Este estudio proporciona un protocolo estándar para estudiar la diferenciación de las células Th17, un subconjunto de células T auxiliares que desempeñan un papel clave en las respuestas inmunitarias. A través de la transducción retroviral de ARN guía en células T primarias de ratones transgénicos Cas9, los científicos pueden estudiar la función particular de los genes en la regulación de la diferenciación Th17. Este estudio emplea la tecnología CRISPR-Cas9 para la edición precisa de genes y utiliza la transducción retroviral para dirigirse de manera eficiente a genes específicos en células T primarias.
La citometría de flujo se utiliza para evaluar la eficiencia de la transducción y monitorear la diferenciación celular. Las polarizaciones Th17 in vitro se llevan a cabo para estimular la diferenciación de las células CT4+T. Nuestra investigación tiene como objetivo llenar los vacíos en la comprensión de cómo genes específicos regulan la diferenciación Th17.
Estamos utilizando CRISPR-Cas9 junto con la transducción retroviral, que ofrece una alternativa más rápida y rentable a los modelos tradicionales de ratones knockout. Nuestro protocolo no solo detalla la transducción retroviral de las células T CD4, sino que también proporciona una guía completa sobre nuestro entrenamiento de secuencias de sgRNA y la construcción de plásmidos, que se pasa por alto en otros protocolos. Este artículo describe cada paso del proceso experimental, asegurando que otros investigadores puedan replicar fácilmente la metodología.
Para empezar, utilice la herramienta CRISPick para diseñar el ARN guía único para el knockout de ROR Gamma T. Establezca el genoma de referencia en Mouse GRCM 38 y especifique la secuencia PAM como NGG, según el sistema de guía CRISPRko. Introduzca el nombre del gen objetivo en el cuadro de búsqueda de la columna Búsqueda rápida de genes.
Verifique que el sistema muestre la identificación del gen correcta y el nombre completo del gen objetivo para garantizar una selección precisa. Elija un único ARN guía dirigido a la secuencia RORC en función del alto rango combinado y el orden de selección para minimizar las coincidencias fuera del objetivo y aumentar la eficacia en el objetivo. Seleccione la secuencia de ARN guía única no dirigida de las bibliotecas de Mouse Gecko V2.
Amplifique las secuencias codificantes RORC de guía única y las secuencias codificantes no objetivo de guía única utilizando ADN polimerasa en una PCR con cebadores diseñados para las regiones de secuencia vectorial y ARN guía única. Clone las secuencias amplificadas en el vector PMXU 6MCS, colocándolas entre el promotor U6 y el andamio de ARN guía en el marco con la proteína fluorescente mCherry. A continuación, configure un programa de PCR para la construcción de vectores.
Un día antes de la transfección, siembre aproximadamente ocho veces 10 a la potencia de seis células Plat-E en un plato de 10 centímetros que contiene DMEM suplementado con 10% de FBS, penicilina y estreptomicina. Incubar las células a 37 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono hasta que las células alcancen el 80% de confluencia. Una hora antes de la transfección, reemplace el medio de cultivo celular con ocho mililitros de medio sérico reducido tibio sin rojo fenol, que contenga 5% de FBS, pero sin penicilina ni estreptomicina.
Prepare la transfección Mix 1 y Mix 2. Gota a gota, agregue la Mezcla 2 a la Mezcla 1 y mezcle suavemente. Incubar la mezcla durante 15 a 20 minutos a 20 a 25 grados centígrados.
Mientras agita suavemente el plato, agregue la mezcla de transfección gota a gota a las celdas Plat-E. Incubar las células a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante seis a doce horas. Después de la incubación, reemplace el medio con 10 mililitros de medio de cultivo celular fresco y continúe incubando a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 48 horas.
Evaluar la eficiencia de la transfección en células Plat-E mediante la detección de la marca vectorial retroviral mediante microscopía de fluorescencia. A continuación, centrifugar el sobrenadante de cultivo que contiene el virus a 1.500 g durante 10 minutos para eliminar los fragmentos de células. Alícuota el sobrenadante que contiene el virus en viales de un mililitro.
Para comenzar, cubra cada pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos con dos microgramos por mililitro de Anti CD3 Epsilon y cuatro microgramos por mililitro de Anti CD28 en 500 microlitros de PBS. Envuelva la placa en Parafilm e incube a cuatro grados centígrados durante la noche. Después de recolectar el bazo de ratón, molierlo en tampón FACS usando vidrio molido esterilizado para homogeneizar el tejido en una suspensión de una sola célula.
Filtre la suspensión celular a través de un filtro de celdas de 70 micrómetros en un tubo de 50 mililitros. Gire la suspensión de células esplénicas a 800 g durante cinco minutos y vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos. Deje reposar la mezcla a temperatura ambiente durante cinco minutos.
A continuación, añada el tampón FACS para alcanzar un volumen total de 15 mililitros. Después de la centrifugación, vuelva a suspender los esplenocitos en tampón FACS y fíltrelos a través de un filtro celular de 40 micrómetros. Ajustar el volumen final a un mililitro con tampón FACS y aislar los linfocitos CD4+T utilizando kits de reactivos comerciales, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Etiquete las células T CD4+ con la mezcla de anticuerpos fluorescentes. Después de lavar las células teñidas con tampón FACS, aísle las células CD4+T vírgenes utilizando un clasificador de células de flujo. Ahora, después de quitar el sobrenadante de estimulación unido a la placa, enjuague cada pocillo de una placa de 24 pocillos dos veces con 500 microlitros de PBS.
Colocar una placa una vez 10 a la potencia de seis células T CD4+ vírgenes en un mililitro de medio de cultivo de linfocitos en cada pocillo e incubar durante 18 a 24 horas. Al día siguiente, recoja las células activadas en tubos de 1,5 mililitros y centrifugue a 800 g durante cinco minutos. Vuelva a suspender el pellet de células en un mililitro de la mezcla de infección y agregue un mililitro de la mezcla en los pocillos de una placa de 48 pocillos.
Envuelva la placa con Parafilm y centrifugue a 800 G durante 90 minutos a 32 grados centígrados, con la aceleración y la desaceleración establecidas en tres. Después de la centrifugación, retire el Parafilm e incube las células durante cuatro horas. Para preparar células presentadoras de antígenos, o APC, resuspenda los esplenocitos en un mililitro de medio de cultivo de linfocitos que contenga 50 microgramos por mililitro de mitomicina en un tubo de 15 mililitros.
Incubar los esplenocitos a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante una hora. A continuación, agregue PBS a la marca de 15 mililitros y centrifugue a 800 G durante cinco minutos. Vuelva a suspender los esplenocitos en un mililitro de medio de cultivo de linfocitos y cuente el número de células en una máquina contadora de células.
Después de la infección retroviral, centrifugar las células T CD4+ transducidas en tubos de 1,5 mililitros y resuspender las células infectadas en 600 microlitros de PBS. Coloque 0,5 veces 10 a la potencia de seis células T CD4+ transducidas en un mililitro de medio de cultivo de linfocitos con 1,5 veces 10 a la potencia de seis células APC en un pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Suplementar con dos microgramos por mililitro de Anti CD3 Epsilon, dos microgramos por mililitro de Anti CD28 y un cóctel de diferenciación Th17.
Cultive las células durante dos días a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Después de dos días, centrifugar la suspensión celular en tubos de 1,5 mililitros y resuspender el pellet en un mililitro de medio de cultivo de linfocitos que contenga tres nanogramos por mililitro de TGF Beta y 30 nanogramos por mililitro de interleucina 6. Transfiera las células a los pocillos de una placa de 24 pocillos durante dos días.
Trate las células diferenciadas con 50 nanogramos por mililitro de PMA, 500 nanogramos por mililitro de ionomicina y cinco microgramos por mililitro de brefelden A en 500 microlitros de medio de cultivo de linfocitos en un pocillo nuevo de una placa de 24 pocillos. Incubar las células a 37 grados centígrados durante cuatro horas. Recoja las células tratadas en tubos de 1,5 mililitros que contengan un mililitro de tampón FACS.
Después de la centrifugación, tiñe las células con PBS que contiene una mezcla de anticuerpos fluorescentes a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Lave las células teñidas con 300 microlitros de PBS antes de fijarlas con 300 microlitros de formaldehído tamponado con fosfato al 2% a cuatro grados centígrados durante 60 minutos. Después de lavar las células con PBS, resuspenderlas en 600 microlitros de tampón de permeabilización y centrifugar a 800 G durante cinco minutos.
Teñir las células con el anticuerpo anti-interleucina 17A en 100 microlitros de tampón de permeabilización durante 60 minutos a temperatura ambiente. La eficiencia de la infección retroviral, según lo indicado por las células mCherry positivas, fue de aproximadamente el 40%; la eficiencia de diferenciación de Th17 se redujo significativamente en las células tratadas con ARN guía única dirigida al gen ROR Gamma T. Los niveles de expresión de RORC e interleucina 17A disminuyeron sustancialmente en las células tratadas con ARN guía simple RORC.
