Nos gustaría dar las gracias a los miembros del laboratorio y los peces personal directivo instalación Pelegrí, que jugaron un papel decisivo en la facilitación de este proyecto. El apoyo a este proyecto fue proporcionada por el NIH R56 GM065303 del NIH y 2 T32 GM007133 a ELW, NIH 5 F31 GM108449-02 y 2 NIH T32 GM007133 a CCE, y los NIH RO1 GM065303 a FP

Todos pez cebra fueron manejadas en estricta conformidad con las buenas prácticas de los animales, según lo definido por los órganos de carácter nacional y / o local de los animales pertinentes, y todos los animales de trabajo fue aprobado por el comité correspondiente (Universidad de Wisconsin-Madison número aseguramiento A3368-01). Los animales se mantuvieron en condiciones estándar a 26,5 ° C. 1. Preselección de las hembras NOTA: Los oocitos en las hembras adultas típicamente abarcan una gama de etapas de desarrollo, a partir de la etapa I a V (Figura 2). Purgar las hembras de ovocitos preexistentes a través de un apareamiento natural con éxito aumenta la sincronización de puesta en escena de los ovocitos, como ovocitos recién en desarrollo aparecen como una cohorte 3, 14. Dentro de unos 8 días post-purga, la mayoría de los oocitos están en etapa IV temprano, lo cual es óptimo para la iniciación de la maduración in vitro. Tal sincronización aumenta el rendimiento de tha ovocitost puede pasar por el proceso completo de la maduración in vitro, lo que facilita la manipulación experimental. Ver descripciones previas 13 para más detalles sobre la configuración de los peces en los apareamientos pareados y en la composición del agua de pescado (aquí, 14 g de sal de mar y 150 g de NaHCO 3 por 1.000 l de agua de ósmosis inversa, pH 6.5 a 8.5 (intervalo preferido: 6,8 -7.5) y una conductividad de 180-360! S). Ver Brand et al. 13 para las recetas adicionales. <ol><li> De ocho a diez días antes de la manipulación de cultivo in vitro, utilizan una red de pesca para transferir un solo un solo pez macho y hembra de la cepa deseada a un tanque de apareamiento. Par de varios conjuntos. Dejarlos en la noche a la mañana tanque de apareamiento. Deje que se aparean durante la tarde y por la tarde del día siguiente. </li><li> Utilice una red de pesca para separar las hembras que producen huevos durante el apareamiento y colocarlos en un tanque separado. Alimentar a estos hembras dos veces al día con una mezcla de alimentos containing aproximadamente una cantidad igual de camarón de salmuera y alimentos en escamas de pescado. La cantidad de comida debería ser suficiente para proporcionar aproximadamente 20 min, pero no más, de tiempo de alimentación. </li></ol> 2. Preparación de la maduración Medium NOTA: Preparar medio de maduración en el día del experimento la maduración in vitro, dentro de 1 h de la eliminación de los ovocitos de la hembra (véase la sección 3). <ol><li> Añadir 20 ml de medio L-15 de Leibovitz con L-glutamina, pH 7,0, a un tubo cónico de 50 ml en condiciones estériles. Llevar a pH 9,0 con NaOH 10 N. </li><li> Añadir 9 ml de medio L-15 de Leibovitz, pH 9,0, a 2 tubos cónicos de 50 ml separados. Label 1 tubo &quot;+ DHP&quot; y el otro &quot;-DHP.&quot; </li><li> En el tubo de + DHP, añadir 10 l de 17α-20β-dihidroxi-4 pregnen-3-ona (DHP), 490 l de dH 2 O, y 500 l de 10% de albúmina de suero bovino (BSA). </li><li> En el tubo de -DHP, añadir 100 l de 10 mg / ml de gentamicina, 40081; L de dH 2 O, y 500 l de 10% de BSA. </li></ol> 3. La disección de los ovocitos y la iniciación del cultivo in vitro NOTA: El experimento de cultivo in vitro se lleva a cabo con hembras preseleccionados 8-10 días después de que se liberan los huevos a través de apareamiento natural. Usar medio de maduración hecho el mismo día (véase la sección 2). Ovocitos maduros apropiadamente si la disección se inicia cerca del final del ciclo diurno de pescado (determinado en el laboratorio mediante iluminación artificial pre-establecido en la instalación de pescado) 13, posiblemente procesos que ocurren a través de apareamiento natural imitando. Esto implica que la mayoría de los pasos en el protocolo deben llevarse a cabo en la noche si los peces se alojaron en una instalación con un ciclo de luz estándar (por ejemplo, a partir de la etapa 3.2 a 18:00 en una instalación con un período de luz 08 a.m.-10 p.m.), aunque otros trabajo periodos de tiempo son posibles con un ciclo de luz apropiadamente desplazado en el tiempo. <ol><li> Preparar una solución de tricaína de stock 0,2% en dH 2 O, tamponada a pH 7,0 con 1 M Tris, pH 9,0, y mantener esta solución a 4 ° C. Esto puede ser preparado de antemano. </li><li> Iniciar la h experimento 0-4 antes del final del ciclo diario de luz en la instalación. En un vaso de precipitados de 250 ml, añadir 20 ml de 0,2% de solución de tricaína Stock, pH 7,0, a 80 ml de agua pescado y mezclar. </li><li> La transferencia de las hembras pre-seleccionado para la solución tricaína y la eutanasia por la sobreexposición. Deja las hembras en la solución tricaína durante 15 minutos después del cese de movimiento gill. </li><li> Con una cuchara, recoger los peces sacrificados de la solución tricaína y enjuagar brevemente en agua los peces. Coloque el pescado en una toalla de papel para absorber el exceso de agua. </li><li> Utilice una hoja de afeitar limpia para decapitar a los peces sacrificados en el plano de la aleta pectoral. Usando tijeras de disección, hacer una incisión longitudinal en el lado ventral de los peces, que se extiende desde el extremo anterior de la zona anal. </li><li&gt; Colocar el pescado en una placa de Petri con un microscopio de disección con luz incidente. El uso de un par de fórceps de disección, transferir porciones de ovario a una placa de cultivo mm 35 x 10 que contenía 4 ml de medio L-15 de Leibovitz + DHP. NOTA: Los ovarios, que contienen los ovocitos en desarrollo, aparecerán como estructuras opacas y clumpy dentro de la cavidad interna del cuerpo. </li><li> Con unas pinzas de disección, disociar suavemente los ovocitos foliculares de las masas. Ordenar la primera etapa IV ovocitos (Figura 2B; anteriores a la ruptura GV, en tamaño casi máxima y se caracteriza por un citoplasma oscuro, opaco y un fácilmente evidente GV situado asimétricamente dentro del ovocito). Desechar los oocitos en las etapas anteriores (Figura 2A) y, huevos etapa V maduras translúcidos (similares a los de la Figura 2C, pero presente en los ovarios antes del tratamiento DHP). NOTA: Los ovocitos se seleccionan para la maduración en la etapa IV temprano, la etapa más temprana que resulta en madura, oocyt etapa Ves después de las condiciones de cultivo in vitro (Figura 2C y D) 3. Debido a ovocitos en estadio IV están produciendo activamente los productos, la manipulación en esta etapa permite la expresión de productos exógenos a través de la inyección de ARN o para la reducción de la función de genes a través de OMs introducidas. </li><li> Usar una pipeta Pasteur de vidrio para transferir los ovocitos primeros estadio IV a una segunda placa de cultivo de plástico mm 35 x 10 que contenía 4 ml de medio L-15 de Leibovitz + DHP. Transferencia de cantidades mínimas de medio -DHP al plato que contiene la solución + DHP. </li></ol> 4. La microinyección de ovocitos NOTA: etapa Aislado IV ovocitos sometidos a la maduración in vitro se pueden microinyectaron para introducir reactivos para la manipulación funcional o expresión de la proteína etiquetada. La microinyección de reactivos, tales como mRNA y Mos (ver sección 4), se lleva a cabo típicamente cuando los oocitos están experimentando in vitro maturación en medio + DHP, antes de defolliculation. Si se desea, con el fin de permitir más tiempo para llevar a cabo las manipulaciones antes de la maduración de ovocitos, las inyecciones pueden también llevarse a cabo en medio -DHP, antes de la maduración, durante al menos 2 h. Posteriormente, pueden ser transferidos a medio + DHP. <ol><li> Preparar los ARNm utilizando un kit de expresión estándar. Mantenerlos a -80 ° C como una 100-500 pg / l de stock para inyección a una concentración final de 50-500 pg / l (200 pg / l se recomienda) en agua RNA-grado. Preparar OMs a una concentración de 4 ng / l en agua de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Inyectarlos a concentraciones finales de 2 ng / l (o según se determina empíricamente). NOTA: Las inyecciones se llevan a cabo típicamente en un medio + DHP antes de defolliculation (véase la nota en la sección 5). </li><li> Si la inyección de ARNm, inmediatamente antes de la inyección, se diluye la ARNm utilizando agua-ósmosis inversa de ARN-grado y 0,2 M KCl para conseguir una solución final de 0,1 M KCl.</li><li> Si la inyección de MOS, inmediatamente antes de la inyección, se diluye la OMs a la concentración deseada con agua-ósmosis inversa y 0,2 M KCl para conseguir una solución final de 0,1 M KCl. </li><li> Mantener manualmente ovocitos con unas pinzas finas e inyectar aproximadamente 1 nL en de tipo salvaje ovocitos etapa IV con una aguja hecha con una pipeta capilar de vidrio desmenuzado. <ol><li> Preparar las agujas de vidrio tirando de tubos capilares de vidrio calentada, la carga de la solución a inyectar, y romper la punta de la aguja con un fórceps, tal como se describe anteriormente en protocolos de inyección estándar en embriones de pez cebra primeros 15. Nota: Es útil si la aguja tiene una conicidad gradual en lugar de un abrupto uno; Esto permite más flexibilidad en términos de la ubicación de la rotura en la punta de la aguja y también ayuda a evitar daños en el embrión inyectado. Usando la misma aguja y la solución como para las inyecciones de embrión, ajustar el volumen inyectado por pre-determinar elajustes de presión microinyector que producen el volumen deseado. Estos ajustes pueden ser determinados por-mock inyectar en una gota de aceite mineral sobre un portaobjetos de calibración platina del microscopio (0,01 mm) y el ajuste de la configuración de micro inyector para obtener el diámetro deseado en el bolo de solución inyectada, como se ha descrito previamente 15. </li></ol></li></ol> 5. La maduración de ovocitos y Defolliculation NOTA: Durante la maduración de ovocitos, los ovocitos serán cada vez más transparente, lo que permite la evaluación de las condiciones de cultivo exitosas. <ol><li> Continuar la incubación de la inmaduro (y, si es apropiado, inyectado) ovocitos en medio + DHP en 26,5 ° C, comprobando periódicamente (cada 30 min) para asegurar que los oocitos permanecen intactas y son sometidos a maduración adecuada al convertirse en progresivamente translúcido (véase la figura 2C) . <ol><li> Eliminar cualquier ovocitos de lisis con una pipeta Pasteur y desecharlosen un vaso de precipitados de residuos de laboratorio para mantener la calidad del medio. Cambiar el medio de cultivo con aproximadamente una mitad de volumen de fresco + medio DHP para mantener una solución clara, dependiendo de la cantidad de lisis de oocitos. </li><li> Dejar que la maduración in vitro de proceder hasta que una mayoría de los ovocitos ser translúcido y tienen un GV que ya no es aparente (aproximadamente 2 h en el tratamiento DHP, ver Figura 2C, en comparación con D). Verlas bajo un microscopio de disección con óptica de luz transmitida. </li></ol></li><li> Retire la membrana folicular más exterior de cada ovocito madurado. El uso de fórceps extrafinos para hacer un desgarro en la membrana folicular en una región con un mayor espacio entre el ovocito y la membrana. Despegar una porción de la membrana y rodar el ovocito fuera de la membrana mientras mantiene pulsada la parte pelada. NOTA: La membrana coriónica subyacente típicamente se mantendrá en estrecha asociación con el huevo durante este proceso; después de acto de huevoivation, se expande para formar una capa protectora para el embrión. </li><li> La transferencia de los ovocitos desfolicularon en un volumen mínimo de medio (normalmente, la transferencia de unos 5-10 ovocitos maduros en menos de 20! L) a una placa de Petri con unas pocas gotas de cultivo (+ DHP) medio y proceder a la fertilización. </li></ol> 6. La fertilización in vitro de oocitos cultivados NOTA: La solución de esperma en hielo, preparado a continuación, mantendrá su potencia durante aproximadamente 2 h. <ol><li> Preparar una solución de esperma cerca del final de la etapa de maduración de ovocitos y antes de defolliculation utilizando testículos de cinco machos en 500 l de solución de Hanks, como se ha descrito previamente 16, 17. </li><li> Añadir 10-50 l de solución de esperma a los ovocitos desfolicularon en medio de cultivo + DHP. Espere 10 s. </li><li> Con una pipeta, añadir unas gotas de embriones (E3) medio de los ovocitos. Espere 1 min y luego inundar el plcomió con medio E3. NOTA: La composición del medio de E3 es el siguiente: NaCl 5 mM, KCl 0,17 mM, 0,33 mM de CaCl2, 0,33 mM MgSO4, y 1-5% de azul de metileno 13. </li><li> Repetir los pasos 5.3, 6.2, y 6.3 para obtener un mayor número de embriones fertilizados. </li><li> Permita que los embriones fertilizados se desarrollen. Utilice un microscopio de disección con óptica de luz transmitida para observar la progresión a través de las etapas de escisión para garantizar la fertilización con éxito, como se describe anteriormente para la fertilización 17 y puesta en escena 18. </li></ol>

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Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

El protocolo anterior es para la manipulación de productos génicos antes de la fertilización, lo que permite el estudio de los productos génicos maternos en el embrión de pez cebra temprano. Estudios anteriores han sido capaces de madurar los ovocitos in vitro 4; este protocolo se modificó para permitir la fertilización subsiguiente in vitro de ovocitos 8 madurado. Esto a su vez permite la inyección de reactivos para la manipulación funcional y visualización de los productos de herencia materna en el embrión temprano 3. Los embriones resultantes de este método pueden ser viables y pueden sobrevivir a convertirse en adultos fértiles. En experimentos preliminares, aproximadamente la mitad de los embriones fertilizados derivados de este procedimiento eran viables en el día 5 de desarrollo, tal como se evaluó por la inflación vejiga natatoria en esa etapa, alrededor de la mitad de los cuales se convirtió, adultos fértiles (observaciones no publicadas) sanos. Hay un numeropasos de críticos a considerar en el protocolo. Los ovocitos en la etapa apropiada para iniciar la maduración (a principios de la etapa IV) puede ser enriquecido si la hembra se ha acoplado recientemente, pero no antes de 8 dpp. El uso de pescado que no se han apareado recientemente podría resultar en la degeneración huevos 14, que no serán sometidos a maduración. Hembras apareadas en menos de 8 días tendrán una mayoría de los huevos en la etapa III o menos, y por lo tanto, los huevos no maduran correctamente in vitro. Ovarios en las hembras que se aparearon 8 días antes tendrán una fracción óptima de los ovocitos a principios de la etapa IV. Estos pueden ser reconocidos por su opacidad y la presencia de la GV en una posición excéntrica (Figura 2B). Determinación etapa de ovocitos también puede ser ayudado por la medida del tamaño, con los ovocitos colocan en un portaobjetos de micrómetro graduado bajo un microscopio y se compararon con las directrices de estadificación estándar (Tabla 1). Sin embargo, los oocitos IV etapa temprana tienen un tamaño casi máxima en comparación con madurarovocitos (reconocidos por su relativa transparencia y la ausencia de una GV; Figura 2C) y se reconocen fácilmente, como se describió anteriormente, que evita generalmente la necesidad de una medición directa del tamaño de los ovocitos. La maduración in vitro debe comenzar dentro de varias horas de la final del ciclo de la luz del día a la que se aclimataron los donantes de ovocitos femeninos. Ovocitos no maduran correctamente, se refleja en las tasas de fertilización pobres, si se cultivan durante el período de la mañana del ciclo de luz. La razón de la dependencia circadiano del método de la maduración de ovocitos in vitro no se entiende pero probablemente refleja sesgos circadianos subyacentes en in vivo la maduración del óvulo que implican ciclismo la expresión génica durante la ovogénesis 21. Una causa común de ovocitos que fallan a someterse éxito en la maduración in vitro, a pesar de estadificación ovocito adecuado es que el DHP ha expirado. la hormona DHP expira generalmente después de un año, y para asegurar el efectoive la maduración, el lote de trabajo debe ser sustituido dentro de 9 meses de uso. La inyección de ovocitos es otro paso crítico cuando el propósito del método es la manipulación funcional de los productos maternas. Este procedimiento tiene requisitos que difieren de aquellos para las inyecciones estándar en el huevo fertilizado en 0-30 MPF. Un factor clave en la inyección de ovocitos es la necesidad de llevar a cabo las inyecciones en condiciones que no conducen a la activación prematura de huevo, como en medio L-15 de Leibovitz 22, 23. Porque están incrustadas en los ovarios, oocitos con vencimiento también plantean retos particulares a la inyección. El protocolo anterior sugiere primera disociar ovocitos de los ovarios y manteniendo cada disociado ovocito por separado con fórceps mientras se inyecta. Esta técnica ha funcionado bien y permite ovocitos de preclasificación en la fase adecuada con una manipulación mínima. Los métodos alternativos también pueden ser utilizados, talescomo: i) la colocación de los ovocitos en la inyección estándar artesas de agarosa 15, donde las paredes verticales del soporte de la cubeta el ovocito durante la inyección (en este método alternativo, los oocitos necesitan ser transferida a placas de inyección mientras mantienen en medio de maduración in vitro) y ii ) permitiendo que los ovocitos a permanecer unidos a la masa ovárica, que puede ser sostenido con el fórceps durante la inyección para evitar el contacto con el ovocito inyectado (en este enfoque, los oocitos deben ser disociados después de la inyección tanto para facilitar la exposición DHP y para permitir su defolliculation , sí esencial para la fertilización in vitro). A pesar de este desafío específico, los ovocitos en etapa IV puede ser penetrado fácilmente con una aguja de inyección, probablemente porque la membrana coriónica en esta etapa no está completamente desarrollado 9. Una limitación del protocolo de maduración actual es que en condiciones de maduración in vitro que promueven el desarrollo adecuado de ovocitosno puede ser creada cuando la maduración de ovocitos se inicia en las primeras etapas de la etapa IV. Los ovocitos se convierten en competentes para responder a DHP por sometidos a maduración cuando alcanzan un diámetro de 520 micras, que se produce durante la etapa III (vitelogénesis, que corresponde a la gama de 340 a 690-m) 9. Sin embargo, el cultivo de la etapa III ovocitos resultados en oocitos que no son competentes para la fecundación 3. Sólo ovocitos cuyo cultivo in vitro se inicia en la etapa IV (Figura 2B) puede convertirse en, ovocitos etapa V maduros (Figura 2C y D). Esto puede estar relacionado con el hecho de que la etapa III es esencial para la vitelogénesis y ovocito crecimiento 9. Por lo tanto, el procedimiento de maduración de ovocitos in vitro en presentado en este artículo sólo se debe utilizar con una población de partida de la etapa IV ovocitos (B), y no con los oocitos en las etapas anteriores (etapas I - III; Figur e <strong&gt; 2A). Por la misma razón, este procedimiento está limitado a genes que se expresan en la etapa IV o posterior. La manipulación funcional de genes cuyos productos están expresadas anteriormente puede en lugar de tener que depender de métodos genéticos (véase más adelante). Las mejoras a los métodos de cultivo in vitro de maduración pueden en el futuro permitir la iniciación de cultivo de ovocitos en etapas anteriores, ampliando así el poder del enfoque de la maduración in vitro. Otra limitación en el método presentado es que defolliculation, que es esencial para las etapas ulteriores que implican la fertilización, es actualmente un paso limitante de la velocidad en el procedimiento. La membrana folicular es una capa transparente que rodea el ovocito en desarrollo, y la eliminación puede ser tedioso. Si esta membrana no se elimina por completo, el huevo no será plenamente activado y fertilizado. Esto se hace evidente por el hecho de que el corion para expandir y el desarrollo de irregularmente colocado, surco-como structures (pseudocleavages), típico de los embriones fertilizados 11. Métodos defolliculation enzimáticos tales como colagenasa, como se usa en Xenopus, se han intentado. Sin embargo, en nuestras manos, esta técnica no ha tenido éxito, y por lo tanto depender de defolliculation manual. Debido defolliculation manual es laborioso y consume mucho tiempo, es difícil obtener grandes lotes de huevos fertilizados después de la maduración in vitro de ovocitos. Debido a la limitación temporal impuesta por defolliculation manual, que actualmente fertilizamos unos pocos, los huevos maduros desfolicularon a la vez, en lotes pequeños de 5-10 huevos. La incorporación de defolliculation enzimática con este procedimiento aumentaría probablemente de manera significativa su rendimiento y la facilidad de uso general. Aunque los embriones producidos después de la fertilización de ovocitos -matured in vitro pueden convertirse en adultos viables, observamos que después de la fertilización in vitro, una fracción de los embriones hacer<html> No dividir normalmente o en el momento oportuno. Actualmente estamos seleccionando para líneas cuya propagación incluye rondas de maduración in vitro de ovocitos en, que pueden resultar en patrones más robustas de desarrollo en embriones derivados a través de este método. El procedimiento ha permitido para el rescate claro o visualización de la localización de proteínas para un número de mutaciones 24, 25. Sin embargo, para algunos genes, la regulación de la expresión del producto puede ser crucial, por lo que los productos expresados por el ARNm inyectado puede conducir a resultados variables 26. También es importante ser consciente de todos los controles (por ejemplo, embriones inyectados con reactivos que tienen propiedades similares a los utilizados en el experimento sin embargo se prevé que no producir un efecto, como OMs de control o ARN que codifican para las proteínas inertes solamente, tales como GFP), como la variabilidad subyacente puede llevar a conclusiones incorrectas. nt &quot;&gt; Un enfoque implica manipulación in vitro, seguido de la fertilización es particularmente útil en el caso de productos maternalmente depositados, donde el método estándar de la inyección de ARN, OMs, o proteína en el huevo fertilizado puede no reducir efectivamente productos ya acumulados en el huevo. otros métodos desarrollados recientemente, tales como la generación de CRISPR-mutante, también son eficaces en la generación de condiciones de mutantes de los genes expresados por vía materna 26. Sin embargo, este método requiere el crecimiento de varias generaciones de pescado. la técnica de la maduración de ovocitos in vitro permite la manipulación funcional rápida a estudiar la función de los genes expresados ​​por vía materna, incluyendo el rescate y phenocopy de mutaciones materno-efecto, así como la expresión de ARN y proteínas en el embrión temprano.

Durante el desarrollo animal, los depósitos madre productos génicos (por ejemplo, ARN, proteínas, y otras biomoléculas) en el huevo; estos productos son importantes para los procesos celulares tempranos inmediatamente después de la fertilización 1, 2. La manipulación de la expresión y función de los productos materna es típicamente ineficaces cuando se utiliza un enfoque estándar para la inyección de los reactivos en huevos fertilizados 3. Esto es porque la mayoría de los ARN y proteínas son producidas por el ovocito durante la ovogénesis, lo que los productos maternas precargados ya están presentes en el huevo maduro. Tales productos preexistentes son impermeables a la caída funcional, con agentes de genes de orientación, tales como oligos antisentido de morfolino (MOS), porque OMs se dirigen a los ARNm, no la proteína preexistente ya presente en el huevo en la fertilización. Además, muchos procesos embrionarios tempranos ocurren demasiado pronto después de la fertilización que se influenced por los productos de proteínas derivadas de ARN se inyecta en el huevo fertilizado, que el ARN no puede producir suficientemente rápido como para influir en los primeros eventos de la embriogénesis. Por la misma razón, etiquetado fusiones de proteínas expresadas a través de una inyección de ARNm en el óvulo fertilizado no se pueden producir en el tiempo para la visualización durante su papel activo en el embrión temprano. La inyección en ovocitos maduros extruidos antes de la activación del huevo es posible, pero se asocia con problemas técnicos similares: dichos huevos maduros se ya pre-cargado con proteína materna, y no se convertirá en traslación activo (es decir, producir la proteína de las transcripciones exógenos) hasta después de huevo activación. Por estas razones, la manipulación de los productos de los genes maternos que actúan en la embriogénesis temprana por lo general tiene que ser llevado a cabo durante la ovogénesis en el ovocito maduro. Como un enfoque para superar estos obstáculos, en los métodos de maduración in vitro, que permiten la maduración de OOCytes de la etapa IV a la formación del huevo, se han establecido en el pez cebra. Los primeros métodos permiten la maduración in vitro, pero los huevos maduros resultantes no eran competentes para la fertilización 4. Posteriormente, la manipulación de las condiciones de cultivo de neutro a pH 9,0, imitando el pH alcalino del fluido de ovario encontrado en especies de peces 5, 6, permitido para la fertilización fiable in vitro (FIV) después de la maduración in vitro 7, 8. De hecho, en vitro ovocitos -matured pueden producir embriones viables que sobreviven a la edad adulta y que son fértiles 3, 8. Este método mejorado se ha adaptado adicionalmente para incluir la manipulación funcional de genes maternos, la expresión de proteínas etiquetadas durante la ovogénesis pez cebra través de la expresión exógena, y MO mediada funcional derribar en esteraetapa urante IV ovocitos 3 (figura 1). Ovogénesis pez cebra presenta una serie de etapas características que conducen a la formación de ovocitos maduros 9 (véase la Tabla 1 para una guía rápida de las diversas etapas en la ovogénesis). En pocas palabras, el desarrollo de los ovocitos se inicia por los ovocitos en estadio I y está detenido en la etapa diplotena de la profase I de la meiosis. Estos ovocitos se someten a crecimiento a través de la transcripción activo (iniciado durante los estadios IA y IB), la formación de alvéolos corticales (también conocido como gránulos corticales, iniciadas durante la etapa II), y la vitelogénesis (iniciado durante la etapa III). crecimiento de los ovocitos se completa durante la etapa IV, cuando meiosis I hojas de vida, lo que resulta en el desmontaje del núcleo de ovocitos, referido como la vesícula germinal (GV). Posteriormente, la meiosis es detenido de nuevo en la metafase II. La finalización de crecimiento de los ovocitos y detención meiótica durante la etapa IV conduce a una etapa de madurez V por ejemplo,g 9. La eliminación de la membrana folicular se produce durante la liberación del ovocito en el lumen del ovario 10 y es esencial para la fertilización y la activación del huevo apropiado. Una vez que los huevos son extruidos de la madre durante el apareamiento natural, que se activan. En el pez cebra, la exposición a agua es suficiente para la activación del huevo completo, independientemente de la presencia de espermatozoides 11. En condiciones in vitro permiten actualmente para la maduración de ovocitos de etapa temprana IV-que puede ser reconocido por su tamaño (690-730 m), la presencia de un gran GV en una posición asimétrica, y un aspecto totalmente opaco debido a la acumulación de proteínas de la yema (Figura 2B): para el huevo etapa V madura, caracterizado por un GV totalmente desmontada y una apariencia translúcida debido a la yema de procesamiento de la proteína 12 (Figura 2C). En este enfoque, los ovarios enteros contovocitos aining en diferentes etapas de desarrollo se retiran de las hembras. Los ovocitos se les permite desarrollar en 17α-20β-dihidroxi-4 pregnen-3-ona (DHP), un eficaz hormona maduración inductor de 8. Durante este período, los ovocitos de maduración se pueden manipular a través de la inyección de expresión (por ejemplo, capsulado, in vitro -transcribed mRNAs) o agentes inversa genética (por ejemplo, MOS). La capa folicular no arroja espontáneamente hacia el final del período de maduración, por lo que se debe retirar manualmente. Después de defolliculation, la fertilización in vitro se consigue mediante la activación de la activación del huevo a través de la exposición de los huevos a agua (presente en medio embrionario (E3)) 13 y una solución de esperma. Los zigotos resultantes experimentan un desarrollo embrionario y permiten la evaluación de la capacidad de los tratamientos para manipular la función del gen de la madre y para la visualización y análisis de los productos etiquetados maternas ( <strong&gt; Figura 3).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zebrafish mating boxes</td>
			<td>Aqua Schwarz</td>
			<td>SpawningBox1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>Tricaine-D (MS 222)</td>
			<td>FDA approved (ANADA 200-226)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>920-1</td>
			<td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish net (fine mesh) (4-5 in)</td>
			<td>PennPlax</td>
			<td>(ThatFishThatPlace # 212370)</td>
			<td>available in ThatFishThatPlace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spoon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available in most standard stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14091-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>SS</td>
			<td>available from Fine Science Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereoscope (with transmitted light source)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflective light source (LED arms)</td>
			<td>Fostec</td>
			<td>KL1600 LED</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates 10 cm diameter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes 1.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow spatula</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression glass plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>722085 (Fisher cat. No 13-748B)</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>06-666-11</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer stop watch</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash bottle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24020500</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beakers, 250 ml (2)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>1000250</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;z L-15 medium</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465</td>
			<td>for pH&#39;ing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Apparatus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FemtoJet</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Tubing for injection needles</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td>or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-87</td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetor (1-20 &#181;l range) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetor (20 - 200 &#181;l range) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetor (100 - 1000 &#181;l range) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 50ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic pipette 10 ml with bulb</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic pipette 20 ml with bulb</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>MR095</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for fish water:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Salt</td>
			<td>Drs. Foster &#38; Smith</td>
			<td>&#160;CD-116528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (cell culture tested)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for E3 medium:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2, dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4, heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63138-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish Food:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen brine shrimp</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td>FBSFKG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramin Flakes</td>
			<td>Drs. Foster &#38; Smith</td>
			<td>16623</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish

eventos celulares que tienen lugar durante las primeras etapas del desarrollo embrionario de los animales son conducidos por los productos de genes derivados de la madre depositados en el oocito en desarrollo. Debido a que estos eventos se basan en productos maternas que normalmente actúan muy poco después de la fertilización, que preexisten en el interior del huevo, los enfoques estándar para la expresión y la reducción funcional que implican la inyección de reactivos en el óvulo fertilizado no suelen ser efectivas. En su lugar, estas manipulaciones deben realizarse durante la ovogénesis, antes o durante la acumulación de productos maternos. Este artículo describe en detalle un protocolo para la maduración in vitro de oocitos inmaduros de pez cebra y su posterior fertilización in vitro, produciendo embriones viables que sobreviven a la edad adulta. Este método permite la manipulación funcional de los productos maternas durante la ovogénesis, tales como la expresión de productos para el rescate fenotípico y visualización constructo etiquetado, así como unaS La reducción de la función de genes a través de agentes de genética inversa.

Para determinar si el procedimiento descrito anteriormente tiene éxito, los embriones pueden ser observados durante las etapas de escisión para confirmar la aparición del patrón de escisión temprana-embrionario estereotipada 18, así como a las 24 h después de la fertilización (hpf) para confirmar el correcto desarrollo del plan básico del cuerpo. Este procedimiento permite la manipulación de productos maternos para estudios funcionales a través de la inyección de los reactivos, tales como ARNm y Mos, durante el desarrollo de ovocitos. La manipulación de productos maternos para estudios funcionales: codificación de ARNm para de tipo salvaje y productos mutados se puede inyectar en oocitos madurados in vitro para probar el efecto de la manipulación de la función de genes materna durante la meiosis y las primeras etapas embrionarias. Por ejemplo, los embriones de tipo salvaje pueden ser inyectados con wimRNA de tipo ld para poner a prueba el efecto de la sobreexpresión del producto, o con el ARN mutante a prueba para potenciales (por ejemplo, de ganancia de función y antimorphic) efectos dominantes en estos procesos. Los ovocitos en cultivo in vitro son capaces de producir la proteína a partir de ARNm exógeno en todo el desarrollo de oocitos, como se muestra por la expresión de GFP a partir del ARNm inyectado, aunque sólo ovocitos que inician condiciones de cultivo en la etapa IV de la ovogénesis pueden desarrollar en oocitos de fase V maduros (Figura 2B -2D, consulta Nair et al. 3). La expresión del producto de tipo salvaje a través de mRNA inyectado también es instrumental para el rescate de mutaciones materno-efecto para confirmar la identidad de genes durante la clonación posicional 3, 24. En este caso, el ARNm de tipo salvaje se inyecta en ovocitos de hembras mutantes homocigotos para probar si los productos de tipo salvaje pueden rescatar el fenotipo mutante. Este rescate genético se ilustra en &lt;strong&gt; Figura 3A-3C, la inyección AurB mRNA se muestra para rescatar a los efectos fenotípicos de una mutación en su correspondiente gen, isla celular (CEI) (Figura 3A-3C). Los embriones de un grupo de control también se les permite desarrollar para mostrar el fenotipo mutante correspondiente 3. ARN mutantes también se puede inyectar en oocitos de mutantes para probar si el producto mutado retiene la función parcial mediante la comparación de la medida de rescate a la causada por el producto de tipo salvaje. La expresión de proteína a partir del ARNm inyectado en oocitos en desarrollo parece ocurrir con poca o ninguna demora. Expresión de GFP fuerte se observa dentro de 2 h de la inyección del ARNm correspondiente, independientemente de la etapa de desarrollo del oocito 3 (Figura 2B-2D; ver también Nair et al. 3). Los productos tales como: mCherrySAS6 y Birc5b (Motley): GFP se puede observar inmediatamente después de la fecundación y durante el primer ciclo celular embrionario 3, 25. La inyección de ARNm durante la ovogénesis también conduce a la producción de la proteína que, independientemente de la fracción de etiquetado fusionado, es funcional inmediatamente después de la fertilización, como se muestra en el caso de productos maternos para la isla celular / aurB 3, ciclo fútil / LRMP 24, y Motley / bir5b 25. Traducción de bloqueo de OM también tienen un efecto inmediato después de la fecundación, como se muestra por ciclo fútil / LRMP 3 y en etapas posteriores de la embriogénesis, como en el caso de la misión imposible / dhx16 3. Splice de bloqueo de MOS, cuando se inyectan en oocitos de maduración, no puede tener un efecto sobre la función materna, probablemente ya presentes transcripciones maternas maduras debido en ovocitos en estadio IV &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 3. Generación de morphants: Cuando se utiliza un MO correspondiente a un gen con una mutación ya identificados-, se espera que el fenotipo morphant para imitar el fenotipo mutante. Morphants se comparan con los embriones no inyectados y para los inyectados con un estándar, control MO. La inyección de un morfolino traducción de bloqueo puede phenocopy éxito el conocido fenotipo mutante 3, como se muestra por la inyección de LRMP MO en oocitos, que imita el fenotipo mutante de la mutación correspondiente, inútil ciclo (Figura 3D-F). La especificidad de OMs se puede determinar a través de los mismos métodos utilizados al inyectar OMs en embriones (revisado anteriormente) 19, 20. Expresión de proteínas de fusión marcadas con fluorescencia: ARNm que codifica productos génicos de interés fusionada a las proteínas fluorescentes (por ejemplo, GFP y mCherry) también se puede inyectar en ya sea de tipo salvaje o ovocitos mutantes para visualizar los productos correspondientes en el embrión temprano (es decir, lo que refleja un patrón de localización subcelular; Figura 3G y 3H). los ARNm que codifican las fusiones similares, pero que implican el alelo mutante pueden expresarse de manera similar para probar si la mutación afecta a cualquier potenciales localizaciones subcelulares. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55213/55213fig1.jpg" /> Figura 1: In Vitro maduración de ovocitos. Diagrama esquemático que muestra las diversas etapas implicadas en la maduración in vitro de ovocitos en. Las hembras adultas son pre-seleccionados para la puesta de huevos 8 días antes del procedimiento, a depurarlos de huevos que ya han madurado y a ProMote desarrollo de nuevos ovocitos. Los ovarios, que contiene los ovocitos en desarrollo, se retiran de las hembras y se transfieren a un medio que contiene el DHP hormona para inducir la maduración de ovocitos in vitro. Después de la eliminación de las hembras e inmediatamente antes de o durante la maduración de ovocitos, los ovocitos pueden ser inyectados con productos de ARN y otros reactivos para la manipulación funcional de factores maternos. Ovocitos maduros se desfolicularon manualmente y fertilizados in vitro con una solución de esperma para producir, embriones viables fertilizados. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55213/55213fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55213/55213fig2.jpg" /> Figura 2: In Vitro maduración de ovocitos y expresión de productos a partir del ARNm inyectado. (A) Los oocitos en las etapas I-III, observados en los ovarios dehembras 4 días post-purga (dpp). (B) los ovocitos en la etapa IV, se observa en los ovarios de las hembras 8 dpp. La vesícula germinal (GV, punta de flecha) es claramente visible y ocupa una posición excéntrica. La etapa III ovocitos en (A) también presentan una GV fácilmente evidente, pero se encuentra centrado en el ovocito. Ovocitos en estadio IV en (B) tienen un tamaño que es casi máxima en comparación con la de oocitos maduros en (C). (C y D) los ovocitos en la etapa V (madurar los ovocitos) después de 2 h en condiciones de maduración in vitro iniciadas en la etapa IV, como en (B), e inyectados durante la maduración con GFP-codificación, in vitro ARNm transcrito (C, la luz visible solamente; D, superposición de la luz visible y de fluorescencia GFP). El GV ya no es aparente en ovocitos V de la etapa, que también son menos opaco de ovocitos en estadio IV. Los oocitos inyectados expresan la proteína GFP (D). Defolliculation de ovocitos en estadio IV maduros es described en la sección de protocolo. Barra de escala = 300 m. Todos los paneles se reprodujeron, con autorización, de Nair et al 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55213/55213fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55213/55213fig3.jpg" /> Figura 3: manipulación y visualización de los productos maternos a través de In Vitro maduración de ovocitos. (A - C) Rescate del fenotipo materno-efecto causado por una mutación en isla celular / Aurora B a través de la inyección de tipo salvaje aurB ARNm en estadio IV CEI ovocitos / aurB. imágenes fusionadas que muestran vistas animales de 65 blastodiscs fijos MPF, visualizados con anticuerpos anti-ß-catenina para resaltar las membranas (verde), anticuerpos anti-alfa-tubulina para indicar los microtúbulos (rojo), y DAPI para designar ADN (azul). (A) la acumulación de β-catenina en embriones de tipo salvaje, indicativa de maduración surco normal. (B) A cei / aurB embrión de un CEI / aurB etapa IV ovocitos sin inyectar muestra surcos parciales, rudimentarios que no acumulan β-catenina. (C) A cei rescatado / aurB embrión a partir de un oocito cei / aurB inyectado con el tipo salvaje aurB mRNA que muestra robusto acumulación β-catenina en los surcos. (D - F) fenocopia de la materno-efecto causado por una mutación en ciclo fútil / LRMP de la inyección de LRMP morfolino en etapa IV ovocitos. imágenes fusionadas que muestran vistas animales de 70 blastodiscs fijos MPF, visualizados con anticuerpos anti-gamma-tubulina para indicar centrosomas (rojo) y DAPI para designar ADN (azul). (D) En los embriones de tipo salvaje, cada uno asociados núcleo con γ-tubulina, un marcador para el material centrosomal. (E) En materno-efecto mutantes FUE, la fusión pronuclear falla, lo que resulta en dos a tres parches de etiquetas de ADN correspondientes a no fusionadas pro-núcleos de los padres y el cuerpo polar para meiosis II. (F) En morphants LRMP, donde se inhibe la función LRMP materna, los núcleos de manera similar fallan para dividir y, además, fallan en la unión con γ-tubulina. (G y H) Visualización de producto producido por vía materna en el embrión temprano. proteína Sass6-mCherry partir de ARNm exógeno inyecta en etapa IV ovocitos se localiza en los centriolos. imágenes fusionadas que muestran vistas animales de 40 blastodiscs fijos MPF, visualizados con anticuerpos anti-gamma-tubulina para resaltar centrosomas (verde), fluorescencia mCherry para indicar Sass6 (rojo), y DAPI para designar ADN (azul). (G) proteína expresada Sass6-mCherry localiza a focos etiquetado por el centrosoma marcadores γ-tubulina en los sitios que flanquean el núcleo (flechas). (H </strong&gt;) La misma imagen, mostrando sólo Sass6-mCherry y DAPI para mayor claridad. Los embriones en (G y H) son fijos, pero la fluorescencia de los productos expresados, tales como fusiones mCherry, también pueden ser observados en embriones vivos (no mostrados). Barra de escala = 100 m de AF y 10 micras en G y H. Todos los paneles se reprodujeron, con autorización, de Nair et al 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55213/55213fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Etapas de Ovogénesis </td><td> Diámetro de ovocitos (m) </td><td> Hito clave (s) </td></tr><tr><td> 1A - Prefollicle </td><td> 7 a 20 </td><td> Iniciación de la transcripción activa, la acumulación de nucleolos </td></tr><tr><td> 1B - Folículo </strong&gt; </td><td> 20 a 140 </td><td> Descondensación de los cromosomas </td></tr><tr><td> II - alveolo cortical </td><td> 140-340 </td><td> la producción de alvéolos corticales </td></tr><tr><td> III - La vitelogénesis </td><td> 340-690 </td><td> Oscurecimiento de ooplasma por la acumulación de yema de la proteína precursora y lípidos </td></tr><tr><td> Early IV - maduración de ovocitos </td><td> 690-730 (rango inferior) </td><td> localización asimétrica de vesícula germinal </td></tr><tr><td> Early IV - maduración de ovocitos </td><td> 690-730 (rango superior) </td><td> vesícula germinal desaparece, la detención en metafase II </td></tr><tr><td> V - ovocito maduro </td><td> ~ 750 </td><td> Ooplasma / yema se hace translúcida </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Señales de desarrollo de los ovocitos en Zebrapescado.

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Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Un protocolo optimizado para la maduración in vitro de ovocitos de pez cebra utilizados para la manipulación de los productos génicos maternos se presenta aquí.

La manipulación de genes maternos funcional de Productos que utilizan<em&gt; In Vitro</em&gt; La maduración de ovocitos en el pez cebra

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

functional-manipulation-maternal-gene-products-using-vitro-oocyte

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

11.3K vistas.  University of Wisconsin-Madison.  Un protocolo optimizado para la maduración in vitro de ovocitos de pez cebra utilizados para la manipulación de los productos génicos maternos se presenta aquí. 

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Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

La manipulación y<em&gt; In Vitro</em&gt; La maduración de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los ovocitos, seguido de inyección intracitoplasmática de espermatozoides, para estudiar el desarrollo embrionario

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Mosaico de pez cebra transgénesis de Análisis Genómica Funcional de candidatos genes cooperativos en la patogénesis del tumor

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Clonación funcional utilizando una<em&gt; Xenopus</em&gt; Sistema de Expresión de ovocitos

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

La manipulación de ploidía de embriones de pez cebra con el Heat Shock Treatment 2

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their potential applications in cardiac research, including drug discovery, disease modeling, tissue engineering, and regenerative medicine. However, cells produced by existing protocols display a range of immaturity compared with native adult ventricular cardiomyocytes. Many efforts have been made to mature hPSC-CMs, with only moderate maturation attained thus far. Therefore, an engineered system, called biowire, has been devised by providing both physical and electrical cues to lead hPSC-CMs to a more mature state in vitro. The system uses a microfabricated platform to seed hPSC-CMs in collagen type I gel along a rigid template suture to assemble into aligned cardiac tissue (biowire), which is subjected to electrical field stimulation with a progressively increasing frequency. Compared to nonstimulated controls, stimulated biowired cardiomyocytes exhibit an enhanced degree of structural and electrophysiological maturation. Such changes are dependent upon the stimulation rate. This manuscript describes in detail the design and creation of biowires.

The cardiac biowire platform is an in vitro method used to mature human embryonic and induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CM) by combining three-dimensional cell cultivation with electrical stimulation. This manuscript presents the detailed setup of the cardiac biowire platform.

La maduración de madre humanas cardiomiocitos derivado de células en Biowires uso de la estimulación eléctrica

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Imágenes de células vivas de la segregación de cromosomas durante la Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

Generación de insulina libre de andamios, tridimensional expresar Pancreatoids de progenitores pancreáticos de ratón In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart after apex resection or cryoinjury, making it an important model organism for heart regeneration study. However, the lack of loss-of-function methods for adult organs has restricted insights into the mechanisms underlying heart regeneration. RNA interference via different delivery systems is a powerful tool for silencing genes in mammalian cells and model organisms. We have previously reported that siRNA-encapsulated nanoparticles successfully enter cells and result in a remarkable gene-specific knockdown in the regenerating adult zebrafish heart. Here, we present a simple, rapid, and efficient protocol for the dendrimer-mediated siRNA delivery and gene-silencing in the regenerating adult zebrafish heart. This method provides an alternative approach for determining gene functions in adult organs in zebrafish and can be extended to other model organisms as well.

It remains a major challenge to develop conditional gene-knockout or effective gene-knockdown in adult zebrafish organs. Here we report a protocol for performing nanoparticle-mediated siRNA gene-silencing in adult zebrafish heart, thus providing a new loss-of-function method for studying adult organs in zebrafish and other model organisms.

Nanopartícula mediada por siRNA silenciamiento génico en corazón de pez cebra adulto

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...