체 9, 10, 11, 12, 13, 14의 바다 섬 리간드를 모방하여 생성되었다. 그러나 이러한 두 가지 기능은 지금까지 결합되지 않았다. 여기에서는 확산 지질과 지질 이중층으로 둘러싸인 항 CD3 (TCR의 복합체를 표적 항체)의 나노 도트를 생성하는 신규 한 기술을 설명한다. 이중층은 랭 뮤어 - 블로 젯 / 랭 뮤어 쉐퍼 기술 7, 15, 16을 이용하여 증착되고, 필요하다면, 특정 단백질로 작용 화 될 수있다 - 예를 들면, T 세포의 인테그린의 리간드 (ICAM1 불림). 또한, 항 CD3 단백질 도트를 기LD는 다른 항체 또는 CAM으로 대체 될 수있다. 우리는 T 세포 접착 연구를위한 플랫폼으로 향후 사용을 위해 단백질을 선택하고 있지만, 여기에 설명 된 전략은 어떤 ​​단백질과도 DNA에 대해 적용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Glass coverslips</td><td>Assistent, Karl Hecht KG&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Observation chamber</td><td>Home made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex)</td><td>Hella Analytics</td><td>9-307-011-4-507</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-sonicator</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Labbox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystallizer&amp;nbsp;</td><td>Shott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutravidine</td><td>Thermo Fischer Scientifique</td><td>84607</td><td></td></tr><tr><td>PBS&amp;nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Water MQ&amp;nbsp;</td><td>ELGA, Veolia France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silica beads</td><td>Corpuscular Inc</td><td>147114-10</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Biotin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Dansyl-PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810330C</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-aldrich</td><td>650471</td><td></td></tr><tr><td>Gastight syringe&amp;nbsp;</td><td>Dominique Dustcher , France</td><td>74453</td><td></td></tr><tr><td>Film balance</td><td>NIMA</td><td>Medium</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss, Germany</td><td>TIRF-III system</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium Target&amp;nbsp;</td><td>Kurt J. Lesker Compagny, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Radio Frequency Magnetron sputtering Syst&amp;egrave;me&amp;nbsp;</td><td>modified SMC 600 tool by ALCATEL , France</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ligand nano-cluster arrays in a supported lipid bilayer

현재 세포 생물학 연구를위한 패시베이션 표면의 바다에서 접착 단백질 섬의 순서 배열을 만드는 상당한 관심이있다. 지난 몇 년 동안, 그것은 살아있는 세포가 그들에게 제시 분자의 생화학 적 특성뿐만 아니라 이러한 분자가 제시하는 방식뿐만 아니라, 응답하는 것이 점점 명백 해졌다. 많은 생물학 실험실에서 이제 표준 그러므로 단백질 마이크로 패턴입니다 생성하는 단계; 나노 패턴은 더 액세스 할 수 있습니다. 그러나, 세포 - 세포 상호 작용의 맥락에서, 패턴에 필요뿐만 아니라 단백질뿐만 아니라 지질 이중층이있다. 이러한 이중 proteo - 지질 패턴은 지금까지 쉽게 접근 할 수 없었다. 우리는 유리에 지원되는 단백질 나노 도트를 만들고 지원되는 지질 이중층 (SLB)로 간 점 공간을 백필하는 방법을 제안 할 수있는 손쉬운 방법을 제공합니다. 트레이서의 사진에서 형광 표백 지질이 포함 SLB, 우리는 이중층의 PL-상당한 나타냄을 입증메탄을 유동성. 형광 그룹과 단백질 점을 기능화하는 이미지 그들과 그들이 정기적 육각형 격자에 정렬 것을 보여주기 위해 우리를 할 수 있습니다. 일반적인 도트 크기가 약 800 ㎚이며 여기 입증 간격은 2 마이크론이다. 이들 기판은 세포 부착, 이동 및 메카 감지 연구를위한 유용한 플랫폼을 제공 할 것으로 예상된다.

형광 이미지는 도트의 간격과 크기를 측정하기 위하여 분석되었다. 전형적인 간격은였다 1,900 ± 80 nm의 전형적인 도트 크기 600 ± 100 nm의 (도 1g)였다. 간격은 마스크에 사용되는 구슬의 크기에 의해 설정된다. 도트 크기가 비드 크기뿐만 아니라, 증착 조건에 의해 설정된다. SLB는 SLB 촬상 채널에서 볼 구멍 및 NAV 촬상 채널에서 보이는 점 사이의 완벽한 상호 보?...

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Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

우리는 유체 지질 이중층에 둘러싸여 나노 단백질 패치 유리를 기능화하는 프로토콜을 제시한다. 이 기판은 첨단 광학 현미경과 호환 및 세포 부착 및 이동 연구를위한 플랫폼 역할을 할 것으로 예상된다.

지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

ligand-nano-cluster-arrays-in-a-supported-lipid-bilayer

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.9K 조회수.  CNRS, UMR 7325, CINaM.  우리는 유체 지질 이중층에 둘러싸여 나노 단백질 패치 유리를 기능화하는 프로토콜을 제시한다. 이 기판은 첨단 광학 현미경과 호환 및 세포 부착 및 이동 연구를위한 플랫폼 역할을 할 것으로 예상된다. 

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Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

연구

생화학

Facile Preparation of Internally Self-assembled Lipid Particles Stabilized by Carbon Nanotubes

We present a facile method to prepare nanostructured lipid particles stabilized by carbon nanotubes (CNTs). Single-walled (pristine) and multi-walled (functionalized) CNTs are used as stabilizers to produce Pickering type oil-in-water (O/W) emulsions. Lipids namely, Dimodan U and Phytantriol are used as emulsifiers, which in excess water self-assemble into the bicontinuous cubic Pn3m phase. This highly viscous phase is fragmented into smaller particles using a probe ultrasonicator in presence of conventional surfactant stabilizers or CNTs as done here. Initially, the CNTs (powder form) are dispersed in water followed by further ultrasonication with the molten lipid to form the final emulsion. During this process the CNTs get coated with lipid molecules, which in turn are presumed to surround the lipid droplets to form a particulate emulsion that is stable for months. The average size of CNT-stabilized nanostructured lipid particles is in the submicron range, which compares well with the particles stabilized using conventional surfactants. Small angle X-ray scattering data confirms the retention of the original Pn3m cubic phase in the CNT-stabilized lipid dispersions as compared to the pure lipid phase (bulk state). Blue shift and lowering of the intensities in characteristic G and G&#39; bands of CNTs observed in Raman spectroscopy characterize the interaction between CNT surface and lipid molecules. These results suggest that the interactions between the CNTs and lipids are responsible for their mutual stabilization in aqueous solutions. As the concentrations of CNTs employed for stabilization are very low and lipid molecules are able to functionalize the CNTs, the toxicity of CNTs is expected to be insignificant while their biocompatibility is greatly enhanced. Hence the present approach finds a great potential in various biomedical applications, for instance, for developing hybrid nanocarrier systems for the delivery of multiple functional molecules as in combination therapy or polytherapy.

We report on a smart application of carbon nanotubes for kinetic stabilization of lipid particles that contain self-assembled nanostructures in their cores. The preparation of lipid particles requires rather low concentrations of carbon nanotubes permitting their use in biomedical applications such as drug delivery.

탄소 나노 튜브에 의해 안정화 내부 자기 조립 된 지질 입자의 용이 한 제조

We present a facile method to prepare nanostructured lipid particles stabilized by carbon nanotubes (CNTs). Single-walled (pristine) and multi-walled ...

화학

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

스퀴지 기반의 조립 방법과 생체막 마이크로 어레이의 형성

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

생체공학

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

폴리 디메틸 실록산 박막을 사용하여 자동화 지질 이중층 제막

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Self-Assembly of Hybrid Lipid Membranes Doped with Hydrophobic Organic Molecules at the Water/Air Interface

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers can be readily functionalized and have been used in various applications such as bio-sensors and bio-devices. In this study, we introduced a planar organic molecule: copper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) to dope lipid membranes. The CuPc/lipid hybrid membrane forms at the water/air interface by self-assembly. In this membrane, the hydrophobic CuPc molecules are located between the hydrophobic tails of lipid molecules, forming a lipid/CuPc/lipid sandwich structure. Interestingly, an air-stable hybrid lipid bilayer can be readily formed by transferring the hybrid membrane onto a Si substrate. We report a straightforward method for incorporating nanomaterials into a lipid bilayer system, which represents a new methodology for the fabrication of biosensors and biodevices.

We report a protocol for producing a hybrid lipid membrane at the water/air interface by doping the lipid bilayer with copper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) molecules. The resulting hybrid lipid membrane has a lipid/CuPc/lipid sandwich structure. This protocol can also be applied to the formation of other functional nanomaterials.

물/공기 인터페이스에서 소수성 유기 분자와 함께 도핑 하이브리드 지질 막의 자체 조립

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown into highly ordered two-dimensional (2D) crystals under favorable conditions. The quality of the grown 2D crystals is crucial to the resolution of the final reconstruction via 2D image processing. Over the years, lipid monolayers have been used as a supporting layer to foster the 2D crystallization of peripheral membrane proteins as well as soluble proteins. This method can also be applied to 2D crystallization of integral membrane proteins but requires more extensive empirical investigation to determine detergent and dialysis conditions to promote partitioning to the monolayer. A lipid monolayer forms at the air-water interface such that the polar lipid head groups remain hydrated in the aqueous phase and the non-polar, acyl chains, tails partition into the air, breaking the surface tension and flattening the water surface. The charged nature or distinctive chemical moieties of the head groups provide affinity for proteins in solution, promoting binding for 2D array formation. A newly formed monolayer with the 2D array can be readily transfer into an electron microscope (EM) on a carbon-coated copper grid used to lift and support the crystalline array. In this work, we describe a lipid monolayer methodology for cryogenic electron microscopic (cryo-EM) imaging.

Lipid monolayers have been used as a foundation for forming two-dimensional (2D) protein crystals for structural studies for decades. They are stable at the air-water interface and can serve as a thin supporting material for electron imaging. Here we present the proven steps on preparing lipid monolayers for biological studies.

전자 결정학 연구를 위한 지질 단층 방법을 이용한 샘플 준비

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It is not only passively generated by cellular activities, but also actively regulates protein interactions and is involved in many intracellular signaling. Thus, it is of great value to examine the role of membrane curvature in regulating the distribution and dynamics of proteins and lipids. Recently, many techniques have been developed to study the relationship between the curved membrane and protein in vitro. Compared to traditional techniques, the newly developed nanobar-supported lipid bilayer (SLB) offers both high-throughput and better accuracy in membrane curvature generation by forming a continuous lipid bilayer on patterned arrays of nanobars with a pre-defined membrane curvature and local flat control. Both the lipid fluidity and protein sensitivity to curved membranes can be quantitatively characterized using fluorescence microscopy imaging. Here, a detailed procedure on how to form a SLB on fabricated glass surfaces containing nanobar arrays&#160;and the characterization of curvature-sensitive proteins on such SLB are introduced. In addition, protocols for nanochip reusing and image processing are covered. Beyond the nanobar-SLB, this protocol is readily applicable to all types of nanostructured glass chips for curvature sensing studies.

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Here, a nanobar-supported lipid bilayer system is developed to provide a synthetic membrane with a defined curvature that enables the characterization of proteins with curvature sensing ability in vitro.

시험관 내 막 곡률 감지 단백질 연구를 위한 나노바 지원 지질 이중층 시스템

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

지질막의 광 제어 가역적 단백질 패터닝

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell polarization, migration, and division. Thus, methods to recruit proteins to model membranes with subcellular resolution and high temporal control are essential when reproducing and controlling such processes in synthetic cells. Here, a method is described for fabricating light-regulated reversible protein patterns at lipid membranes with high spatiotemporal precision. For this purpose, we immobilize the photoswitchable protein iLID (improved light-inducible dimer) on supported lipid bilayers (SLBs) and on the outer membrane of giant unilamellar vesicles (GUVs). Upon local blue light illumination, iLID binds to its partner Nano (wild-type SspB) and allows the recruitment of any protein of interest (POI) fused to Nano from the solution to the illuminated area on the membrane. This binding is reversible in the dark, which provides dynamic binding and release of the POI. Overall, this is a flexible and versatile method for regulating the localization of proteins with high precision in space and time using blue light.

저자 스포트라이트: 인공 세포 시스템에서 가역적 패터닝을 위한 Photo Switchable Protein Recruitment

Here, a protocol is described for generating light-regulated and reversible protein patterns with high spatiotemporal precision at artificial lipid membranes. The method consists of the localized photoactivation of the protein iLID (improved light-inducible dimer) immobilized on model membranes that, under blue light, binds to its partner protein Nano (wild-type SspB).