El papel de muchos genes expresados por la madre durante el desarrollo temprano es actualmente desconocido. Esta técnica CRISPR materna permite la rápida identificación de genes de efecto materno y su papel en el desarrollo. La multiplexación guía los ARN a un solo gen, permite a los investigadores identificar nuevos fenotipos de efecto materno en una sola generación.
Esta investigación es beneficiosa para comprender la función de las transcripciones de ARNm en los gametos, que son necesarias para la embriogénesis temprana. La clave de esta técnica es microinyectar los embriones al principio de la etapa de una célula, y verificar si la mayoría de los ARN guía pueden producir mutaciones somáticas en los embriones inyectados. Para crear una plantilla de ARN guía para cada oligonucleótido específico del gen, analice el oligonucleótido constante y rellene los voladizos con ADN polimerasa T4.
Después de ensamblar las cuatro plantillas de ARN guía, purifíquelas y concéntrelas juntas usando un kit concentrador y de limpieza de ADN. Sintetice la mezcla de sgRNA a partir de la plantilla de ARN de tipo agrupada, utilizando un kit de transcripción T7 in vitro, y realice la transcripción in vitro como se describe en el manuscrito. Para verificar la integridad del sgRNA, eche un gel de bromuro de etidio Tris-Borato-EDTA al 1% de agarosa 0,5 microgramos por mililitro.
Coloque el gel solidificado en el tampón de ejecución Tris-Borate-EDTA. Mezcle una mezcla de sgRNA de microlitro y un tampón de carga de gel de ARN de microlitro. Cargue esta muestra en el gel y ejecute el gel a 100 voltios durante cinco minutos.
Visualiza las bandas usando luz ultravioleta. Configure cruces de tipo salvaje y cajas de apareamiento de pez cebra. Mantenga a los peces machos y hembras en el mismo tanque, pero sepárelos usando un divisor de caja de apareamiento, o como se muestra aquí, colocando a la hembra dentro de un inserto de puesta de huevos.
Después de ensamblar el cóctel de inyección, permita que el macho y la hembra se apareen quitando el divisor de la caja de apareamiento, o como se muestra aquí, colocando al macho en el mismo inserto de puesta de huevos que la hembra. Para sincronizar los embriones, recójalos después de 10 minutos con un colador de plástico y enjuáguelos en una placa de Petri con un medio 1XE3. Retire de 10 a 15 embriones y colóquelos en una placa de Petri separada para mantenerlos como controles no inyectados.
Transfiera los embriones restantes a los pozos de la placa de inyección. Inyecte una solución de proteína sgRNA de nanolitro, en el disco blasto en desarrollo de un embrión de una célula. Use fórceps para romper la punta de la aguja obstruida y recalibre la aguja para expulsar un bolo de un nanolitro.
Al día siguiente después de la inyección, recoja seis embriones sanos inyectados y dos embriones de control de la placa no inyectada. Coloque cada embrión individualmente en un solo pocillo de un tubo de tira de PCR y etiquete la parte superior de los tubos. Diseñe cebadores de detección únicos para cada sitio de guía para amplificar un fragmento de ADN emparejado de 100 a 110 bases que incluya el sitio objetivo de CRISPR-Cas9.
Si es posible, coloque el sitio de destino en el centro del fragmento amplificado, lo que permite la identificación de eliminaciones más grandes. Para cada uno de los cuatro sitios objetivo guía, configure ocho reacciones de PCR de 25 microlitros utilizando cinco microlitros del ADN embriógeno único preparado y 20 microlitros de la mezcla de PCR, y guíe la mezcla específica de cebadores de detección para identificar mutaciones somáticas en el sitio objetivo. Lanzar un gel Tris-Borate-EDTA de bromuro de etidio al 2,5%, 0,5 microgramos por mililitro utilizando peines que creen pocillos de aproximadamente 0,625 centímetros de ancho.
A continuación, coloque el gel solidificado en la cámara de electroforesis que contiene el tampón de funcionamiento Tris-Borato-EDTA. Agregue cinco microlitros de tinte de carga 6X al producto de PCR. Cargue 25 microlitros de esta mezcla en el gel, asegurándose de que las muestras inyectadas y de control estén funcionando en la misma fila de gel.
Después de cargar todas las muestras, agregue cinco microlitros de bromuro de etidio por litro de Tris-Borate-EDTA al extremo positivo de la caja de gel. Ejecute el gel a 120 voltios hasta que se resuelvan las prohibiciones de ADN o el ADN se haya acercado al final del carril. Para identificar los fenotipos de efecto materno y los embriones maternos de CRISPR, configure las hembras inyectadas F0 contra machos de tipo salvaje y controle los cruces de tipo salvaje en cajas de apareamiento estándar de peces cebra durante la tarde antes del experimento.
Coloque los peces macho y hembra en el mismo tanque, pero sepárelos con un divisor de caja de apareamiento, o coloque a la hembra dentro de un inserto de puesta de huevos. En la mañana del experimento, permita que el macho y la hembra comiencen a aparearse quitando el divisor de la caja de apareamiento o colocando al macho en el mismo inserto de puesta de huevos que la hembra. Recoja los embriones cada 10 minutos moviendo el inserto de puesta de huevos en un nuevo fondo del tanque de apareamiento que contenga agua fresca del sistema, y etiquete el tanque con una etiqueta que identifique a la hembra F0 individual.
Tome el tanque de apareamiento viejo y vierta el agua a través de un colador en T para recolectar los embriones de un embrague individual de 10 minutos. Bajo un microscopio de disección con una fuente de luz trascendente, observe los embriones en desarrollo cada hora, durante las primeras seis a ocho horas, y diariamente durante los próximos cinco días. Mover los embriones CRISPR maternos potenciales a una placa de Petri que contenga medios 1XE3, y analizar el fenotipo morfológico a las 24 horas posteriores a la fertilización, y la viabilidad, a los cinco días posteriores a la fertilización.
La tarde antes del experimento, establezca parejas de apareamiento de hembras F0 manteniendo a los machos de tipo salvaje físicamente separados de las hembras, usando un divisor de caja de apareamiento o colocando a la hembra en el inserto de puesta de huevos. En la mañana del experimento, retire la partición física para iniciar el apareamiento. A la primera señal de puesta de huevos, interrumpa la reproducción separando al macho y a las hembras F0, y mantenga a cada hembra F0 separada en cajas de apareamiento individuales.
Después de la fertilización in vitro, permita que los embriones haploides se desarrollen hasta que se observe el fenotipo CRISPR materno y coloque esos embriones en una placa de Petri diferente. Una vez que se hayan identificado los embriones haploides CRISPR maternos, permítales desarrollarse durante al menos seis horas después de la fertilización. Para extraer el ADN genómico de al menos 10 embriones haploides CRISPR maternos, coloque un solo embrión haploide en un pocillo individual de un tubo de tira de PCR, elimine el exceso de medios E3 del pozo y agregue 50 microlitros de hidróxido de sodio milimolar.
Incubar los embriones durante 20 minutos a 95 grados centígrados, y enfriarlos a cuatro grados centígrados. Luego agregue cinco microlitros de un molar de ácido Tris-clorhídrico con pH 7.5 y vórtice durante cinco a 10 segundos. Para identificar qué sitios guía contienen indeles, diseñe cebadores de secuenciación para amplificar un fragmento de ADN que incluya los cuatro sitios objetivo de CRISPR / Cas9.
Configure dos reacciones de PCR de 25 microlitros por embrión, utilizando cinco microlitros del ADN genómico preparado y los cebadores de secuenciación. Una vez finalizada la PCR, purificar y concentrar las dos muestras utilizando un kit concentrador y de limpieza de ADN, y someter el fragmento de ADN a la secuenciación de Sanger, utilizando los cebadores de secuenciación directa e inversa. Todos los ARN guía deben agruparse con regiones mínimas o nulas superpuestas entre los ARN guía durante la generación materna de CRISPR.
Si se crearon indeles, se debe observar un frotis en las muestras inyectadas en un gel de agarosa, pero no en el control no inyectado. El método materno CRISPR se puede utilizar para fenocopiar mutaciones conocidas del efecto materno, como abigarrado, tmi y aura. Para identificar las lesiones genéticas que contribuyen al fenotipo CRISPR materno, los espermatozoides tratados con UV y la fertilización in vitro se combinan para crear haploides CRISPR maternos.
La creación de un haploide permite la secuenciación de Sanger del alelo materno y la identificación de los indeles CRISPR maternos. Al identificar un fenotipo de efecto no materno, es esencial que pueda observarlo en múltiples mujeres F0, ya que aumenta las probabilidades de que el fenotipo sea causado por la pérdida de función, no por efectos fuera del objetivo o no específicos. Después de que se ha identificado un fenotipo de efecto materno, los embriones maternos CRISPR se pueden usar para examinar los efectos sobre diversos aspectos de la embriogénesis temprana, como el esqueleto sinusal o la segregación del ADN.
Esto permite a los investigadores comprender la causa molecular del fenotipo. Este método prueba directamente la función de genes desconocidos expresados por la madre en una sola generación, acelerando nuestra comprensión de los procesos, actuando durante la embriogénesis temprana.
