Name: in vitro assays to assess blood-brain barrier mesh-like vessel formation and disruption
Uploaded: 2017-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption at JoVE.com

Leon Tai Illinois Üniversitesi Chicago başlangıç ​​fonlarıyla finanse edilir.

Tüm deneyler Illinois Üniversitesi, Chicago Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi protokollerini takip etmektedir. 1. Genel Hazırlık NOT: Beyin mikrovasküler endotel hücresi hattı (hCMEC / D3), yoğun şekilde karakterize edilmiş, ölümsüzleştirilmiş insan BEC hattı 14 , 15 , 16 , 18 , 19&#39;dur . Bazal Endotel Büyümesi Bazal Ortamda, kolajen Tip I (buzağı derisi, Ca 2+ ve Mg 2+ içeren Hank&#39;in Dengeli Tuz Çözeltisinde (HBSS)% 0.1 çözeltinin 1:20 seyreltimi) ile kaplanmış doku kültürü şişeleri üzerinde hCMEC / D3 hücrelerini kültürleyin 500 mL medyaya göre% 2-5 Fetal Sığır Serumu (FBS),% 10 askorbik asit,% 10 gentamisin sülfat,% 25 hidrokortizon ve sağlanan büyüme faktörü takviyelerinin toplam hacminin ¼&#39;ünü içeren bir antikor (EBM-2) Vasküler endotelyum gr(VEGF), epidermal büyüme faktörü (EGF), insülin benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1) ve insan temel fibroblastik büyüme faktörü (bFGF), bakınız Malzeme Listesi]. NOT: EBM-2 orta FBS ve büyüme faktörleri olan &quot;EBM-2 komple&quot; olarak geçmektedir. FBS ve ek içermeyen EBM-2, &quot;EBM-2 bazal&quot; olarak anılır. Tam konfluans durumunda, hCMEC / D3 hücreleri ~ 1 x 105 hücre / cm2 &#39;dir. <ol><li> Önce 5 dakika süreyle 5 mL tripsin / EDTA (% 0.25) ile ayrıldıktan sonra Ca2 + ve Mg2 + olmaksızın 3 dakika boyunca HBSS ile inkübe ederek hCMEC / D3 hücrelerini 1: 5 oranında geçirin. Tripsini EBM-2 komple (1: 1 nötralizasyon) kullanarak nötralize edin ve 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 290 xg&#39;de santrifüjleyin; Süpernatanı atın. Peleti EBM-2&#39;de tekrar süspansiyon haline getirin ve 1: 5 oranında plakaya tekrar koyun. </li><li> Birincil insan perisitlerini ve astrositleri tedarikçinin protokolüne göre kültürleyin [ Malzeme Listesi ]. KültürE percyte bazal ortamda perisitler FBS ve perisit büyüme takviyesi ile. </li><li> Astrosit büyüme faktörleri içeren astrosit ortamında insan astrositlerini kültürleyin. Hücre yapışması için 3 mL poli-L-lisin (PLL) ile kaplı doku kültürü şişeleri içindeki perisitleri ve astrositler hem pasajlar 2 ve 5 arasındaki hücreleri kullanır. </li><li> 7 fare euthanize ve beyin sapları ve cerebella forseps ile çıkarın; Beynini dikkatlice gazlı bezle sallayarak çıkarın. Kalan beyin dokusunu, HEPES (beyin başına 5 mL) ile Minimal Esansiyel Ortamdaki (MEM) bir Petri kabında, steril traş bıçağı ile konsantre edin. Birinci fare BEC&#39;lerini, referans ağıdaki protokole göre 2 aylık C57BL / 6J farelerden ayırabilirsiniz 20 . </li><li> Kıyılmış beyin dokusunu 15 mL&#39;lik konik bir tüp içine aktarın. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 290 xg&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın ve dokuyu bir papain (her beyinde 833.33 μL) ve DNaz (beyin başına 41.7 μL) içinde kuluçkaya yatırın.Çözelti, 37 ° C&#39;lik bir su banyosunda 1 saat boyunca dokuyu sindirmek için. </li><li> Homojenat sırayla 19 ve 21 gauge iğneleri ile triturate,% 22 Bovine Serum Albumin (BSA) çözeltisi ile 1: 1 oranında karıştırın ve 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1360 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Nihai pelleti 1 mL EBM-2&#39;de tekrar süspanse edin ve 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 290 xg&#39;de santrifüjleyin. 1 mL EBM-2&#39;de tekrar süspansiyon haline getirin ve kollajen ile kaplanmış 6 oyuklu plakalarda (oyuk başına 1 beyin) hücreleri (1 mL / çukur) yerleştirin. </li><li> Ortamı 24 saat sonra, 4 μg / mL puromisin hidroklorür içeren EBM-2 komple ile değiştirin; 2 gün sonra EBM-2 ile tamamlayın. Birincil BEC&#39;ler hCMEC / D3 hücreleri için olduğu gibi kültürlenirler ve 1 x 105 hücre / cm2&#39;de tam birleşmiş durumdadırlar. </li><li> Testten 24 saat önce 100 uM oAp hazırlayın. NOT: oAβ, A&#39;nın hastalıkla ilişkili formu olarak düşünülür. OAβ için Dahlgre tarafından tanımlanan iyi karakterize edilmiş preparatları kullanınN ve ark. 21 . </li><li> Bazal membran stok solüsyonu gece boyunca 4 ° C&#39;de çözülür ve tüp başına 140 uL taban zarında steril PCR tüp şeritlerine (8 tüp) alikuotu yıkayın. Her bir şeridi tekrar -80 ° C&#39;de muhafaza edin. Deneyden 24 saat önce 4 ° C&#39;de 96 oyuklu plaka başına bir şerit çözülür. Katılaşmayı önlemek için pipet uçlarını önceden soğutun. NOT: Hızlı katılaşmayı önlemek için temel zarı matrisinin tümü buzda olmalıdır. Testin yapıldığı gün bazal zarın her bir kuyucuğunda 10 mcL kullanıldığından, her şerit bir 96 oyuklu plak için yeterlidir. </li><li> Tam uyumlu BEC&#39;leri, deneyden 24 saat önce EBM-2 bazalinde kuluçkalayın. NOT: Gerekçe şöyledir: EBM-2 komple, optimal hücre büyümesini teşvik etmek amacıyla desteklenmiş faktörler ve FBS içerir; Bununla birlikte, hücre büyümesini teşvik eden aynı moleküler yollar, beyin endotel hücre kapsamı ve dinamikleri için gerek var ve gerekse de önemlidirBir stresörün. Dolayısıyla serum ve ek, hücresel sinyal yolaklarının artık aktifleşmesinin karıştırıcı etkisini azaltmak için BEC&#39;leri aç kaldık. Not, hücreler, deneyden önce tripsinize edilmiş hücrelerin nötrleştirilmesi sırasında kısa bir süre (5 dakika) FBS&#39;ye maruz bırakılır. BEC&#39;lerin aksine, perisitler ve astrositler, büyüme için farklı faktörlerin ve serum açlığın- dan yanıt olarak bu hücre tiplerinin göreceli olarak kararsızlığı nedeniyle, serum aç kalmamış değildir (Tai laboratuarı, yayınlanmamış gözlemler). NOT: EBM-2 bazal, tek ve üçlü kültür ağı oluşumu ve parçalama deneyleri için deneme sırasında kullanılır. Bu, stres faktörünü karıştıran veya tedavi bağımlı sinyal vermeyi önlemek açısından kritik önem taşır. </li></ol> 2. Mesh-benzeri Oluşum ve Parçalanma Testleri <ol><li> Tek BEC kültürü tahlilleri: NOT: BEC&#39;lerin tek kültürleri için üç farklı paradigma Şekil 1A&#39;da gösterilmiştir </strong&gt;. Her paradigma, çeşitli gemi kapsama modellerinde BEC&#39;lerin tepkilerini değerlendirecek şekilde tasarlanmıştır. Paradigma 1 ağ oluşumudur. Bu paradigma, stresörlerin ve / veya tedavilerin anjiyogenez ve ağ oluşumu üzerindeki etkilerini incelemek üzere tasarlanmıştır. BEC&#39;ler, oAβ ve tedaviler plakaya 0 saat zaman noktasına eklenir. Paradigma 2, örgü parçalarının kesilmesini önlemektir. Hücreler, bir büyüme faktörü veya ilacın varlığında kaplanır ve ağ-yapı benzeri yapılar oluşturmak için 4 saat inkübe edilir. Bu durumda bir oAβ olan bir stres faktörü, 4 saat sonra eklenir. Bu paradigma, bir tedavinin, önceden oluşturulmuş ağ-yapıya benzer yapılara uygulanan stres kaynaklı hasarını önleme yeteneğini değerlendirir. Paradigma 3, ağ örgüsünün bozulmasının eş zamanlı olarak muamele edilmesidir. Hücreler kaplanır ve 4 saat ağ gözenekli yapılar oluşturmaya bırakılır. Ardından tedaviler ve oAβ, önceden oluşturulmuş hücre ağı ile çeşitli tedavilere cevap verme yeteneğini değerlendiren 4 saat zaman noktasında eşzamanlı olarak eklenir. Tüm paradigmalarTedavi ekleme zamanlamasındaki farklılıklar hariç, benzer genel adımları izleyin. <ol><li> Analizin yapıldığı gün, 96-çukurlukların tabanına 10 mcL / çukurdaki bazal membran matrisini pipetleyin ve 1 saat boyunca 37 ° C&#39;ye ayarlanmasına izin verin. </li><li> 10 mM&#39;lik bir stok çözeltisi üretmek için 10 μL DMSO içinde liyofilize yeşil hücre izleme boya ( Malzeme Tablosuna bakın) askıya alın ve EBM-2 bazal 10 uM (1: 1000) için inceltin. Ortamı tamamen bir araya getiren şişeden çıkarın ve yeşil hücre izleme boya içeren EBM-2 bazalıyla değiştirin (75 cm 2 lik bir şişe için 5 mL). Deneyin başlangıcından 20 dakika önce BEC&#39;leri yeşil hücre izleme renklendiricisiyle önceden yükleyin. </li><li> Hücreleri, 37 ° C&#39;de 20-30 dakika inkübe edin, hücre izleme boya maddesi ile ortamı alın ve Adım 1.1&#39;de açıklandığı gibi hücreleri ayırın. Ortamı% 10 FBS içeren EBM-2 ile nötralize edin ve 4 ° C&#39;de 5 dakika, 240 xg&#39;de santrifüjleyin. Pellet 1 mL EBM-2 bazal süspansiyon haline getirilir. </li><li> BEC&#39;leri 96 oyuklu plakada EBM-2 bazalında (tüm paradigmalarda 0 saat zaman noktası) 10,000 hücre / oyukla kaplayın. NOT: Kullanılan paradigmaya bağlı olarak, belirtilen zaman noktalarında tedaviler, stresörler veya araç kontrolleri eklenir. Tüm paradigmalarda, ortam sonraki analizler ( örn., ELISA analizi) için hasat edilir ve hücreler, fosfat tamponlu serumda (PBS) yeni hazırlanmış% 4 paraformaldehitle 24 saat sabitlenir. OAβ&#39;nın meş oluşumu üzerindeki etkilerini belirlemek için alternatif bir yaklaşım olarak, protokol OAp ile konfluent hücre kültürü şişelerini ön inkübe etmek için modifiye edilebilir ve daha sonra ağ örgüsü oluşum paradigmalarını (+/- oAβ) gerçekleştirmek üzere modifiye edilebilir. NOT: Bütün paradigmalar için her kuyunun son hacmi 70 mcL&#39;dir. Tüm tedaviler (oAβ, EGF, vb. ) Ilgili oyuklara 1:20 seyreltme, yani her muamele başına 3.5 mcL ilave edilir. Paradigma 1 için, hücreler 63 μL / w&#39;de bir hücre süspansiyonu çözeltisine eklenirell. Hemen oAp, arzu edilen tedaviler ve kontroller toplam 3.5 mcL / oyuk eklenerek toplam 70 mcL verilir. Paradigma 2 için, 0 saat zaman noktasında 63 μL hücre süspansiyonu ve 3.5 μL tedavi ( örn., 100 ng / mL EGF) eklenir. 4 saat inkübasyondan sonra 3.5 μL bir oAβ stoğu eklenir ( örn. , 100 nM son oAp konsantrasyonu, 3.5 uL 2 uM oAβ stoğu için). Paradigma 3 için 63 μL hücre süspansiyonu, 0 saat zaman noktasında eklenir ve 4 saat sonra, oAp ve istenen tedaviler, her biri 3.5 mcL / çukurda eklenir ve toplam 70 mcL verilir. Bu ciltler tedavilere göre ayarlanabilir. Örneğin, tek bir tedavi gerekiyorsa, hücre süspansiyonu hacmi 66.5 uL&#39;ye ayarlanıp (10,000 hücre / kuyuyu muhafaza eder) tedavi hacmi 3.5 uL&#39;de kalabilir. </li></ol></li><li> Üçlü kültür tahlili: NOT: BEC&#39;lerin tek kültür deneylerine ek olarak,Önceden oluşturulmuş şebekelerdeki BEC&#39;lerin, perisitlerin ve astrositlerin ilgili stresörlere ( örn., OAβ) yanıtını belirlemek için üçlü bir kültür analizi paradigması hazırladılar ( Şekil 1B ). BEC&#39;ler istenen tedavilerin varlığında 0 saat boyunca kaplanır. 4 saat sonra, perisitler nazikçe plakaya eklenir. 7 saat sonra, astrositler plakaya ilave edilir ve onu takiben 11 saate bir stres verici katılır. Hücreler daha sonra 24 saat zaman noktasına kadar inkübe edilir. NOT: Üçlü kültür deneyleri için, tüm hücrelerin aynı anda birleşeceğinden emin olmak için zamanlamanın değerlendirilmesi önemlidir. İnsanlardaki astrositler ve perisitler deneyden 1 hafta önce kültüre alınırken, hCMEC / D3 hücrelerinin deney tarihinden 4-5 gün önce plakalanması veya pasajlanması gerekir. Ayrıca, fenotipik sürüklenmeyi önlemek için düşük geçit (2-5) primer hücrelerin kullanılması önemlidir. <ol><li> Deney başlamadan 20 dakika önce hCMEC / D3 hücrelerine yeşil hücre izleme solüsyonu çözeltisi ekleyin. HCMEC / D3 hücrelerini 10, 000 hücre / çukur EBM-2 bazal (0 saat zaman noktası). Kullanılan hacimler 45 μL hücre süspansiyonu ve 3.5 μL muamele ( yani 20 kat daha yoğun olan stoklardan 50 ng / mL, 100 ng / mL veya 1000 ng / mL son EGF konsantrasyonları) şeklindedir. </li><li> 37 ° C&#39;de 3.5 saat inkübasyondan sonra insan primer perisitlerine mavi hücre izleme boya çalışma solüsyonunu (EBM-2 bazalda 10 uM hücre izci mavisi) ekleyin. 4 saatlik zaman noktasında (hücre izleme boya ile 30 dakika inkübasyon), hCMEC / D3&#39;ü içeren plakaya 6 mcL / çukur hacminde nazikçe 2.000 perissit / kuyu ekleyin. </li><li> İnsan primer astrositlerine ek 2.5 saat inkübasyon (0 saat zaman noktasından toplam 6.5 saat) takiben turuncu hücre izleme boya çalışma solüsyonunu (EBM-2 bazalda 10 uM hücre izci turuncu) ekleyin. 7 saatlik zaman noktasında, 12 mcL hacimdeki plakaya hafifçe 10.000 astrosit / kuyu ekleyin. Bu nedenle, endotel hücreleri için genel hücre oranı: perişitler: astrositler iS 5: 1: 5. Dahası, bu noktaya ulaşan hacim 66.5 uL&#39;dir. </li><li> 4 saat sonra oAβ (3.5 uL, 100 uM stok) ekleyin (0 saat zaman noktasından toplam 11 saat). </li><li> Hücreleri 13 saat sonra taze hazırlanmış% 4 paraformaldehid PBS içinde sabitleyin. Dikkat: paraformaldehidi tutarken koruyucu giysi, eldiven ve gözlük takın. </li></ol></li></ol> 3. Nicelleştirme <ol><li> Bir diseksiyon mikroskopu kullanarak% 50 maksimum güçle 2 saniyelik pozlama süresiyle 1.6 kat büyütmede 96 oyuklu plakanın tüm kuyusunun floresans görüntülerini yakalayın. NOT: Eşdeğer mikroskoplar kullanılabilir; Ancak, kapsamlı analiz için bütün kuyuyu yakalamak kritik önem taşır. </li><li> Kantitatif analiz için, şube sayısını, kafeslerin sayısını ve toplam hücre uzunluğunu ölçmek için ImageJ anjiyojenez analizörü eklentisi 22&#39;yi kullanarak görüntüleri işleyin (bu okumalar otomatik olarak softwa ile tablolaştırılırYeniden) aşağıda tarif edildiği gibi. Bu adımın ayrıntılı bir görsel protokolü Şekil 2&#39;de verilmektedir . <ol><li> Fiji ImageJ&#39;yi yazılım simgesini tıklayarak açın. </li><li> Araç çubuğunun ucundaki çift kırmızı öne oklara tıklayın, ardından &quot;Anjiyogenez Analiz Cihazı&quot; na tıklayın. </li><li> Resim dosyalarıyla klasörü seçin, &quot;Aç&quot; ı tıklayın. </li><li> &quot;Analiz için ayarlar&quot; kutusu göründüğünde, &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. </li><li> İşlenecek görüntü sayısını belirten &quot;görüntüleri işleme&quot; kutusu göründüğünde, &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> Tahmini işleme süresini gösteren &quot;toplu ilerleme penceresi&quot; kutusu göründüğünde. Bu süre zarfında program, dal sayısı, kafes sayısı ve toplam hücre uzunluğu gibi çıktıları nicelleştirir. NOT: Tüm görüntüler niceleyildikten sonra, sonuçlar dosyası orijinal resim klasöründe e-tablo belgesi olarak görünür. </li><li> seçmekSonuçları içeren elektronik tablo dosyası ve gruplar arasındaki dal sayısı, kafesler ve toplam hücre uzunluğu karşılaştırılır. NOT: Üçlü kültür deneyinde ImageJ, perisit / astrosit kapsamını ve sayısını analiz etmek için ayrıca kullanılmaktadır. Görüntüler körü kör bir deneyci tarafından sınırlanmış ve okunmaları oluşturmak için &quot;parçacıkları analiz&quot; işlevi kullanılmıştır. Sabit hücreler ve tüp benzeri yapılar ayrıca Aβ 17 veya diğer markerler için immüno-lekelendi. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+structure+and+function+and+the+challenges+for+CNS+drug+delivery.">Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery.</a> J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).</li><li>Engelhardt, B., Liebner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+the+development+and+maintenance+of+the+blood-brain+barrier.">Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier.</a> Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).</li><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).</li><li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+pathways+to+neurodegeneration+in+Alzheimer's+disease+and+other+disorders.">Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders.</a> Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).</li><li>Pardridge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+protein+and+gene+medicines+through+the+blood-brain+barrier.">Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier.</a> Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).</li><li>Tai, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+APOE+in+cerebrovascular+dysfunction.">The role of APOE in cerebrovascular dysfunction.</a> Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).</li><li>Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+triggers+extensive+cerebral+angiogenesis+causing+blood+brain+barrier+permeability+and+hypervascularity+in+Alzheimer's+disease.">Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer's disease.</a> PLoS One. 6 (8), e23789 (2011).</li><li>Cameron, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's-related+peptide+amyloid-beta+plays+a+conserved+role+in+angiogenesis.">Alzheimer's-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis.</a> PLoS One. 7 (7), e39598 (2012).</li><li>Boscolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+amyloid+angiogenic+activity+in+vitro+and+in+vivo.">Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo.</a> Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).</li><li>Paris, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+angiogenesis+in+a+transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloidosis.">Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis.</a> Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).</li><li>Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+beds+are+decreased+in+Alzheimer's+disease,+but+not+in+Binswanger's+disease.">Capillary beds are decreased in Alzheimer's disease, but not in Binswanger's disease.</a> Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).</li><li>Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Vascular+Perturbations+in+an+Abeta-Injected+Animal+Model+and+in+AD+Brain.">Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain.</a> Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280 (2011).</li><li>Donnini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta+peptides+accelerate+the+senescence+of+endothelial+cells+in+vitro+and+in+vivo,+impairing+angiogenesis.">Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis.</a> FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).</li><li>Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta-induced+occludin+down-regulation+and+increased+permeability+in+human+brain+endothelial+cells+is+mediated+by+MAPK+activation.">Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation.</a> J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).</li><li>Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-glycoprotein+and+breast+cancer+resistance+protein+restrict+apical-to-basolateral+permeability+of+human+brain+endothelium+to+amyloid-beta.">P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).</li><li>Tai, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+P-glycoprotein+expression+by+the+immortalised+human+brain+endothelial+cell+line,+hCMEC/D3,+restricts+apical-to-basolateral+permeability+to+rhodamine+123.">Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123.</a> Brain Res. 1292, 14-24 (2009).</li><li>Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+prevents+oligomeric+amyloid-beta+induced+angiogenesis+deficits+in+vitro.">Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).</li><li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hCMEC/D3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier.">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).</li><li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).</li><li>Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+brain+endothelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells.</a> Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).</li><li>Dahlgren, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomeric+and+fibrillar+species+of+amyloid-beta+peptides+differentially+affect+neuronal+viability.">Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability.</a> J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).</li><li>Carpentier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+Analyzer.">Angiogenesis Analyzer.</a> ImageJ News. , (2012).</li><li>Thomas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+prevents+APOE4+and+amyloid-beta-induced+cognitive+and+cerebrovascular+deficits+in+female+mice.">Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice.</a> Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111 (2016).</li><li>Tai, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+APOE+in+cerebrovascular+dysfunction.">The role of APOE in cerebrovascular dysfunction.</a> Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).</li><li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroangiogenesis:+a+vascular+basis+for+Alzheimer's+disease+and+cognitive+decline+during+aging.">Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer's disease and cognitive decline during aging.</a> J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).</li><li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+therapeutic+approach+for+senile+dementias:+neuroangiogenesis.">A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis.</a> J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).</li><li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Capillaries+in+the+Lesser+Ailments+of+Old+Age+and+in+Alzheimer's+Disease+and+Vascular+Dementia:+The+Potential+of+Pro-Therapeutic+Angiogenesis.">The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis.</a> J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Tarif edilen yöntemler, serebrovasküler kapsama alanı ile ilgili çeşitli temel biyolojik soruları çözmek için kullanılabilir 24 . Spesifik olarak hangi reseptörlerin ve sinyal yollarının anjiyogenez, kanser dokusunda gemi kapsama alanı ve beynin ilgili olduğu periferik endotel hücrelerinde rol oynadığını tespit edebilirler. Örnekler, anjiyojenik büyüme faktörü reseptörleri, nitrik oksit, mitojen aktive protein kinaz sinyali ve kalsiyum sinyali 25 ...

<html> Serebral kılcal damarların kan-beyin bariyeri (BBB), kan-beyin temasının en büyük arayüzüdür ve merkezi sinir sistemi (SSS) 1 , 2&#39;nin homeostazında merkezi bir rol oynar. BBB&#39;deki dinamik işlemler, istenmeyen moleküllerin kandan alınmasını önler, atık ürünleri MSS&#39;den uzaklaştırır, gerekli besin maddelerini ve CNS&#39;ye sinyal moleküllerini gönderir ve nöroinflamasyonu 1 , 2 , 3 , 4 , 5 modüle eder. Yaşlanma sırasında BBB hasarı ve Alzheimer hastalığı (AD), multipl skleroz ve inme 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ve 6&#39;yı içeren çeşitli nörodejeneratif bozukluklar görülür.Ass = &quot;xref&quot;&gt; 6. Bu nedenle, BBB disfonksiyonu terapötik bir hedef de dahil nörodejeneratif bozukluklarda önemli bir rol oynayabilir. Gemi kapsama alanının korunması BBB&#39;nin homeostatik işlevleri için önemlidir. Bununla birlikte, in vivo ve in vitro veriler, nörodejeneratif bozukluklardaki süreçlerin özellikle AD&#39;de 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 yüksek veya düşük BBB kapsama alanına sahip olup olmadığı konusunda çatışma oluşturmaktadır. Bu nedenle, BBB kapsama alanının dinamiklerini daha kapsamlı olarak anlamak ve değerlendirmek için ilgili hücre tiplerini kullanan in vitro modellerin geliştirilmesi için güçlü bir gerekçe vardır. Beyin kılcal damarları, astrositler, perisitler ve beyin endotel hücrelerinden (BEC&#39;ler) oluşur. <sUp class = &quot;xref&quot;&gt; 3. Tüm hücre tipleri yapısal destek vasıtasıyla ve parakrin ve otokrin benzeri modda hareket eden anjiyojenik büyüme faktörleri, sitokinler ve kemokinler gibi efektör moleküllerin salgılanması yoluyla BBB&#39;nin işlevine katkıda bulunur. Bununla birlikte, BBB&#39;nin efektör hücreleri BEC&#39;lerdir3. Genel olarak, BBB fonksiyonunu değerlendirmek için hücre kültürü teknikleri, hem stresörlerin 14 , 15 , 16 eklenmesinden sonra, filtre ekleri üzerinde büyütülen hücreler üzerinde gerçekleştirilen geçirgenlik testleri veya anahtar BEC proteinlerinin seviyelerini değerlendirmektir. Önemli olmasına rağmen, bu testler serebrovasküler kapsama odaklanmaz. Burada önceki yöntemlerimiz, ölümsüzleştirilen insan BEC&#39;lerinin tek kültürleri, birincil fare BEC&#39;lerin tek kültürleri ve bir hümanize üçlü kültür kullanılarak BEC kapsamı ve ağ-yapı benzeri yapıları değerlendirmek için ayrıntılı olarak verilmektedirModel (BEC&#39;ler, astrositler ve perisitler). Amaç, AD progresyonuna önemli katkıda bulunan oAβ&#39;nın zararlı etkisini BEC kapsamı üzerine göstermekti. Epidermal büyüme faktörünün (EGF) koruyucu etkisi, tekniğin terapötik bir tarama aracı olarak potansiyelini vurgular. Teknik, temel ve uygulamalı araştırmalar için çeşitli geniş uygulamalara sahiptir: 1) anjiyogenez ve gemi kapsama alanındaki spesifik yolların rolünün belirlenmesi, 2) hastalık ve yaşlanmayla ilişkili faktörlerin anjiyogenez ve gemi kapsama alanındaki etkilerinin değerlendirilmesi ve 3) farmakolojik hedefler.

<table><tbody><tr><td>hCMEC/D3 cells</td><td>Milipore</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 basal media</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type 1</td><td>ThermoFisher</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>5% FBS</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>10% Ascorbic acid</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>10% Gentamycin sulphate</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>25% Hydrocortisone</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin hydrochloride</td><td>VWR</td><td>80503-312</td><td></td></tr><tr><td>MEM-HEPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>12360-038</td><td></td></tr><tr><td>Papain cell dissociation system (papain and DNase1)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Human pericytes</td><td>Sciencell</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte basal media</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte growth supplement</td><td>Sciencell</td><td>1252</td><td></td></tr><tr><td>Human Astrocytes</td><td>Sciencell</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyte media</td><td>Sciencell</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyte growth supplement</td><td>Sciencell</td><td>1852</td><td></td></tr><tr><td>Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Angiogenesis m-plates (96-well)</td><td>ibidi</td><td>89646</td><td></td></tr><tr><td>Human Epidermal growth factor</td><td>Shenendoah Biotechnology</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker green</td><td>ThermoFisher</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker orange</td><td>ThermoFisher</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker blue</td><td>ThermoFisher</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>Poly-l-lysine</td><td>Sciencell</td><td>0403</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5012-60ML</td><td></td></tr><tr><td>C57BL mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>PCR tube strips</td><td>GeneMate</td><td>T-3014-2</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope</td><td>Zeiss</td><td>na</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro assays to assess blood-brain barrier mesh-like vessel formation and disruption

Kan-beyin bariyeri (BBB) ​​kapsama merkezi sinir sisteminin (CNS) homeostazında merkezi bir rol oynamaktadır. BBB, astrositler, perisitler ve beyin endotel hücreleri (BEC&#39;ler) tarafından dinamik olarak muhafaza edilir. Burada, ölümsüzleştirilmiş insan BEC&#39;lerinin tek kültürleri, birincil fare BEC&#39;lerin tek kültürleri ve BBB&#39;nin bir hümanize üçlü kültür modeli (BEC&#39;ler, astrositler ve perisitler) kullanarak BBB kapsama alanını değerlendirecek yöntemleri ayrıntılı olarak inceliyoruz. Tahlillerin hastalık durumlarına uygulanabilirliğini vurgulamak için, Alzheimer hastalığının (AD) ilerlemesine önemli katkıda bulunan oligomerik amiloid-β&#39;nın (oAβ) BBB kapsamı üzerindeki etkisini tanımlıyoruz. Ayrıca, tekniklerdeki ilaç tarama potansiyelini aydınlatmak için epidermal büyüme faktörünü (EGF) kullanıyoruz. Sonuçlarımız, tek ve üçlü kültürlenmiş BEC&#39;lerin temel koşullar altında ağ gibi yapılar oluşturduğunu ve oAβ&#39;nın bu hücre ağ oluşumunu bozar ve önceden oluşturulmuş örgü yapılarını dejenere ettiğini,Ancak EGF bu aksama engeller. Bundan dolayı, tarif edilen teknikler, BBB kapsama alanını modüle eden temel ve hastalığa bağlı süreçleri ayırmada önemlidir.

Tek kültürlerde hem hCMEC / D3 hücreleri ( Şekil 3A ) hem de birincil fare BEC&#39;ler ( Şekil 3B ), kuyu boyunca ağ örgüsü benzeri yapılar oluşturmaktadır. Yapılar, birbirine bağlı düğümlerin ağ tarafından karakterize edilmiştir ( Şekil 3 ). Açıklanan tüm paradigmalarda ( Şekil 1 ), ağ örgüsü benzeri yapılar kontrol gruplarında 24 saat s...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption at JoVE.com

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Kan-beyin bariyerinin korunması, merkezi sinir sisteminin homeostazı için kilit unsurdur. Bu protokol, kan-beyin bariyerinin kapsamını düzenleyen temel ve patolojik süreçleri tanımlamak için in vitro teknikleri tanımlamaktadır.

Kan-beyin Bariyeri Mesh Benzeri Gemi Oluşumu ve Kesintisini Değerlendiren İn Vitro Tahliller

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

in-vitro-assays-to-assess-blood-brain-barrier-mesh-like-vessel

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

8.4K Görüntüleme.  University of Illinois at Chicago.  Kan-beyin bariyerinin korunması, merkezi sinir sisteminin homeostazı için kilit unsurdur. Bu protokol, kan-beyin bariyerinin kapsamını düzenleyen temel ve patolojik süreçleri tanımlamak için in vitro teknikleri tanımlamaktadır. 

Video: In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of brain tumors, the molecular selectivity of BBB also shields the neoplastic cells by blocking the delivery of peripherally administered chemotherapies. The development of novel drugs (including nanoparticles) targeting malignant brain tumors ideally requires the use of preclinical animal models to study the drug&#8217;s transcytosis and antitumor efficacy. In order to comply with the 3R principle (refine, reduce, and replace) to reduce the number of laboratory animals in experimental setup and perform the high-throughput screening of a large library of antitumor agents, we developed a reproducible in vitro human and murine mimic of the blood-brain tumor-barrier (BBTB) using three-layered cultures of endothelial cells, astrocytes, and patient-derived glioblastoma spheres. For higher scalability and reproducibility, commercial cell lines or immortalized cells have been used in tailored conditions to allow the formation of a barrier resembling the actual BBB. Here we describe a protocol to obtain a BBTB mimic by culturing endothelial cells in contact with astrocytes at specific cell densities on inserts. This BBTB mimic can be used, for instance, for the quantification and confocal imaging of the nanoparticle passage through the endothelial and astrocytic barriers, in addition to the evaluation of the tumor cell targeting within the same assay. Moreover, we show that the obtained data can be used to predict the behavior of nanoparticles in preclinical animal models. In a broader perspective, this in vitro model could be adapted to other neurodegenerative diseases for the determination of the passage of new therapeutic molecules through the BBB and/or be supplemented with brain organoids to directly evaluate the efficacy of drugs.

Drug targeting to central nervous system tumors is a major challenge. Here we describe a protocol to produce an in vitro mimic of the blood-brain tumor-barrier using murine and/or human cells and discuss their relevance for the predictability of central nervous system tumor targeting in vivo.

Tahmin içinde Vivo Payloads bir kan-beyin tümör-engel bir tabak içinde kullanarak teslim

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

Kanser Araştırmaları

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Biyomühendislik

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Ayarlama-up bir<em&gt; In Vitro</emSıçan Kan-beyin bariyerinin&gt; Model (BBB): BBB geçirimsizliği ve Reseptör aracılı Ulaştırması Bir Odak

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Tıp

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Empedans Spektroskopisi kullanarak kan-beyin bariyerinin Model: T Hücre-endotelyal hücre Etkileşim Üzerine Bir Odak

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Vivo kan - beyin bariyerini geçirgenliği tahlil Fluorescently kullanarak farelerde izleyiciler etiketli

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Nörobilim

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Türetilen Bir 3D Kan-Beyin Bariyeri Modeli

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting the brain from pathogens. The inherent barrier properties of the BBB pose a challenge for therapeutic drug delivery into the CNS to treat neurological diseases. Impaired BBB function has been related to neurological disease. Cerebral amyloid angiopathy (CAA), the deposition of amyloid in the cerebral vasculature leading to a compromised BBB, is a co-morbidity in most cases of Alzheimer&#39;s disease (AD), suggesting that BBB dysfunction or breakdown may be involved in neurodegeneration. Due to limited access to human BBB tissue, the mechanisms that contribute to proper BBB function and BBB degeneration remain unknown. To address these limitations, we have developed a human pluripotent stem cell-derived BBB (iBBB) by incorporating endothelial cells, pericytes, and astrocytes in a 3D matrix. The iBBB self-assembles to recapitulate the anatomy and cellular interactions present in the BBB. Seeding iBBBs with amyloid captures key aspects of CAA. Additionally, the iBBB offers a flexible platform to modulate genetic and environmental factors implicated in cerebrovascular disease and neurodegeneration, to investigate how genetics and lifestyle affect disease risk. Finally, the iBBB can be used for drug screening and medicinal chemistry studies to optimize therapeutic&#160;delivery to the CNS. In this protocol, we describe the differentiation of the three types of cells (endothelial cells, pericytes, and astrocytes) arising from human pluripotent stem cells, how to assemble the differentiated cells into the iBBB, and how to model CAA in vitro using exogenous amyloid. This model overcomes the challenge of studying live human brain tissue with a system that has both biological fidelity and experimental flexibility, and enables the interrogation of the human BBB and its role in neurodegeneration.

Yazar Spotlight: In Vitro Kan-Beyin Bariyeri Modeli Kullanarak Alzheimer Hastalığını Araştırmaya Yönelik Kişiselleştirilmiş Bir Yaklaşım 

The blood-brain barrier (BBB) has a crucial role in sustaining a stable and healthy brain environment. BBB dysfunction is associated with many neurological diseases. We have developed a 3D, stem-cell-derived model of the BBB to investigate cerebrovascular pathology, BBB integrity, and how the BBB is altered by genetics and disease.

Nörolojik Hastalığı Modellemek ve Terapötik Olarak Hedeflemek için İn Vitro Kan-Beyin Bariyerinin Yeniden Yapılandırılması

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...

Kan-beyin Bariyeri Mesh Benzeri Gemi Oluşumu ve Kesintisini Değerlendiren İn Vitro Tahliller

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Tahmin içinde Vivo Payloads bir kan-beyin tümör-engel bir tabak içinde kullanarak teslim

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

Ayarlama-up bir

bir

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi

Vivo kan - beyin bariyerini geçirgenliği tahlil Fluorescently kullanarak farelerde izleyiciler etiketli

Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş

Nörolojik Hastalığı Modellemek ve Terapötik Olarak Hedeflemek için İn Vitro Kan-Beyin Bariyerinin Yeniden Yapılandırılması

Nörolojik Hastalığı Modellemek ve Terapötik Olarak Hedeflemek için İn Vitro Kan-Beyin Bariyerinin Yeniden Yapılandırılması

Nörolojik Hastalığı Modellemek ve Terapötik Olarak Hedeflemek için İn Vitro Kan-Beyin Bariyerinin Yeniden Yapılandırılması