Name: in vitro assays to assess blood-brain barrier mesh-like vessel formation and disruption
Uploaded: 2017-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
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León Tai es financiado por la Universidad de Illinois Chicago fondos de puesta en marcha.

Todos los experimentos siguen los protocolos del Comité Institucional de Cuidado de Animales y Uso de la Universidad de Illinois, Chicago. 1. Preparación General NOTA: La línea celular endotelial microvascular del cerebro (hCMEC / D3) es una línea BEC humana inmortalizada extensamente caracterizada 14 , 15 , 16 , 18 , 19 . Cultivo de las células hCMEC / D3 en frascos de cultivo de tejidos recubiertos con colágeno tipo I (piel de ternero, dilución 1:20 de solución al 0,1% en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene Ca2 + y Mg2 + ) en basal Endothelial Growth Basal Medium (EBM-2) que contiene 2-5% de suero bovino fetal (FBS), 10% de ácido ascórbico, 10% de sulfato de gentamicina, 25% de hidrocortisona y 1/4 del volumen total de los suplementos de factor de crecimiento suministrados por 500 mL de medio [ Endotelio vascularFactor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) y factor de crecimiento fibroblástico básico humano (bFGF), véase Tabla de Materiales ]. NOTA: El medio EBM-2 con FBS y factores de crecimiento se conoce como &quot;EBM-2 completo&quot;. EBM-2 sin FBS y suplementos se conoce como &quot;EBM-2 basal&quot;. En la confluencia completa, las células hCMEC / D3 son ~ 1 x 10 ^ { 5} células / cm ^ { 2} . <ol><li> Pasar las células hCMEC / D3 a una relación de 1: 5 incubando primero con HBSS durante 3 min sin Ca2 + y Mg2 + seguido de separación con 5 mL de tripsina / EDTA (0,25%) durante 5 min. Neutralizar la tripsina usando EBM-2 completa (neutralización 1: 1), y centrifugar a 290 xg durante 5 min a 4 ° C; Desechar el sobrenadante. Resuspender el sedimento en EBM-2 completo y volver a planchar a razón de 1: 5. </li><li> Cultivo de los principales pericitos humanos y astrocitos según el protocolo del proveedor [ Tabla de Materiales ]. CulturE los pericitos en medio basal pericítico con FBS y suplemento de crecimiento pericítico. </li><li> Cultivar los astrocitos humanos en medio astrocito con factores de crecimiento de astrocitos. El cultivo tanto de los pericitos como de los astrocitos en matraces de cultivo de tejidos recubiertos con 3 ml de poli-L-lisina (PLL) para la adherencia celular y utilizan las células entre los pasos 2 y 5. </li><li> Euthanize 7 ratones y quitar los tallos del cerebro y el cerebelo con fórceps; Separar las meninges cuidadosamente rodando los cerebros en gasa. Picar el tejido cerebral restante en una placa de Petri en medio esencial mínimo (MEM) con HEPES (5 ml por cerebro) con una cuchilla de afeitar estéril. Aislar el ratón primario BEC de 2 meses de edad C57BL / 6J ratones de acuerdo con el protocolo de referencia 20 . </li><li> Transferir el tejido cerebral picada a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 290 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante e incubar el tejido en una papaína (833,33 μ l por cerebro) y DNasa (41,7 μ l por cerebro), En un baño de agua a 37 ° C durante 1 h, para digerir el tejido. </li><li> Triturar el homogeneizado secuencialmente a través de agujas de calibre 19 y 21, mezclar a una relación 1: 1 con una solución de 22% de albúmina de suero bovino (BSA), y centrifugar a 1360 xg durante 10 min a 4ºC. </li><li> Resuspender el sedimento resultante en 1 mL EBM-2 completo y centrifugar a 290 xg durante 5 min a 4 ° C. Resuspender nuevamente en 1 mL de EBM-2 completo y planchar las células (1 mL / pocillo) en placas de 6 pocillos recubiertas con colágeno (~ 1 cerebro por pocillo). </li><li> Sustituir el medio 24 h después con EBM-2 completo que contiene 4 μg / mL de clorhidrato de puromicina; Reemplazar con EBM-2 completo después de 2 días. Los BEC primarios se cultivan como para las células hCMEC / D3 y están en confluencia completa a 1 x 105 células / cm2. </li><li> Preparar un 100 μM de oAβ, 24 h antes del ensayo. NOTA: oAβ se considera la forma relevante para la enfermedad de A. Para el oAβ, utilice las preparaciones bien caracterizadas descritas por DahlgreN et al. 21 . </li><li> Descongele la solución madre de membrana basal durante la noche a 4 ° C y alícuota en tiras de tubo de PCR estériles (8 tubos) a 140 μL de membrana basal por tubo. Volver a congelar cada tira y almacenar a -20 ° C. Descongelar una tira por placa de 96 pocillos a 4 ° C, 24 h antes del ensayo. Pre-enfriar las puntas de la pipeta para evitar la solidificación. NOTA: Toda manipulación de la matriz de la membrana basal debe realizarse en hielo para evitar una rápida solidificación. Como 10 μL por pocillo de membrana basal se utiliza el día del ensayo, cada tira es suficiente para una placa de 96 pocillos. </li><li> Incubar BECs totalmente confluentes en EBM-2 basal, 24 h antes del ensayo. NOTA: La justificación es: EBM-2 completo contiene factores suplementados y FBS con el propósito de promover el crecimiento celular óptimo; Sin embargo, las mismas vías moleculares que promueven el crecimiento celular son también importantes para la cobertura y dinámica de células endoteliales cerebrales, tanto en presencia como en abseDe un factor de estrés. Por lo tanto, el suero y el suplemento privan a los CEB para reducir el efecto de confusión de la activación residual de las vías de señalización celular. De nota, las células se exponen brevemente (5 min) a FBS durante la neutralización de células tripsinizadas antes del ensayo. En contraste con los CEB, los pericitos y astrocitos no son sueros de hambre, debido a la necesidad de diferentes factores de crecimiento y la relativa inestabilidad de estos tipos de células en respuesta a la inanición de suero (Tai laboratorio, observaciones no publicadas). NOTA: La EBM-2 basal se utiliza durante el ensayo para ensayos de formación de malla de cultivo único y triple y de interrupción. Esto es crítico para prevenir la confusión del estrés o la señalización dependiente del tratamiento. </li></ol> 2. Ensayos de Formación y Disrupción similar a la malla <ol><li> Ensayos individuales de cultivo BEC: NOTA: En la Figura 1A se muestran tres paradigmas diferentes para los cultivos únicos de BEC </Fuerte Cada paradigma está diseñado para evaluar la respuesta de BECs en diferentes modelos de cobertura de buques. El paradigma 1 es la formación de malla. Este paradigma está diseñado para examinar los efectos de los factores de estrés y / o tratamientos sobre la angiogénesis y la formación de redes. BECs, oAβ, y los tratamientos se añaden a la placa en el punto de tiempo 0 h. Paradigm 2 es la prevención de la interrupción de la malla. Las células se plaquean en presencia de un factor de crecimiento o fármaco y se incuban durante 4 h para formar estructuras en forma de malla. En este caso, se a~nade un factor de estrés, oAβ, después de 4 h. Este paradigma evalúa la capacidad de un tratamiento para prevenir el daño inducido por el estrés en las estructuras similares a mallas preformadas. Paradigm 3 es el tratamiento simultáneo de la interrupción de la malla. Las células se sembraron y se dejó formar estructuras de tipo malla durante 4 h. A continuación, los tratamientos y oAβ se añaden simultáneamente en el punto de tiempo de 4 h, evaluando la capacidad de la red celular preformada para responder a diversos tratamientos. Todos los paradigmas paraPueden seguir pasos comunes similares, excepto con diferencias en el tiempo de adición del tratamiento. <ol><li> En el día del ensayo, pipetear la matriz de la membrana basal a 10 μl / pocillo en el fondo de placas de 96 pocillos y dejar reposar durante 1 h a 37 ° C. </li><li> Suspender el colorante de rastreo de células verdes liofilizado (ver Tabla de Materiales ) en 10 μL de DMSO para generar una solución madre 10 mM y diluir hasta 10 μM (1: 1000) en EBM-2 basal. Eliminar el medio del matraz completamente confluente y sustituir con EBM-2 basal que contiene el colorante de seguimiento de células verdes (5 ml para un matraz de 75 cm 2 ). Preload BECs con el colorante de seguimiento de células verdes, 20 min antes del inicio del ensayo. </li><li> Incubar las células durante 20-30 min a 37 ° C, eliminar el medio con el colorante de seguimiento de células, y separar las células como se describe en el paso 1.1. Neutralizar el medio con EBM-2 que contenga FBS al 10% y centrifugar a 240 xg durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el gránulo en 1 mL de EBM-2 basal. </li><li> Placa de los BECs en la placa de 96 pocillos a 10.000 células / pocillo en EBM-2 basal (0 h de tiempo en todos los paradigmas). NOTA: Dependiendo del paradigma que se esté utilizando, los tratamientos, factores de estrés o controles del vehículo se añaden en los puntos de tiempo especificados. En todos los paradigmas, el medio se recoge para su análisis posterior ( por ejemplo, análisis ELISA) y las células se fijan a las 24 horas con paraformaldehído 4% recién preparado en suero tamponado con fosfato (PBS). Como un enfoque alternativo para determinar el término efectos de oAβ en la formación de malla, el protocolo podría ser modificado para preincubar frascos de cultivo celular confluentes con oAβ, y luego realizar los paradigmas de formación de malla (+/- oAβ). NOTA: El volumen final en cada pozo para todos los paradigmas es de 70 μl. Todos los tratamientos (oAβ, EGF, etc. ) se añaden a sus pocillos respectivos a una dilución de 1:20, es decir, 3,5 μL por tratamiento. Para el Paradigma 1, las células se añaden en una solución de suspensión celular a 63 mu L / wana. Inmediatamente oAβ, los tratamientos deseados, y los controles se añaden a 3,5 μL / pocillo cada uno, dando un total de 70 μl. Para Paradigm 2, se añaden 63 μl de suspensión celular y 3,5 μl de tratamiento ( por ejemplo, 100 ng / ml de EGF) al instante de 0 h. Después de 4 h de incubación, se a~naden 3,5 μl de una reserva de oAβ ( por ejemplo, para 100 nM de concentración final de oAβ, 3,5 μl de 2 μM de material oAβ). Para Paradigm 3, se añaden 63 μl de suspensión celular al punto de tiempo 0 h ya las 4 h, se añaden oAβ y se añaden los tratamientos deseados a 3,5 μl / pocillo cada uno, dando un total de 70 μl. Estos volúmenes se pueden ajustar según los tratamientos. Por ejemplo, si sólo se requiere un tratamiento, el volumen de suspensión celular puede ajustarse a 66,5 μl (manteniendo 10.000 células / pocillo) y el volumen de tratamiento puede permanecer en 3,5 μl. </li></ol></li><li> Ensayo de cultivo triple: NOTA: Además de los ensayos de cultivo único de BECs, hemos desarrollado( Figura 1B ) para determinar la respuesta de BECs, pericitos y astrocitos dentro de las redes preformadas a factores de estrés relevantes ( por ejemplo, oAβ). Los BEC se sembraron en placas en presencia de los tratamientos deseados a 0 h. A las 4 h, los pericitos se añaden suavemente a la placa. A las 7 h, se añaden astrocitos a la placa, seguido por la adición de un factor de estrés a las 11 h. Las células se incuban a continuación hasta el punto de tiempo de 24 h. NOTA: Para los ensayos de cultivo triple, es importante considerar el tiempo para asegurar que todas las células son confluentes al mismo tiempo. Los astrocitos y pericitos humanos deben cultivarse 1 semana antes del ensayo, mientras que las células hCMEC / D3 necesitan ser colocadas o pasadas 4-5 días antes de la fecha del ensayo. Además, es importante utilizar células de paso bajo (2-5) primarias para evitar la deriva fenotípica. <ol><li> Añadir la solución de trabajo de colorante de seguimiento de células verdes a las células hCMEC / D3 20 min antes de iniciar el ensayo. Placa las células hCMEC / D3 a 10ºC, 000 células / pocillo en EBM-2 basal (punto de tiempo 0 h). Los volúmenes utilizados son 45 μL de suspensión celular y 3,5 μL de tratamiento ( es decir, concentraciones finales de EGF de 50 ng / ml, 100 ng / ml, o 1.000 ng / ml de las poblaciones que son 20 veces más concentradas). </li><li> Después de la incubación de 3,5 h a 37ºC, añadir la solución de trabajo de colorante de seguimiento de células azules (10 mu M de rastreador de células azul en EBM - 2 basal) a los pericitos primarios humanos. En el punto de tiempo de 4 h (~ 30 min de incubación con colorante de seguimiento de células), suavemente añadir 2.000 pericitos / pocillo a la placa que contiene el hCMEC / D3 en un volumen de 6 μ l / pozo. </li><li> Después de una incubación adicional de 2,5 h (total 6,5 h a partir de 0 h de tiempo), a~nadir a los astrocitos primarios humanos la solución de trabajo de colorante de seguimiento de células anaranjadas (naranja de 10 μM de células en naranja EBM-2 basal). En el punto de tiempo de 7 h, añadir suavemente 10.000 astrocitos / pocillo a la placa en volumen de 12 μL. Por lo tanto, la relación celular total para las células endoteliales: pericitos: astrocitos iS 5: 1: 5. Además, el volumen alcanzado hasta este punto es de 66,5 μl. </li><li> Añadir oAβ (3,5 μl de stock 100 μM) 4 h después (total 11 h desde 0 h de tiempo). </li><li> Fijar las células 13 h más tarde en 4% de paraformaldehído recién preparado en PBS. Precaución: Use guantes, guantes y gafas protectoras mientras manipula paraformaldehído. </li></ol></li></ol> 3. Cuantificación <ol><li> Captura las imágenes de fluorescencia del pozo entero de la placa de 96 pocillos a una ampliación de 1,6X con un tiempo de exposición de 2 s al 50% de potencia máxima usando un microscopio de disección. NOTA: Se pueden utilizar microscopios equivalentes; Sin embargo, es crítico capturar el pozo entero para el análisis comprensivo. </li><li> Para el análisis cuantitativo, procese las imágenes usando el complemento 22 del analizador de angiogénesis de ImageJ para cuantificar el número de ramas, el número de mallas y la longitud total de la célula (estas lecturas son tabuladas automáticamente por la softwaRe) como se describe a continuación. En la Figura 2 se proporciona un protocolo visual detallado de este paso. <ol><li> Abra fiji ImageJ haciendo clic en el icono del software. </li><li> Haga clic en las flechas de doble rojo hacia adelante ubicadas al final de la barra de herramientas, luego haga clic en &quot;Angiogenesis Analyzer&quot;. </li><li> Seleccione la carpeta con archivos de imagen, haga clic en &quot;Abrir&quot;. </li><li> Cuando aparezca el cuadro &quot;Configuración para el análisis&quot;, haga clic en &quot;Aceptar&quot;. </li><li> Cuando aparezca el cuadro &quot;Procesar imágenes&quot;, que indica el número de imágenes a procesar, haga clic en &quot;Aceptar&quot;. </li><li> Cuando aparezca la ventana &quot;ventana de progreso por lotes&quot;, que indica el tiempo de procesamiento estimado. Durante este tiempo, el programa cuantifica las salidas incluyendo el número de ramas, el número de mallas y la longitud total de la célula. NOTA: Una vez que todas las imágenes se cuantifican, el archivo de resultados aparecerá en la carpeta de imagen original como un documento de hoja de cálculo. </li><li> SeleccionarEl archivo de hoja de cálculo que contiene los resultados y comparar el número de ramas, mallas y la longitud total de la celda entre los grupos. NOTA: En el ensayo de cultivo triple ImageJ se utiliza además para analizar la cobertura y el número de pericitos / astrocitos. Las imágenes son marcadas por un experimentador ciego y la función &quot;analizar partículas&quot; utilizada para generar lecturas. Las células fijas y las estructuras similares a tubos pueden también inmunomarcarse para Aβ17 u otros marcadores. </li></ol></li></ol>

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+therapeutic+approach+for+senile+dementias:+neuroangiogenesis.">A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis.</a> J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).</li><li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Capillaries+in+the+Lesser+Ailments+of+Old+Age+and+in+Alzheimer's+Disease+and+Vascular+Dementia:+The+Potential+of+Pro-Therapeutic+Angiogenesis.">The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis.</a> J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos descritos pueden ser utilizados para abordar varias cuestiones biológicas fundamentales en torno a la cobertura cerebrovascular [ 24] . Específicamente, pueden identificar qué receptores y vías de señalización desempeñan un papel en la angiogénesis, la cobertura vascular en el tejido canceroso y las células endoteliales periféricas relevantes para el cerebro. Los ejemplos incluyen receptores del factor de crecimiento angiogénico, óxido nítrico, señalización de proteín...

<html> La barrera hematoencefálica (BBB) ​​de los capilares cerebrales es la mayor interfase de contacto entre sangre y desempeña un papel central en la homeostasis del sistema nervioso central (SNC) 1 , 2 . Los procesos dinámicos en el BBB evitan la absorción de moléculas no deseadas de la sangre, eliminan los productos residuales del SNC, suministran nutrientes esenciales y señalan moléculas al SNC, y modulan la neuroinflamación 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . El daño a la BBB es frecuente durante el envejecimiento y varios trastornos neurodegenerativos incluyendo la enfermedad de Alzheimer (EA), la esclerosis múltiple y el accidente cerebrovascular 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = &quot;xref&quot;&gt; 6. Por lo tanto, la disfunción de la BBB puede desempeñar un papel clave en los trastornos neurodegenerativos, incluso como objetivo terapéutico. Mantener la cobertura del buque es importante para las funciones homeostáticas de la BBB. Sin embargo, los datos in vivo e in vitro contradicen si los procesos implicados en trastornos neurodegenerativos causan una cobertura BBB más alta o más baja 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , particularmente en AD. Por lo tanto, existe una fuerte justificación para el desarrollo de modelos in vitro utilizando tipos de células relevantes para evaluar y comprender de manera más completa la dinámica de la cobertura BBB. Los capilares cerebrales están compuestos de astrocitos, pericitos y células endoteliales cerebrales (BEC) <sUp class = &quot;xref&quot;&gt; 3. Todos los tipos de células contribuyen a la función de la BBB a través del soporte estructural ya través de la secreción de moléculas efectoras tales como factores de crecimiento angiogénicos, citoquinas y quimiocinas que actúan en forma parácrina y autocrina. Sin embargo, las principales células efectoras de la BBB son BECs 3 . En general, las técnicas de cultivo celular para evaluar la función de BBB son ensayos de permeabilidad realizados en células crecidas en insertos de filtro, o la evaluación de niveles de proteínas BEC claves, después de la adición de factores de estrés 14 , 15 , 16 . Aunque son importantes, estos ensayos no se centran en la cobertura cerebrovascular. Aquí, nuestros métodos anteriores 17 se detallan para evaluar la cobertura de BEC y estructuras de malla-como utilizando culturas únicas de BEC humanos inmortalizados, cultivos únicos de BECs de ratón primario, y una triple cultura humanizadaModelo (BECs, astrocitos y pericitos) de la BBB. El objetivo era demostrar el efecto perjudicial de oAβ, que se considera un importante contribuyente a la progresión de AD, en la cobertura de BEC. El efecto protector del factor de crecimiento epidérmico (EGF) pone de relieve el potencial de la técnica como una herramienta de cribado terapéutico. La técnica tiene varias aplicaciones amplias para la investigación básica y aplicada, incluyendo: 1) delinear el papel de las vías específicas en la angiogénesis y la cobertura de los vasos, 2) evaluar los efectos de la enfermedad y los factores relacionados con el envejecimiento sobre la angiogénesis y la cobertura vascular; Objetivos.

<table><tbody><tr><td>hCMEC/D3 cells</td><td>Milipore</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 basal media</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type 1</td><td>ThermoFisher</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>5% FBS</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>10% Ascorbic acid</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>10% Gentamycin sulphate</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>25% Hydrocortisone</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin hydrochloride</td><td>VWR</td><td>80503-312</td><td></td></tr><tr><td>MEM-HEPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>12360-038</td><td></td></tr><tr><td>Papain cell dissociation system (papain and DNase1)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Human pericytes</td><td>Sciencell</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte basal media</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte growth supplement</td><td>Sciencell</td><td>1252</td><td></td></tr><tr><td>Human Astrocytes</td><td>Sciencell</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyte media</td><td>Sciencell</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyte growth supplement</td><td>Sciencell</td><td>1852</td><td></td></tr><tr><td>Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Angiogenesis m-plates (96-well)</td><td>ibidi</td><td>89646</td><td></td></tr><tr><td>Human Epidermal growth factor</td><td>Shenendoah Biotechnology</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker green</td><td>ThermoFisher</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker orange</td><td>ThermoFisher</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker blue</td><td>ThermoFisher</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>Poly-l-lysine</td><td>Sciencell</td><td>0403</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5012-60ML</td><td></td></tr><tr><td>C57BL mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>PCR tube strips</td><td>GeneMate</td><td>T-3014-2</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope</td><td>Zeiss</td><td>na</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro assays to assess blood-brain barrier mesh-like vessel formation and disruption

La cobertura de la barrera hematoencefálica (BBB) ​​desempeña un papel central en la homeostasis del sistema nervioso central (SNC). El BBB es mantenido dinámicamente por astrocitos, pericitos y células endoteliales cerebrales (CEC). Aquí se detallan métodos para evaluar la cobertura de BBB usando cultivos únicos de BECs humanos inmortalizados, cultivos únicos de BECs de ratón primario y un modelo de cultivo triple humanizado (BECs, astrocitos y pericitos) de la BBB. Para resaltar la aplicabilidad de los ensayos a estados de enfermedad, describimos el efecto de la amiloide oligomérica-β (oAβ), que es un contribuyente importante a la progresión de la enfermedad de Alzheimer (AD), en la cobertura de BBB. Además, utilizamos el factor de crecimiento epidérmico (EGF) para iluminar el potencial de detección de fármacos de las técnicas. Nuestros resultados muestran que los BECs cultivados individuales y triples forman estructuras tipo malla bajo condiciones basales y que oAβ altera esta formación de malla celular y degenera las estructuras de malla preformadas,Pero EGF bloquea esta interrupción. Por lo tanto, las técnicas descritas son importantes para diseccionar procesos fundamentales y relacionados con la enfermedad que modulan la cobertura de BBB.

En cultivos únicos, tanto las células hCMEC / D3 ( Figura 3A ) como las BECs primarias de ratón ( Figura 3B ) forman estructuras tipo malla en todo el pozo. Las estructuras se caracterizan por una red de nodos interconectados ( Figura 3 ). En todos los paradigmas descritos ( Figura 1 ), las estructuras tipo malla son similares después de 24 h en los grupos de contro...

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In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

El mantenimiento de la cobertura de la barrera hematoencefálica es clave para la homeostasis del sistema nervioso central. Este protocolo describe técnicas in vitro para delinear los procesos fundamentales y patológicos que modulan la cobertura de la barrera hematoencefálica.

Ensayos in vitro para evaluar la formación y la interrupción de los vasos sanguíneos de barrera hematoencefálica

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

in-vitro-assays-to-assess-blood-brain-barrier-mesh-like-vessel

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

8.4K vistas.  University of Illinois at Chicago.  El mantenimiento de la cobertura de la barrera hematoencefálica es clave para la homeostasis del sistema nervioso central. Este protocolo describe técnicas in vitro para delinear los procesos fundamentales y patológicos que modulan la cobertura de la barrera hematoencefálica. 

Video: In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of brain tumors, the molecular selectivity of BBB also shields the neoplastic cells by blocking the delivery of peripherally administered chemotherapies. The development of novel drugs (including nanoparticles) targeting malignant brain tumors ideally requires the use of preclinical animal models to study the drug&#8217;s transcytosis and antitumor efficacy. In order to comply with the 3R principle (refine, reduce, and replace) to reduce the number of laboratory animals in experimental setup and perform the high-throughput screening of a large library of antitumor agents, we developed a reproducible in vitro human and murine mimic of the blood-brain tumor-barrier (BBTB) using three-layered cultures of endothelial cells, astrocytes, and patient-derived glioblastoma spheres. For higher scalability and reproducibility, commercial cell lines or immortalized cells have been used in tailored conditions to allow the formation of a barrier resembling the actual BBB. Here we describe a protocol to obtain a BBTB mimic by culturing endothelial cells in contact with astrocytes at specific cell densities on inserts. This BBTB mimic can be used, for instance, for the quantification and confocal imaging of the nanoparticle passage through the endothelial and astrocytic barriers, in addition to the evaluation of the tumor cell targeting within the same assay. Moreover, we show that the obtained data can be used to predict the behavior of nanoparticles in preclinical animal models. In a broader perspective, this in vitro model could be adapted to other neurodegenerative diseases for the determination of the passage of new therapeutic molecules through the BBB and/or be supplemented with brain organoids to directly evaluate the efficacy of drugs.

Drug targeting to central nervous system tumors is a major challenge. Here we describe a protocol to produce an in vitro mimic of the blood-brain tumor-barrier using murine and/or human cells and discuss their relevance for the predictability of central nervous system tumor targeting in vivo.

Prediciendo en Vivo cargas entrega usando una Barrera Blood-brain Tumor en un plato

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Bioingeniería

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Establecimiento de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rata barrera hematoencefálica (BBB): Un Enfoque en la acreditación Impermeabilidad y transporte mediado por los receptores

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Medicina

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro mediante Espectroscopia de Impedancia: Un enfoque en la interacción de células T de la célula endotelial

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Inmunología e Infección

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro humano

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Un en Vivo Barrera Blood - brain permeabilidad ensayo en ratones usando fluorescencia etiquetada trazadores

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Neurociencias

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Mejor método para el establecimiento de un In Vitro Barrera Blood - Brain modelo basado en las células endoteliales de cerebro porcino

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Un modelo 3D de barrera hematoencefálica derivado de células madre pluripotentes humanas

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting the brain from pathogens. The inherent barrier properties of the BBB pose a challenge for therapeutic drug delivery into the CNS to treat neurological diseases. Impaired BBB function has been related to neurological disease. Cerebral amyloid angiopathy (CAA), the deposition of amyloid in the cerebral vasculature leading to a compromised BBB, is a co-morbidity in most cases of Alzheimer&#39;s disease (AD), suggesting that BBB dysfunction or breakdown may be involved in neurodegeneration. Due to limited access to human BBB tissue, the mechanisms that contribute to proper BBB function and BBB degeneration remain unknown. To address these limitations, we have developed a human pluripotent stem cell-derived BBB (iBBB) by incorporating endothelial cells, pericytes, and astrocytes in a 3D matrix. The iBBB self-assembles to recapitulate the anatomy and cellular interactions present in the BBB. Seeding iBBBs with amyloid captures key aspects of CAA. Additionally, the iBBB offers a flexible platform to modulate genetic and environmental factors implicated in cerebrovascular disease and neurodegeneration, to investigate how genetics and lifestyle affect disease risk. Finally, the iBBB can be used for drug screening and medicinal chemistry studies to optimize therapeutic&#160;delivery to the CNS. In this protocol, we describe the differentiation of the three types of cells (endothelial cells, pericytes, and astrocytes) arising from human pluripotent stem cells, how to assemble the differentiated cells into the iBBB, and how to model CAA in vitro using exogenous amyloid. This model overcomes the challenge of studying live human brain tissue with a system that has both biological fidelity and experimental flexibility, and enables the interrogation of the human BBB and its role in neurodegeneration.

Autor destacado: Un enfoque personalizado para investigar la enfermedad de Alzheimer utilizando un modelo de barrera hematoencefálica in vitro 

The blood-brain barrier (BBB) has a crucial role in sustaining a stable and healthy brain environment. BBB dysfunction is associated with many neurological diseases. We have developed a 3D, stem-cell-derived model of the BBB to investigate cerebrovascular pathology, BBB integrity, and how the BBB is altered by genetics and disease.

Reconstrucción de la barrera hematoencefálica in vitro para modelar y atacar terapéuticamente la enfermedad neurológica

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...

Ensayos in vitro para evaluar la formación y la interrupción de los vasos sanguíneos de barrera hematoencefálica

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Establecimiento de un

Un

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una

Un en Vivo Barrera Blood - brain permeabilidad ensayo en ratones usando fluorescencia etiquetada trazadores

Mejor método para el establecimiento de un In Vitro Barrera Blood - Brain modelo basado en las células endoteliales de cerebro porcino

Reconstrucción de la barrera hematoencefálica in vitro para modelar y atacar terapéuticamente la enfermedad neurológica

Reconstrucción de la barrera hematoencefálica in vitro para modelar y atacar terapéuticamente la enfermedad neurológica

Reconstrucción de la barrera hematoencefálica in vitro para modelar y atacar terapéuticamente la enfermedad neurológica