Name: in vitro assays to assess blood-brain barrier mesh-like vessel formation and disruption
Uploaded: 2017-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption at JoVE.com

Leon Tai é financiado por fundos de start-up da Universidade de Illinois Chicago.

Todas as experiências seguem os protocolos do Comitê de Consentimento Institucional de Animais e Instituições da Universidade de Illinois, Chicago. 1. Preparação geral NOTA: A linha de células endoteliais microvasculares do cérebro (hCMEC / D3) é uma linha BEC humana imortalizada amplamente caracterizada 14 , 15 , 16 , 18 , 19 . Cultive as células hCMEC / D3 em frascos de cultura de tecidos revestidos com colágeno tipo I (pele de bezerro, diluição 1:20 de solução a 0,1% na solução de sal equilibrada de Hank (HBSS) contendo Ca 2+ e Mg 2+ ) no meio basal de crescimento endotélial basal (EBM-2) contendo 2-5% de soro bovino fetal (FBS), 10% de ácido ascórbico, 10% de sulfato de gentamicina, 25% de hidrocortisona e 1/4 do volume total dos suplementos de fator de crescimento fornecidos por 500 mL de meio [ Endotélio vascular grO Factor Owth (VEGF), o fator de crescimento epidérmico (EGF), o fator de crescimento insulino-like 1 (IGF-1) eo fator de crescimento fibroblástico básico humano (bFGF), ver Tabela de Materiais ]. NOTA: O meio EBM-2 com FBS e fatores de crescimento é referido como &quot;EBM-2 completo&quot;. EBM-2 sem FBS e suplementos é referido como &quot;EBM-2 basal&quot;. Na confluência total, as células hCMEC / D3 são ~ 1 x 10 5 células / cm 2 . <ol><li> Passar as células hCMEC / D3 a uma proporção de 1: 5 pela primeira incubação com HBSS durante 3 min sem Ca 2+ e Mg 2+ seguido de desprendimento com 5 mL de tripsina / EDTA (0,25%) durante 5 min. Neutralize a tripsina utilizando EBM-2 completo (neutralização 1: 1) e centrifugue a 290 xg durante 5 minutos a 4 ° C; Descarte o sobrenadante. Ressuspender a pastilha em EBM-2 completa e re-chapa em proporção 1: 5. </li><li> Cultive os pericitos e astrócitos humanos primários de acordo com o protocolo do fornecedor [ Tabela de Materiais ]. CulturE os pericitos no meio basal pericyte com FBS e suplemento de crescimento pericítico. </li><li> Cultive os astrocitos humanos em meio de astrocito contendo fatores de crescimento de astrocitos. Cultive tanto os pericitos quanto os astrocitos em frascos de cultura de tecidos revestidos com 3 mL de poli-L-lisina (PLL) para a aderência celular e utilizem as células entre as passagens 2 e 5. </li><li> Eutanizar 7 camundongos e remover as hastes do cérebro e cerebella com fórceps; Desanexar as meninges com cuidado rolando o cérebro com gaze. Agite o tecido cerebral restante em uma placa de Petri em meio mínimo essencial (MEM) com HEPES (5 mL por cérebro) com uma lâmina de barbear estéril. Isolar os BEC de ratos primários de ratos C57BL / 6J de 2 meses de acordo com o protocolo 20 referenciado. </li><li> Transfira o tecido cerebral triturado para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar a 290 xg durante 5 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante e incube o tecido em uma papaína (833,33 μL por cérebro) e DNase (41,7 μL por cérebro)Solução, em banho-maria a 37 ° C durante 1 h, para digerir o tecido. </li><li> Triturar o homogeneizado sequencialmente através de agulhas de calibre 19 e 21, misturar a uma proporção de 1: 1 com uma solução de albumina de soro bovino (BSA) a 22% e centrifugar a 1360 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento resultante em 1 mL de EBM-2 completo e centrifugar a 290 xg durante 5 min a 4 ° C. Ressuspender novamente em 1 mL de EBM-2 completo e prender as células (1 mL / poço) em placas de 6 poços revestidas com colágeno (~ 1 cérebro por poço). </li><li> Substitua a mídia 24 h mais tarde por EBM-2 completo contendo 4 μg / mL de cloridrato de puromicina; Substitua com o EBM-2 completo após 2 dias. Os BEC primários são cultivados quanto às células hCMEC / D3 e estão em confluência total em 1 x 10 5 células / cm 2 . </li><li> Prepare um 100 μM de oAβ, 24 h antes do ensaio. NOTA: OAβ é considerado a forma relevante para a doença de A. Para oAβ, use as preparações bem caracterizadas descritas por DahlgreN et al. 21 . </li><li> Destilar a solução de reserva da membrana no solo durante a noite a 4 ° C e uma alíquota em tiras de tubo de PCR estéril (8 tubos) a 140 μL de membrana basal por tubo. Refonte cada tira e armazene a -20 ° C. Descongelar uma tira por placa de 96 poços a 4 ° C, 24 h antes do ensaio. Pré-esfrie as pontas da pipeta para evitar a solidificação. NOTA: Todo o tratamento da matriz da membrana basal deve ser realizado em gelo para evitar solidificação rápida. Como 10 μL por poço de membrana basal é usado no dia do ensaio, cada tira é suficiente para uma placa de 96 poços. </li><li> Incubar BEC totalmente confluentes em EBM-2 basal, 24 h antes do ensaio. NOTA: O raciocínio é: o EBM-2 completo contém fatores suplementados e FBS com o objetivo de promover o crescimento celular ótimo; No entanto, as mesmas vias moleculares que promovem o crescimento celular também são importantes para a cobertura e dinâmica das células endoteliais cerebrais, tanto na presença quanto no abseUm estressor. Portanto, soro e suplemento morrem de fome dos BECs para reduzir o efeito de confusão da ativação residual das vias de sinalização celular. De notar, as células são brevemente (5 min) expostas a FBS durante a neutralização de células tripsinizadas antes do ensaio. Em contraste com os BECs, os pericitos e astrócitos não são soro feridos, devido à exigência de diferentes fatores para o crescimento e a relativa instabilidade desses tipos de células em resposta à inanição de soro (laboratório de Tai, observações não publicadas). NOTA: O EBM-2 basal é utilizado durante o ensaio para os ensaios de formação e de interrupção da malha de cultura única e tripla. Isto é crítico para evitar a degradação do estressor ou sinalização dependente do tratamento. </li></ol> 2. Ensaios de Formação e Perturbação semelhantes a Meshwork <ol><li> Ensaios simples de cultura BEC: NOTA: Três paradigmas diferentes para culturas individuais de BECs são mostrados na Figura 1A </Forte&gt;. Cada paradigma é projetado para avaliar a resposta dos BEC em diferentes modelos de cobertura de embarcações. O paradigma 1 é a formação de malha. Este paradigma é projetado para examinar os efeitos de estressores e / ou tratamentos na angiogênese e formação de malha. BECs, oAβ e tratamentos são todos adicionados à placa no ponto horário de 0 h. Paradigma 2 é a prevenção da interrupção da malha. As células são plaqueadas na presença de um fator de crescimento ou fármaco e incubadas durante 4 h para formar estruturas tipo malha. Um estressor, oAβ neste caso, é adicionado após 4 h. Este paradigma avalia a capacidade de um tratamento para evitar danos induzidos pelo estressor a estruturas pré-formadas semelhantes a redes. Paradigma 3 é o tratamento simultâneo da interrupção da malha. As células são banhadas e permitidas formar estruturas tipo malha durante 4 h. Os tratamentos e oAβ são então adicionados simultaneamente no ponto de tempo de 4 h, avaliando a capacidade da rede celular pré-formada para responder a vários tratamentos. Todos os paradigmas paraEssas etapas comuns, exceto com diferenças no momento da adição do tratamento. <ol><li> No dia do ensaio, pipetar a matriz da membrana do porão a 10 μL / poço no fundo das placas de 96 poços e permitir que seja ajustado durante 1 h a 37 ° C. </li><li> Suspender o corante de rastreamento de células verdes liofilizado (ver Tabela de Materiais ) em 10 μL de DMSO para gerar uma solução de reserva de 10 mM e diluir para 10 μM (1: 1000) em EBM-2 basal. Remova a mídia do frasco totalmente confluente e substitua-a com base EBM-2 contendo o corante de rastreamento de células verdes (5 mL para um balão de 75 cm2). Preload BECs com o corante de rastreamento de células verdes, 20 min antes do início do ensaio. </li><li> Incube as células por 20-30 min a 37 ° C, remova o meio com corante de rastreamento celular e separe as células como descrito no Passo 1.1. Neutralize a mídia com EBM-2 contendo 10% de FBS e centrifugue a 240 xg durante 5 min a 4 ° C. Ressuspender o sedimento em 1 mL de EBM-2 basal. </li><li> Placa os BECs na placa de 96 poços em 10.000 células / poço em EBM-2 basal (0 h ponto de tempo em todos os paradigmas). NOTA: Dependendo do paradigma que está sendo utilizado, tratamentos, estressores ou controles do veículo são adicionados nos pontos de tempo especificados. Em todos os paradigmas, o meio é colhido para análise subsequente ( por exemplo, análise ELISA) e as células são fixadas às 24 h com paraformaldeído 4% recentemente preparado em Soro Tamponado de Fosfato (PBS). Como uma abordagem alternativa para determinar o termo efeitos de oAβ na formação de malha, o protocolo pode ser modificado para pré-incubar frascos de cultura de células confluentes com oAβ e, em seguida, realizar os paradigmas de formação de malha (+/- oAβ). NOTA: O volume final em cada poço para todos os paradigmas é de 70 μL. Todos os tratamentos (oAβ, EGF, etc. ) são adicionados aos respectivos poços com uma diluição de 1:20 ou seja, 3,5 μL por tratamento. Para o Paradigma 1, as células são adicionadas numa solução de suspensão celular a 63 μL / pEll. Imediatamente oAβ, tratamentos desejados e controles são adicionados a 3,5 μL / poço cada, dando um total de 70 μL. Para Paradigm 2, são adicionados 63 μL de suspensão celular e 3,5 μL de tratamento ( por exemplo, 100 ng / mL de EGF) no ponto de tempo de 0 h. Após 4 h de incubação, adicionam-se 3,5 μL de uma reserva de oAβ ( por exemplo, para uma concentração final de 100 μM de OAβ, 3,5 μL de 2 μM de reserva de OAβ). Para Paradigm 3, são adicionados 63 μL de suspensão celular no ponto de tempo de 0 h e às 4 h, oAβ e os tratamentos desejados são adicionados a 3,5 μL / poço cada, dando um total de 70 μL. Estes volumes podem ser ajustados de acordo com os tratamentos. Por exemplo, se apenas um tratamento for necessário, o volume da suspensão celular pode ser ajustado para 66,5 μL (mantendo 10 000 células / poço) e o volume do tratamento pode permanecer em 3,5 μL. </li></ol></li><li> Ensaio de cultura tripla: NOTA: Além dos ensaios de cultura única de BECs, desenvolvemosUm paradigma de ensaio de cultura tripla ( Figura 1B ) para determinar a resposta de BECs, pericítas e astrocitos em redes pré-formadas a estressores relevantes ( por exemplo, oAβ). Os BECs são chapeados na presença de tratamentos desejados às 0 h. Às 4 h, os pericitos são suavemente adicionados à placa. Às 7 h, os astrocitos são adicionados à placa, seguido da adição de um estressor às 11 h. As células são então incubadas até o ponto de tempo de 24 horas. NOTA: Para os ensaios de cultura tripla, é importante considerar o tempo para garantir que todas as células sejam confluentes ao mesmo tempo. Astrocitos e pericitos humanos devem ser cultivados 1 semana antes do ensaio, enquanto que as células hCMEC / D3 precisam ser banhadas ou passadas 4-5 dias antes da data do ensaio. Além disso, é importante usar células primárias de passagem baixa (2-5) para evitar deriva fenotípica. <ol><li> Adicione a solução de trabalho de corante de rastreamento de célula verde às células hCMEC / D3 20 min antes do início do ensaio. Placa as células hCMEC / D3 às 10, 000 células / poço em EBM-2 basal (ponto horário de 0 h). Os volumes utilizados são 45 μL de suspensão celular e 3,5 μL de tratamento ( ou seja, concentrações finais de EGF de 50 ng / mL, 100 ng / mL ou 1000 ng / mL de estoques 20 vezes mais concentrados). </li><li> Após a incubação de 3,5 h a 37 ° C, adicione a solução de trabalho de corante de rastreamento de células azuis (rastreador de células de 10 μM azul em EBM-2 basal) aos pericitos primários humanos. No ponto de tempo de 4 h (~ 30 min de incubação com corante de rastreamento celular), adicione suavemente 2,000 pericitos / poço à placa que contém o hCMEC / D3 num volume de 6 μL / poço. </li><li> Após uma incubação adicional de 2,5 h (total 6,5 h a partir do ponto de tempo de 0 h), adicione a solução de trabalho de corante de rastreamento de células de laranja (laranja de rastreador de células 10 μM em EBM-2 basal) aos astrócitos primários humanos. No ponto de tempo de 7 horas, adicione suavemente 10.000 astrocitos / bem à placa em 12 μL de volume. Portanto, a relação celular global para células endoteliais: pericítes: astrócitos iS 5: 1: 5. Além disso, o volume alcançado até este ponto é de 66,5 μL. </li><li> Adicione oAβ (3,5 μL de estoque de 100 μM) 4 h depois (total 11 h a partir do ponto de tempo de 0 h). </li><li> Corrija as células 13 h depois em paraformaldeído a 4% recentemente preparado em PBS. Cuidado: use roupas protetoras, luvas e óculos enquanto manipula paraformaldeído. </li></ol></li></ol> 3. Quantificação <ol><li> Capture imagens de fluorescência do poço inteiro da placa de 96 poços com uma ampliação de 1,6X com um tempo de exposição de 2 s com 50% de potência máxima usando um microscópio de dissecação. NOTA: Os microscópios equivalentes podem ser utilizados; No entanto, é fundamental capturar todo o poço para análise abrangente. </li><li> Para análise quantitativa, processe as imagens usando o plugin 22 do analisador de angiogênese ImageJ para quantificar o número de ramos, o número de malhas e o comprimento total da célula (essas leituras são tabuladas automaticamente pelo softwaRe) conforme descrito abaixo. Um protocolo visual detalhado desta etapa é fornecido na Figura 2 . <ol><li> Abra o fiji ImageJ clicando no ícone do software. </li><li> Clique nas duas setas diretas do lado direito localizadas no final da barra de ferramentas, depois clique em &quot;Angiogenesis Analyzer&quot;. </li><li> Selecione a pasta com arquivos de imagem, clique em &quot;Abrir&quot;. </li><li> Quando a caixa &quot;Configurações para análise&quot; aparecer, clique em &quot;OK&quot;. </li><li> Quando a caixa &quot;imagens de processamento&quot; for exibida, o que indica o número de imagens a serem processadas, clique em &quot;OK&quot;. </li><li> Quando aparece a caixa &quot;janela de progresso do lote&quot;, que indica o tempo de processamento estimado. Durante este tempo, o programa quantifica as saídas, incluindo o número de ramos, o número de malhas e o comprimento total da célula. NOTA: Uma vez que todas as imagens são quantificadas, o arquivo de resultados aparecerá na pasta de imagem original como um documento de planilha eletrônica. </li><li> SelecioneO arquivo da planilha contendo resultados e compare o número de ramos, malhas e o comprimento total da célula entre os grupos. NOTA: No ensaio de cultura tripla, o ImageJ é utilizado para analisar a cobertura e número de pericitos / astrocitos. As imagens são controladas por um experimentador cego e a função &quot;analisar partículas&quot; utilizada para gerar leituras. As células fixas e as estruturas semelhantes a tubos também podem ser imunossintérias para Aβ 17 ou outros marcadores. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+structure+and+function+and+the+challenges+for+CNS+drug+delivery.">Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery.</a> J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).</li><li>Engelhardt, B., Liebner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+the+development+and+maintenance+of+the+blood-brain+barrier.">Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier.</a> Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).</li><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).</li><li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+pathways+to+neurodegeneration+in+Alzheimer's+disease+and+other+disorders.">Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders.</a> Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).</li><li>Pardridge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+protein+and+gene+medicines+through+the+blood-brain+barrier.">Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier.</a> Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).</li><li>Tai, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+APOE+in+cerebrovascular+dysfunction.">The role of APOE in cerebrovascular dysfunction.</a> Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).</li><li>Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+triggers+extensive+cerebral+angiogenesis+causing+blood+brain+barrier+permeability+and+hypervascularity+in+Alzheimer's+disease.">Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer's disease.</a> PLoS One. 6 (8), e23789 (2011).</li><li>Cameron, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's-related+peptide+amyloid-beta+plays+a+conserved+role+in+angiogenesis.">Alzheimer's-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis.</a> PLoS One. 7 (7), e39598 (2012).</li><li>Boscolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+amyloid+angiogenic+activity+in+vitro+and+in+vivo.">Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo.</a> Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).</li><li>Paris, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+angiogenesis+in+a+transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloidosis.">Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis.</a> Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).</li><li>Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+beds+are+decreased+in+Alzheimer's+disease,+but+not+in+Binswanger's+disease.">Capillary beds are decreased in Alzheimer's disease, but not in Binswanger's disease.</a> Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).</li><li>Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Vascular+Perturbations+in+an+Abeta-Injected+Animal+Model+and+in+AD+Brain.">Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain.</a> Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280 (2011).</li><li>Donnini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta+peptides+accelerate+the+senescence+of+endothelial+cells+in+vitro+and+in+vivo,+impairing+angiogenesis.">Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis.</a> FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).</li><li>Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta-induced+occludin+down-regulation+and+increased+permeability+in+human+brain+endothelial+cells+is+mediated+by+MAPK+activation.">Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation.</a> J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).</li><li>Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-glycoprotein+and+breast+cancer+resistance+protein+restrict+apical-to-basolateral+permeability+of+human+brain+endothelium+to+amyloid-beta.">P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).</li><li>Tai, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+P-glycoprotein+expression+by+the+immortalised+human+brain+endothelial+cell+line,+hCMEC/D3,+restricts+apical-to-basolateral+permeability+to+rhodamine+123.">Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123.</a> Brain Res. 1292, 14-24 (2009).</li><li>Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+prevents+oligomeric+amyloid-beta+induced+angiogenesis+deficits+in+vitro.">Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).</li><li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hCMEC/D3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier.">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).</li><li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).</li><li>Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+brain+endothelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells.</a> Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).</li><li>Dahlgren, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomeric+and+fibrillar+species+of+amyloid-beta+peptides+differentially+affect+neuronal+viability.">Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability.</a> J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).</li><li>Carpentier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+Analyzer.">Angiogenesis Analyzer.</a> ImageJ News. , (2012).</li><li>Thomas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+prevents+APOE4+and+amyloid-beta-induced+cognitive+and+cerebrovascular+deficits+in+female+mice.">Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice.</a> Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111 (2016).</li><li>Tai, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+APOE+in+cerebrovascular+dysfunction.">The role of APOE in cerebrovascular dysfunction.</a> Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).</li><li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroangiogenesis:+a+vascular+basis+for+Alzheimer's+disease+and+cognitive+decline+during+aging.">Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer's disease and cognitive decline during aging.</a> J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).</li><li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+therapeutic+approach+for+senile+dementias:+neuroangiogenesis.">A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis.</a> J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).</li><li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Capillaries+in+the+Lesser+Ailments+of+Old+Age+and+in+Alzheimer's+Disease+and+Vascular+Dementia:+The+Potential+of+Pro-Therapeutic+Angiogenesis.">The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis.</a> J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os métodos descritos podem ser utilizados para abordar várias questões biológicas fundamentais em torno da cobertura cerebrovascular 24 . Especificamente, eles podem identificar quais receptores e vias de sinalização desempenham um papel na angiogênese, na cobertura vascular no tecido cancerígeno e nas células endoteliais periféricas relevantes para o cérebro. Exemplos incluem receptores de fator de crescimento angiogênico, óxido nítrico, sinalização de proteína quinase ativada p...

<html> A barreira hematoencefálica (BBB) ​​dos capilares cerebrais é a maior interface de contato de sangue para cérebro e desempenha um papel central na homeostase do sistema nervoso central (SNC) 1 , 2 . Os processos dinâmicos no BBB impedem a absorção de moléculas indesejadas do sangue, eliminam os resíduos do SNC, fornecem nutrientes essenciais e moléculas de sinalização ao SNC e modulam a neuroinflamação 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . O dano BBB é prevalente durante o envelhecimento e vários distúrbios neurodegenerativos, incluindo doença de Alzheimer (AD), esclerose múltipla e AVC 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = &quot;xref&quot;&gt; 6. Portanto, a disfunção BBB pode desempenhar um papel fundamental em distúrbios neurodegenerativos, inclusive como alvo terapêutico. Manter a cobertura do navio é importante para as funções homeostáticas da BBB. No entanto, os dados in vivo e in vitro conflitam se os processos envolvidos em distúrbios neurodegenerativos causam maior ou menor cobertura BBB 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , particularmente em AD. Portanto, há uma forte justificativa para o desenvolvimento de modelos in vitro usando tipos de células relevantes para avaliar e compreender de forma mais abrangente a dinâmica da cobertura BBB. Os capilares cerebrais são compostos de astrocitos, pericitos e células endoteliais do cérebro (BECs) <sUp class = &quot;xref&quot;&gt; 3. Todos os tipos de células contribuem para a função do BBB através do suporte estrutural e através da secreção de moléculas efectoras, como fatores de crescimento angiogênicos, citocinas e quimiocinas que atuam de forma paracrina e autocrina. No entanto, as principais células efetoras da BBB são BECs 3 . Em geral, as técnicas de cultura celular para avaliar a função BBB são os ensaios de permeabilidade realizados em células cultivadas em inserções de filtro, ou avaliar níveis de proteínas BEC chave, ambos após a adição de estressores 14 , 15 , 16 . Embora importantes, esses ensaios não se concentram na cobertura cerebrovascular. Aqui, nossos métodos anteriores 17 são detalhados para avaliar a cobertura de BEC e as estruturas semelhantes a redes, usando culturas únicas de BEC humanas imortalizadas, culturas únicas de BEC primários de mouse e uma cultura tripla humanizadaModelo (BECs, astrocitos e pericitos) do BBB. O objetivo foi demonstrar o efeito prejudicial da OAβ, que é considerado um contribuinte importante para a progressão do AD, na cobertura da BEC. O efeito protetor do fator de crescimento epidérmico (EGF) destaca o potencial da técnica como ferramenta de triagem terapêutica. A técnica tem várias aplicações amplas para pesquisa básica e aplicada, incluindo: 1) delineando o papel de caminhos específicos sobre angiogênese e cobertura de vasos, 2) avaliação dos efeitos da doença e fatores relevantes ao envelhecimento na angiogênese e cobertura vascular e 3) identificação de farmacologia Alvos.

<table><tbody><tr><td>hCMEC/D3 cells</td><td>Milipore</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 basal media</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type 1</td><td>ThermoFisher</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>5% FBS</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>10% Ascorbic acid</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>10% Gentamycin sulphate</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>25% Hydrocortisone</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin hydrochloride</td><td>VWR</td><td>80503-312</td><td></td></tr><tr><td>MEM-HEPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>12360-038</td><td></td></tr><tr><td>Papain cell dissociation system (papain and DNase1)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Human pericytes</td><td>Sciencell</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte basal media</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte growth supplement</td><td>Sciencell</td><td>1252</td><td></td></tr><tr><td>Human Astrocytes</td><td>Sciencell</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyte media</td><td>Sciencell</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyte growth supplement</td><td>Sciencell</td><td>1852</td><td></td></tr><tr><td>Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Angiogenesis m-plates (96-well)</td><td>ibidi</td><td>89646</td><td></td></tr><tr><td>Human Epidermal growth factor</td><td>Shenendoah Biotechnology</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker green</td><td>ThermoFisher</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker orange</td><td>ThermoFisher</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker blue</td><td>ThermoFisher</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>Poly-l-lysine</td><td>Sciencell</td><td>0403</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5012-60ML</td><td></td></tr><tr><td>C57BL mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>PCR tube strips</td><td>GeneMate</td><td>T-3014-2</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope</td><td>Zeiss</td><td>na</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro assays to assess blood-brain barrier mesh-like vessel formation and disruption

A cobertura da barreira hematoencefálica (BBB) ​​desempenha um papel central na homeostase do sistema nervoso central (SNC). O BBB é mantido dinamicamente por astrocitos, pericitos e células endoteliais cerebrais (BECs). Aqui, detalhamos métodos para avaliar a cobertura BBB usando culturas únicas de BEC humanas imortalizadas, culturas únicas de BEC de ratos primários e um modelo de cultura triplicada humanizado (BECs, astrocitos e pericitos) do BBB. Para destacar a aplicabilidade dos ensaios em estados de doença, descrevemos o efeito da amilóide-β (oAβ) oligomérica, que é um contribuinte importante para a progressão da doença de Alzheimer (AD), na cobertura de BBB. Além disso, utilizamos o fator de crescimento epidérmico (EGF) para iluminar o potencial de rastreamento de drogas das técnicas. Nossos resultados mostram que os BEC cultivados de um único e triplo formam estruturas semelhantes a malhas em condições basais, e que oAβ interrompe essa formação de malha celular e degenera as estruturas de malha pré-formadas,Mas EGF bloqueia essa interrupção. Assim, as técnicas descritas são importantes para a dissecação de processos fundamentais e relevantes para a doença que modulam a cobertura BBB.

Em culturas individuais, tanto as células hCMEC / D3 ( Figura 3A ) como os BEC primários do mouse ( Figura 3B ) formam estruturas semelhantes a redes em todo o poço. As estruturas são caracterizadas por uma malha de nós interligados ( Figura 3 ). Em todos os paradigmas descritos ( Figura 1 ), as estruturas semelhantes às malhas são semelhantes após 24 h nos grup...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption at JoVE.com

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

A manutenção da cobertura da barreira hematoencefálica é fundamental para a homeostase do sistema nervoso central. Este protocolo descreve técnicas in vitro para delinear os processos fundamentais e patológicos que modulam a cobertura da barreira hematoencefálica.

Ensaios In Vitro para Avaliar Formação e Perturbação de Embarque de Barreira de Sangue-Cérebro

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

in-vitro-assays-to-assess-blood-brain-barrier-mesh-like-vessel

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

8.4K visualizações.  University of Illinois at Chicago.  A manutenção da cobertura da barreira hematoencefálica é fundamental para a homeostase do sistema nervoso central. Este protocolo descreve técnicas in vitro para delinear os processos fundamentais e patológicos que modulam a cobertura da barreira hematoencefálica. 

Vídeo: In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of brain tumors, the molecular selectivity of BBB also shields the neoplastic cells by blocking the delivery of peripherally administered chemotherapies. The development of novel drugs (including nanoparticles) targeting malignant brain tumors ideally requires the use of preclinical animal models to study the drug&#8217;s transcytosis and antitumor efficacy. In order to comply with the 3R principle (refine, reduce, and replace) to reduce the number of laboratory animals in experimental setup and perform the high-throughput screening of a large library of antitumor agents, we developed a reproducible in vitro human and murine mimic of the blood-brain tumor-barrier (BBTB) using three-layered cultures of endothelial cells, astrocytes, and patient-derived glioblastoma spheres. For higher scalability and reproducibility, commercial cell lines or immortalized cells have been used in tailored conditions to allow the formation of a barrier resembling the actual BBB. Here we describe a protocol to obtain a BBTB mimic by culturing endothelial cells in contact with astrocytes at specific cell densities on inserts. This BBTB mimic can be used, for instance, for the quantification and confocal imaging of the nanoparticle passage through the endothelial and astrocytic barriers, in addition to the evaluation of the tumor cell targeting within the same assay. Moreover, we show that the obtained data can be used to predict the behavior of nanoparticles in preclinical animal models. In a broader perspective, this in vitro model could be adapted to other neurodegenerative diseases for the determination of the passage of new therapeutic molecules through the BBB and/or be supplemented with brain organoids to directly evaluate the efficacy of drugs.

Drug targeting to central nervous system tumors is a major challenge. Here we describe a protocol to produce an in vitro mimic of the blood-brain tumor-barrier using murine and/or human cells and discuss their relevance for the predictability of central nervous system tumor targeting in vivo.

Prever em cargas entrega Vivo usando uma Tumor-barreira sangue-cérebro em um prato

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

Pesquisa do câncer

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Bioengenharia

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Criação de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rato barreira hemato-encefálica (BBB): A Focus on BBB impermeabilidade e Transportes Receptor mediada

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Medicina

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da barreira sangue-cérebro que usa espectroscopia de impedância: Um foco na interação celular T Cell-endotelial

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Imunologia e Infecção

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Análise de Linfócitos extravasamento Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo do Sangue-Cérebro humano Barreira

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Neurociência

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Um modelo 3D de barreira hematoencefálica derivado de células-tronco pluripotentes humanas

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting the brain from pathogens. The inherent barrier properties of the BBB pose a challenge for therapeutic drug delivery into the CNS to treat neurological diseases. Impaired BBB function has been related to neurological disease. Cerebral amyloid angiopathy (CAA), the deposition of amyloid in the cerebral vasculature leading to a compromised BBB, is a co-morbidity in most cases of Alzheimer&#39;s disease (AD), suggesting that BBB dysfunction or breakdown may be involved in neurodegeneration. Due to limited access to human BBB tissue, the mechanisms that contribute to proper BBB function and BBB degeneration remain unknown. To address these limitations, we have developed a human pluripotent stem cell-derived BBB (iBBB) by incorporating endothelial cells, pericytes, and astrocytes in a 3D matrix. The iBBB self-assembles to recapitulate the anatomy and cellular interactions present in the BBB. Seeding iBBBs with amyloid captures key aspects of CAA. Additionally, the iBBB offers a flexible platform to modulate genetic and environmental factors implicated in cerebrovascular disease and neurodegeneration, to investigate how genetics and lifestyle affect disease risk. Finally, the iBBB can be used for drug screening and medicinal chemistry studies to optimize therapeutic&#160;delivery to the CNS. In this protocol, we describe the differentiation of the three types of cells (endothelial cells, pericytes, and astrocytes) arising from human pluripotent stem cells, how to assemble the differentiated cells into the iBBB, and how to model CAA in vitro using exogenous amyloid. This model overcomes the challenge of studying live human brain tissue with a system that has both biological fidelity and experimental flexibility, and enables the interrogation of the human BBB and its role in neurodegeneration.

Autor em destaque: uma abordagem personalizada para investigar a doença de Alzheimer usando um modelo de barreira hematoencefálica in vitro 

The blood-brain barrier (BBB) has a crucial role in sustaining a stable and healthy brain environment. BBB dysfunction is associated with many neurological diseases. We have developed a 3D, stem-cell-derived model of the BBB to investigate cerebrovascular pathology, BBB integrity, and how the BBB is altered by genetics and disease.

Reconstrução da Barreira Hematoencefálica In Vitro para Modelar e Combater Terapeuticamente a Doença Neurológica

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...

Ensaios In Vitro para Avaliar Formação e Perturbação de Embarque de Barreira de Sangue-Cérebro

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Prever em cargas entrega Vivo usando uma Tumor-barreira sangue-cérebro em um prato

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

Criação de um

A

Análise de Linfócitos extravasamento Usando um

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

Reconstrução da Barreira Hematoencefálica In Vitro para Modelar e Combater Terapeuticamente a Doença Neurológica

Reconstrução da Barreira Hematoencefálica In Vitro para Modelar e Combater Terapeuticamente a Doença Neurológica

Reconstrução da Barreira Hematoencefálica In Vitro para Modelar e Combater Terapeuticamente a Doença Neurológica