Name: in vitro assays to assess blood-brain barrier mesh-like vessel formation and disruption
Uploaded: 2017-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
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Leon Tai wird von der University of Illinois Chicago Start-up-Fonds finanziert.

Alle Experimente folgen der University of Illinois, Chicago Institutional Animal Care und Use Committee Protokolle. 1. Allgemeine Vorbereitung HINWEIS: Die mikrovaskuläre Endothelzelllinie des Gehirns (hCMEC / D3) ist eine weitgehend charakterisierte immortalisierte menschliche BEC-Linie 14 , 15 , 16 , 18 , 19 . Kultur die hCMEC / D3-Zellen auf Gewebekulturkolben, die mit Kollagen beschichtet sind Typ I (Kalbshaut, 1:20 Verdünnung von 0,1% iger Lösung in Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) mit Ca 2+ und Mg 2+ ) im basalen Endothelwachstum Basal Medium (EBM-2), enthaltend 2-5% fötales Rinderserum (FBS), 10% Ascorbinsäure, 10% Gentamicinsulfat, 25% Hydrocortison und 1/4 des Gesamtvolumens der zugeführten Wachstumsfaktorergänzungen pro 500 ml Medium [ Vaskuläres Endothel gr(VFF), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) und menschlicher basischer fibroblastischer Wachstumsfaktor (bFGF), siehe Tabelle der Materialien ]. HINWEIS: EBM-2-Medium mit FBS und Wachstumsfaktoren wird als &quot;EBM-2 komplett&quot; bezeichnet. EBM-2 ohne FBS und Ergänzungen wird als &quot;EBM-2 basal&quot; bezeichnet. Bei voller Konfluenz sind die hCMEC / D3-Zellen ~ 1 x 10 5 Zellen / cm 2 . <ol><li> Durchführen der hCMEC / D3-Zellen im Verhältnis 1: 5 durch erstes Inkubieren mit HBSS für 3 min ohne Ca 2+ und Mg 2+, gefolgt von einer Ablösung mit 5 ml Trypsin / EDTA (0,25%) für 5 min. Neutralisieren des Trypsins mit EBM-2 vollständig (1: 1 Neutralisation) und zentrifugieren bei 290 xg für 5 min bei 4 ° C; Den Überstand verwerfen. Halten Sie das Pellet in EBM-2 vollständig und re-Platte im Verhältnis 1: 5. </li><li> Kultur die primären menschlichen Perizyten und Astrozyten nach dem Protokoll des Lieferanten [ Table of Materials ]. KulturE die pericytes in pericyte basal medium mit FBS und pericyte wachstum ergänzung. </li><li> Kultur die menschlichen Astrozyten in Astrozyten Medium mit Astrozyten Wachstumsfaktoren. Kultur sowohl die Perizyten als auch die Astrozyten in Gewebekulturkolben, die mit 3 ml Poly-L-lysin (PLL) für die Zelladhäsion beschichtet sind und die Zellen zwischen den Passagen 2 und 5 verwenden. </li><li> Euthanize 7 Mäuse und entfernen Sie die Hirnstämme und Cerebella mit Pinzette; Lösen Sie die Hirnhaut durch sorgfältiges Rollen der Gehirne auf Gaze. Hacken Sie das verbleibende Hirngewebe in einer Petrischale in Minimal Essential Medium (MEM) mit HEPES (5 ml pro Gehirn) mit einer sterilen Rasierklinge. Isoliere die primären Maus-BECs von 2 Monate alten C57BL / 6J-Mäusen gemäß dem referenzierten Protokoll 20 . </li><li> Übertragen Sie das Hackfleischgewebe auf ein 15 ml konisches Röhrchen. Zentrifugieren bei 290 xg für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und inkubieren Sie das Gewebe in einem Papain (833,33 μl pro Gehirn) und DNase (41,7 μl pro Gehirn)Lösung, in einem 37 ° C Wasserbad für 1 h, um das Gewebe zu verdauen. </li><li> Triturieren Sie das Homogenat nacheinander durch 19 und 21 Gauge-Nadeln, mischen im Verhältnis 1: 1 mit einer 22% igen Rinderserumalbumin (BSA) -Lösung und zentrifugieren bei 1360 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Das erhaltene Pellet in 1 mL EBM-2 vollständig resuspendieren und bei 290 xg für 5 min bei 4 ° C zentrifugieren. Wiederholen Sie erneut in 1 mL EBM-2 vollständig und tafeln Sie die Zellen (1 ml / Vertiefung) auf 6-Well-Platten, die mit Kollagen (~ 1 Gehirn pro Vertiefung) beschichtet sind. </li><li> Ersetzen Sie das Medium 24 h später mit EBM-2 komplett mit 4 μg / ml Puromycin-Hydrochlorid; Ersetzen Sie mit EBM-2 nach 2 Tagen. Die primären BECs werden wie für die hCMEC / D3-Zellen kultiviert und liegen bei 1 x 10 5 Zellen / cm 2 bei voller Konfluenz. </li><li> Vorbereitung eines 100 &amp; mgr; M oAβ, 24 h vor dem Assay. HINWEIS: oAβ gilt als krankheitsrelevante Form von A. Für oAβ verwenden Sie die gut charakterisierten Präparate, die von Dahlgre beschrieben werdenN et al. 21 </li><li> Die Basalmembran-Stammlösung über Nacht bei 4 ° C auftauen und in sterile PCR-Röhrchenstreifen (8 Röhrchen) bei 140 μl Basalmembran pro Röhrchen aliquotieren. Jedes Streifen einfrieren und bei -20 ° C aufbewahren. Tauen Sie einen Streifen pro 96-Well-Platte bei 4 ° C, 24 h vor dem Assay. Vorbereitung der Pipettenspitzen, um Verfestigung zu vermeiden. HINWEIS: Die gesamte Handhabung der Basalmembranmatrix muss auf Eis durchgeführt werden, um eine schnelle Erstarrung zu vermeiden. Da am Tag des Assays 10 &amp; mgr; l pro Vertiefung der Basalmembran verwendet wird, reicht jeder Streifen für eine 96-Well-Platte aus. </li><li> Inkubieren Sie vollständig konfluierende BECs in EBM-2 basal, 24 h vor dem Assay. HINWEIS: Die Begründung lautet: EBM-2 komplett enthält ergänzende Faktoren und FBS mit dem Ziel, ein optimales Zellwachstum zu fördern; Allerdings sind die gleichen molekularen Wege, die das Zellwachstum fördern, auch für die Hirn-Endothelzellen-Abdeckung und -Dynamik wichtig, sowohl in der Gegenwart als auch in der AbseNce eines Stressors. Wir also Serum und Ergänzung verhungern die BECs, um die verstörende Wirkung der Restaktivierung von zellulären Signalwegen zu reduzieren. Bemerkenswert ist, dass die Zellen kurz (5 min) FBS während der Neutralisation von trypsinisierten Zellen vor dem Assay ausgesetzt sind. Im Gegensatz zu den BECs sind die Perizyten und Astrozyten aufgrund des Erfordernisses verschiedener Wachstumsfaktoren und der relativen Instabilität dieser Zelltypen als Reaktion auf Serumverhungern (Tai-Laboratorium, unveröffentlichte Beobachtungen) nicht serumverhungert. ANMERKUNG: EBM-2 basal wird während des Assays für die Einzel- und Triple-Kultur-Meshwork-Bildung und Disruption Assays verwendet. Dies ist entscheidend, um eine verstörende Stress- oder behandlungsabhängige Signalisierung zu verhindern. </li></ol> 2. Meshwork-ähnliche Formations- und Disruptions-Assays <ol><li> Einzelne BEC-Kultur-Assays: ANMERKUNG: Drei verschiedene Paradigmen für die einzelnen Kulturen von BECs sind in Abbildung 1A dargestellt </Stark&gt;. Jedes Paradigma soll die Reaktion von BECs in verschiedenen Modellen der Schiffsdeckung abschätzen. Paradigma 1 ist Meshwork-Bildung. Dieses Paradigma dient der Untersuchung der Auswirkungen von Stressoren und / oder Behandlungen auf die Angiogenese und die Maschenbildung. BECs, oAβ und Behandlungen werden alle der Platte zum 0-h-Zeitpunkt hinzugefügt. Paradigma 2 ist die Vermeidung von Meshwork-Störungen. Die Zellen werden in Gegenwart eines Wachstumsfaktors oder Arzneimittels plattiert und für 4 h inkubiert, um maschenartige Strukturen zu bilden. Ein Stressor, oAβ wird in diesem Fall nach 4 h zugegeben. Dieses Paradigma beurteilt die Fähigkeit einer Behandlung, Stress-induzierte Schäden an vorgeformten meshwork-ähnlichen Strukturen zu verhindern. Paradigma 3 ist gleichzeitige Behandlung von Meshwork-Störungen. Die Zellen sind plattiert und können für 4 h maschenartige Strukturen bilden. Behandlungen und oAβ werden dann gleichzeitig zum 4-stündigen Zeitpunkt zugegeben, wobei die Fähigkeit des vorgeformten Zellnetzes, auf verschiedene Behandlungen zu reagieren, bewertet wird. Alle Paradigmen fürLlow ähnliche gemeinsame Schritte, außer mit Unterschiede in der Zeit der Behandlung zusätzlich. <ol><li> Am Tag des Assays pipettieren Sie die Basalmembranmatrix mit 10 μl / well in den Boden der 96-Well-Platten und lassen Sie sie 1 h bei 37 ° C einstellen. </li><li> Suspendieren Sie den lyophilisierten Grünzell-Tracking-Farbstoff (siehe Tabelle der Materialien ) in 10 &amp; mgr; l DMSO, um eine 10-mM-Stammlösung zu erzeugen, und verdünnen Sie auf 10 &amp; mgr; M (1: 1000) in EBM-2 basal. Entfernen Sie das Medium aus dem vollständig konfluierenden Kolben und ersetzen Sie es mit EBM-2 basal, das den Grünzelle-Tracking-Farbstoff enthält (5 ml für einen 75 cm 2- Kolben). Voreinstellung BECs mit dem grünen Zell-Tracking-Farbstoff, 20 Minuten vor dem Beginn des Assays. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen für 20-30 min bei 37 ° C, entfernen Sie das Medium mit Zellverfolgungsfarbstoff und trennen Sie die Zellen wie in Schritt 1.1 beschrieben. Neutralisieren des Mediums mit EBM-2 mit 10% FBS und Zentrifugieren bei 240 xg für 5 min bei 4 ° C. Das Pellet in 1 ml EBM-2 basal resuspendieren. </li><li> Die BECs in der 96-Well-Platte auf 10.000 Zellen / Well in EBM-2 basal (0 h Zeitpunkt in allen Paradigmen) plattieren. HINWEIS: Je nach verwendetem Paradigma werden Behandlungen, Stressoren oder Fahrzeugkontrollen zu den angegebenen Zeitpunkten hinzugefügt. In allen Paradigmen wird das Medium für die anschließende Analyse geerntet ( zB ELISA-Analyse) und die Zellen werden mit frisch hergestelltem 4% Paraformaldehyd in Phosphat-gepufftem Serum (PBS) um 24 h fixiert. Als alternativer Ansatz zur Bestimmung der Termeffekte von oAβ bei der Maschenbildung konnte das Protokoll modifiziert werden, um konfluierende Zellkulturkolben mit oAβ vorinkubieren zu können und dann die Maschenbildungsparadigmen (+/- oAβ) durchzuführen. HINWEIS: Das endgültige Volumen in jeder Vertiefung für alle Paradigmen beträgt 70 μl. Alle Behandlungen (oAβ, EGF, etc. ) werden zu ihren jeweiligen Vertiefungen bei einer 1: 20-Verdünnung, dh 3,5 &amp; mgr; l pro Behandlung, zugegeben. Für das Paradigma 1 werden die Zellen in einer Zellsuspensionslösung mit 63 &amp; mgr; l / w zugegebenEll Unmittelbar oAβ werden gewünschte Behandlungen und Kontrollen bei jeweils 3,5 &amp; mgr; l / Vertiefung zugegeben, was insgesamt 70 &amp; mgr; l ergibt. Für das Paradigma 2 werden 63 μl Zellsuspension und 3,5 μl Behandlung ( zB 100 ng / mL EGF) zum 0 h-Zeitpunkt zugegeben. Nach 4 h Inkubation werden 3,5 &amp; mgr; l eines oA &amp; bgr; -Standes zugegeben ( z. B. für 100 nM endgültige oAβ-Konzentration, 3,5 &amp; mgr; l 2 &amp; mgr; M oAβ-Stamm). Für das Paradigma 3 werden 63 &amp; mgr; l Zellsuspension zum 0 h-Zeitpunkt und bei 4 h zugegeben, wobei oAβ und die gewünschten Behandlungen mit jeweils 3,5 &amp; mgr; l / Vertiefung zugegeben werden, was insgesamt 70 &amp; mgr; l ergibt. Diese Bände können nach Behandlungen angepasst werden. Wenn beispielsweise nur eine Behandlung erforderlich ist, kann das Zellsuspensionsvolumen auf 66,5 &amp; mgr; l eingestellt werden (wobei 10 000 Zellen / Vertiefung aufrechterhalten werden) und das Behandlungsvolumen bei 3,5 &amp; mgr; l bleiben kann. </li></ol></li><li> Triple-Kultur-Assay: HINWEIS: Neben den einzelnen Kulturassays von BECs entwickeln wir uns( 1B ), um die Reaktion von BECs, Perizyten und Astrozyten in vorgeformten Netzwerken auf relevante Stressoren ( zB oAβ) zu bestimmen. BECs werden in Gegenwart von gewünschten Behandlungen bei 0 h plattiert. Nach 4 h werden Perizyten der Platte vorsichtig zugesetzt. Nach 7 h werden Astrozyten der Platte zugesetzt, gefolgt von der Zugabe eines Stressors bei 11 h. Die Zellen werden dann bis zum 24-Stunden-Zeitpunkt inkubiert. ANMERKUNG: Für die Triple-Kultur-Assays ist es wichtig, das Timing zu berücksichtigen, um sicherzustellen, dass alle Zellen gleichzeitig zusammenlaufen. Menschliche Astrozyten und Perizyten sollten 1 Woche vor dem Assay kultiviert werden, während die hCMEC / D3-Zellen 4-5 Tage vor dem Testdatum plattiert oder passagiert werden müssen. Weiterhin ist es wichtig, primäre Zellen mit niedrigem Durchgang (2-5) zu verwenden, um eine phänotypische Drift zu vermeiden. <ol><li> Fügen Sie die grüne Zell-Tracking-Farbstoff-Arbeitslösung zu den hCMEC / D3-Zellen 20 min vor dem Beginn des Assays hinzu. Plate die hCMEC / D3 Zellen bei 10, 000 Zellen / Brunnen in EBM-2 basal (0 h Zeitpunkt). Bei den verwendeten Volumina handelt es sich um 45 μl Zellsuspension und 3,5 μl Behandlung ( dh endgültige EGF-Konzentrationen von 50 ng / mL, 100 ng / mL oder 1000 ng / mL aus 20-mal mehr konzentrierten Beständen). </li><li> Nach der 3,5-stündigen Inkubation bei 37 ° C fügen Sie die blaue Zell-Tracking-Farbstoff-Arbeitslösung (10 μM Zellverfolger blau in EBM-2 basal) zu den primären Perizyten des Patienten hinzu. Beim 4-stündigen Zeitpunkt (~ 30 min Inkubation mit Zellverfolgungsfarbstoff) fügen Sie der Platte, die das hCMEC / D3 enthält, in einem Volumen von 6 μl / Vertiefung vorsichtig 2.000 Pericyt / Well zu. </li><li> Nach einer weiteren 2,5-stündigen Inkubation (insgesamt 6,5 h ab 0 h-Zeitpunkt) fügen Sie die orangene Zellverfolgungs-Farbstoff-Arbeitslösung (10 μM Zell-Tracker-Orange in EBM-2 basal) zu den primären Astrozyten des Menschen hinzu. Bei der 7-stündigen Zeit, fügen Sie vorsichtig 10.000 Astrozyten / Well auf die Platte in 12 μL Volumen. Daher ist das gesamte Zellverhältnis für Endothelzellen: Perizyten: Astrozyten iS 5: 1: 5. Weiterhin beträgt das bis dahin erreichte Volumen 66,5 μl. </li><li> Füge oAβ (3,5 μl 100 μM Lager) 4 h später hinzu (insgesamt 11 h ab 0 h Zeit). </li><li> Fixieren Sie die Zellen 13 h später in frisch hergestelltem 4% Paraformaldehyd in PBS. Achtung: Bei der Handhabung von Paraformaldehyd Schutzkleidung, Handschuhe und Brille tragen. </li></ol></li></ol> 3. Quantifizierung <ol><li> Erfassen Sie Fluoreszenzbilder der Gesamtbrunnen der 96-Well-Platte bei 1,6facher Vergrößerung mit einer 2-s-Belichtungszeit bei 50% maximaler Leistung unter Verwendung eines Sektionsmikroskops. HINWEIS: Äquivalente Mikroskope können genutzt werden; Allerdings ist es entscheidend, den gesamten Brunnen für eine umfassende Analyse zu erfassen. </li><li> Zur quantitativen Analyse verarbeiten die Bilder mit dem Plugin 22 für das PhotoJ-Angiogenese-Analysator 22 , um die Anzahl der Verzweigungen, die Anzahl der Maschen und die Gesamtzelllänge zu quantifizieren (diese Auslesungen werden automatisch von der Softwa tabelliertRe) wie unten beschrieben. Ein detailliertes visuelles Protokoll dieses Schrittes ist in Fig. 2 dargestellt . <ol><li> Öffnen Sie fiji ImageJ, indem Sie auf das Software-Symbol klicken. </li><li> Klicken Sie auf die doppelten roten Vorwärtspfeile, die sich am Ende der Symbolleiste befinden, und klicken Sie dann auf &quot;Angiogenese Analyzer&quot;. </li><li> Wählen Sie den Ordner mit Bilddateien aus, klicken Sie auf &quot;Öffnen&quot;. </li><li> Wenn das Feld &quot;Einstellungen für die Analyse&quot; erscheint, klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Wenn das Feld &quot;Verarbeitungsbilder&quot; erscheint, das die Anzahl der zu verarbeitenden Bilder angibt, klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Wenn das Feld &quot;Batch-Fortschrittsfenster&quot; erscheint, das die geschätzte Bearbeitungszeit anzeigt. Während dieser Zeit quantifiziert das Programm die Ausgänge einschließlich der Anzahl der Zweige, der Anzahl der Maschen und der Gesamtzelllänge. HINWEIS: Sobald alle Bilder quantifiziert sind, wird die Ergebnisdatei im Originalbildordner als Tabellenkalkulationsdokument angezeigt. </li><li> WählenDie Tabellenkalkulation enthält Ergebnisse und vergleicht die Anzahl der Zweige, Maschen und die Gesamtzelllänge zwischen den Gruppen. ANMERKUNG: Im Triple-Kultur-Assay wird ImageJ weiter verwendet, um die Pericyt- / Astrozyten-Abdeckung und -zahl zu analysieren. Bilder werden durch einen verblindeten Experimentator und die &quot;analysierte Partikel&quot; -Funktion, die verwendet wird, um Auslesungen zu erzeugen, eingeschränkt. Feste Zellen und röhrenartige Strukturen können auch für Aβ 17 oder andere Marker immunostainiert werden. </li></ol></li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+APOE+in+cerebrovascular+dysfunction.">The role of APOE in cerebrovascular dysfunction.</a> Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).</li><li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroangiogenesis:+a+vascular+basis+for+Alzheimer's+disease+and+cognitive+decline+during+aging.">Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer's disease and cognitive decline during aging.</a> J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).</li><li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+therapeutic+approach+for+senile+dementias:+neuroangiogenesis.">A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis.</a> J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).</li><li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Capillaries+in+the+Lesser+Ailments+of+Old+Age+and+in+Alzheimer's+Disease+and+Vascular+Dementia:+The+Potential+of+Pro-Therapeutic+Angiogenesis.">The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis.</a> J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die beschriebenen Methoden können genutzt werden, um mehrere grundlegende biologische Fragen um die zerebrovaskuläre Abdeckung zu adressieren 24 . Insbesondere können sie identifizieren, welche Rezeptoren und Signalwege eine Rolle bei der Angiogenese, der Gefäßabdeckung im Krebsgewebe und den peripheren Endothelzellen spielen, die für das Gehirn relevant sind. Beispiele umfassen angiogene Wachstumsfaktor-Rezeptoren, Stickstoffmonoxid, Mitogen-aktivierte Proteinkinase-Signalisierung und Calc...

<html> Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​von zerebralen Kapillaren ist die grösste Schnittstelle von Blut-zu-Gehirn-Kontakt und spielt eine zentrale Rolle in der Homöostase des Zentralnervensystems (ZNS) 1 , 2 . Die dynamischen Prozesse am BBB verhindern die Aufnahme von unerwünschten Molekülen aus dem Blut, entfernen Abfallprodukte aus dem ZNS, liefern dem NZS wesentliche Nährstoffe und Signalmoleküle und modulieren die Neuroinflammation 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . BBB-Schäden sind während des Alterns vorherrschend und einige neurodegenerative Erkrankungen einschließlich Alzheimer-Krankheit (AD), Multiple Sklerose und Schlaganfall 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = &quot;xref&quot;&gt; 6 Daher kann die BBB-Dysfunktion eine Schlüsselrolle bei neurodegenerativen Erkrankungen spielen, auch als therapeutisches Ziel. Die Erhaltung der Schiffsdeckung ist für die homöostatischen Funktionen der BBB wichtig. In vivo- und in vitro- Daten stehen jedoch Konflikte dar, ob die Prozesse, die bei neurodegenerativen Störungen auftreten, eine höhere oder niedrigere BBB-Abdeckung 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , insbesondere in AD, verursachen. Daher gibt es eine starke Begründung für die Entwicklung von In-vitro- Modellen mit relevanten Zelltypen zu bewerten und umfassender zu verstehen, die Dynamik der BBB-Abdeckung. Zerebrale Kapillaren bestehen aus Astrozyten, Perizyten und Hirn-Endothelzellen (BECs) <sUp class = &quot;xref&quot;&gt; 3. Alle Zelltypen tragen zur Struktur der BBB durch strukturelle Unterstützung und über die Sekretion von Effektormolekülen wie angiogenen Wachstumsfaktoren, Zytokinen und Chemokinen bei, die in parakrin- und autokrineartig wirken. Allerdings sind die großen Effektorzellen der BBB BECs 3 . Im Allgemeinen sind die Zellkulturtechniken zur Beurteilung der BBB-Funktion Permeabilitäts-Assays, die an Zellen durchgeführt werden, die auf Filtereinsätzen gezüchtet werden, oder die Bewertung von Niveaus von Schlüssel-BEC-Proteinen, sowohl nach der Zugabe von Stressoren 14 , 15 , 16 . Obwohl wichtig, diese Assays nicht auf die zerebrovaskuläre Abdeckung konzentrieren. Hier sind unsere bisherigen Methoden 17 detailliert, um die BEC-Berichterstattung und die meshwork-artigen Strukturen unter Verwendung einzelner Kulturen von immortalisierten menschlichen BECs, einzelner Kulturen von primären Maus-BECs und einer humanisierten Tripelkultur zu bestimmenModell (BECs, Astrozyten und Perizyten) der BBB. Ziel war es, die nachteilige Wirkung von oAβ zu demonstrieren, die als wichtiger Beitrag zur AD-Progression auf der BEC-Berichterstattung gilt. Die schützende Wirkung des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) unterstreicht das Potenzial der Technik als therapeutisches Screening-Tool. Die Technik hat mehrere breite Anwendungen für die Grundlagenforschung und die angewandte Forschung, einschließlich: 1) Abgrenzung der Rolle spezifischer Wege auf Angiogenese und Gefäßabdeckung, 2) Bewertung der Auswirkungen von Krankheiten und Alterungsrelevanten Faktoren auf die Angiogenese und die Gefäßabdeckung und 3) die Identifizierung der pharmakologischen Zielen

<table><tbody><tr><td>hCMEC/D3 cells</td><td>Milipore</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 basal media</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type 1</td><td>ThermoFisher</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>5% FBS</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>10% Ascorbic acid</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>10% Gentamycin sulphate</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>25% Hydrocortisone</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin hydrochloride</td><td>VWR</td><td>80503-312</td><td></td></tr><tr><td>MEM-HEPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>12360-038</td><td></td></tr><tr><td>Papain cell dissociation system (papain and DNase1)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Human pericytes</td><td>Sciencell</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte basal media</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte growth supplement</td><td>Sciencell</td><td>1252</td><td></td></tr><tr><td>Human Astrocytes</td><td>Sciencell</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyte media</td><td>Sciencell</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyte growth supplement</td><td>Sciencell</td><td>1852</td><td></td></tr><tr><td>Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Angiogenesis m-plates (96-well)</td><td>ibidi</td><td>89646</td><td></td></tr><tr><td>Human Epidermal growth factor</td><td>Shenendoah Biotechnology</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker green</td><td>ThermoFisher</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker orange</td><td>ThermoFisher</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker blue</td><td>ThermoFisher</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>Poly-l-lysine</td><td>Sciencell</td><td>0403</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5012-60ML</td><td></td></tr><tr><td>C57BL mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>PCR tube strips</td><td>GeneMate</td><td>T-3014-2</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope</td><td>Zeiss</td><td>na</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro assays to assess blood-brain barrier mesh-like vessel formation and disruption

Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​Abdeckung spielt eine zentrale Rolle in der Homöostase des zentralen Nervensystems (ZNS). Die BBB wird dynamisch durch Astrozyten, Perizyten und Hirn-Endothelzellen (BECs) gehalten. Hier stellen wir Methoden zur Beurteilung der BBB-Berichterstattung über einzelne Kulturen von verewalisierten menschlichen BECs, einzelne Kulturen von primären Maus-BECs und ein humanisiertes Triple-Kulturmodell (BECs, Astrozyten und Perizyten) der BBB vor. Um die Anwendbarkeit der Assays auf Krankheitszustände hervorzuheben, beschreiben wir die Wirkung von oligomeren Amyloid-β (oAβ), was ein wichtiger Faktor für die Alzheimer-Krankheit (AD) -Progression bei der BBB-Abdeckung ist. Weiterhin nutzen wir den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), um das Arzneimittel-Screening-Potential der Techniken zu beleuchten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass einzelne und dreifach kultivierte BECs unter basalen Bedingungen meshwork-ähnliche Strukturen bilden und dass oAβ diese Zell-Mesh-Formation stört und die vorgeformten Mesh-Strukturen degeneriert,Aber EGF blockiert diese Störung. So sind die beschriebenen Techniken für die Sezierung von fundamentalen und krankheitsrelevanten Prozessen wichtig, die die BBB-Abdeckung modulieren.

In einzelnen Kulturen bilden sowohl die hCMEC / D3-Zellen ( Fig. 3A ) als auch die primären Maus-BECs ( Fig. 3B ) in der Wanne Mesh-ähnliche Strukturen. Die Strukturen zeichnen sich durch ein Netz von miteinander verbundenen Knoten aus ( Abbildung 3 ). In allen beschriebenen Paradigmen ( Abbildung 1 ) sind die maschenartigen Strukturen nach 24 h in den Kontrollgruppen...

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In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Die Erhaltung der Blut-Hirn-Schranke Abdeckung ist der Schlüssel für die Homöostase des zentralen Nervensystems. Dieses Protokoll beschreibt in vitro- Techniken, um die fundamentalen und pathologischen Prozesse abzugrenzen, die die Blut-Hirn-Schrankenabdeckung modulieren.

In-Vitro- Assays zur Beurteilung der Blut-Hirn-Schranke Mesh-artigen Gefäßbildung und -störung

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

in-vitro-assays-to-assess-blood-brain-barrier-mesh-like-vessel

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

8.4K Aufrufe.  University of Illinois at Chicago.  Die Erhaltung der Blut-Hirn-Schranke Abdeckung ist der Schlüssel für die Homöostase des zentralen Nervensystems. Dieses Protokoll beschreibt in vitro- Techniken, um die fundamentalen und pathologischen Prozesse abzugrenzen, die die Blut-Hirn-Schrankenabdeckung modulieren. 

Serie: In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of brain tumors, the molecular selectivity of BBB also shields the neoplastic cells by blocking the delivery of peripherally administered chemotherapies. The development of novel drugs (including nanoparticles) targeting malignant brain tumors ideally requires the use of preclinical animal models to study the drug&#8217;s transcytosis and antitumor efficacy. In order to comply with the 3R principle (refine, reduce, and replace) to reduce the number of laboratory animals in experimental setup and perform the high-throughput screening of a large library of antitumor agents, we developed a reproducible in vitro human and murine mimic of the blood-brain tumor-barrier (BBTB) using three-layered cultures of endothelial cells, astrocytes, and patient-derived glioblastoma spheres. For higher scalability and reproducibility, commercial cell lines or immortalized cells have been used in tailored conditions to allow the formation of a barrier resembling the actual BBB. Here we describe a protocol to obtain a BBTB mimic by culturing endothelial cells in contact with astrocytes at specific cell densities on inserts. This BBTB mimic can be used, for instance, for the quantification and confocal imaging of the nanoparticle passage through the endothelial and astrocytic barriers, in addition to the evaluation of the tumor cell targeting within the same assay. Moreover, we show that the obtained data can be used to predict the behavior of nanoparticles in preclinical animal models. In a broader perspective, this in vitro model could be adapted to other neurodegenerative diseases for the determination of the passage of new therapeutic molecules through the BBB and/or be supplemented with brain organoids to directly evaluate the efficacy of drugs.

Drug targeting to central nervous system tumors is a major challenge. Here we describe a protocol to produce an in vitro mimic of the blood-brain tumor-barrier using murine and/or human cells and discuss their relevance for the predictability of central nervous system tumor targeting in vivo.

Vorhersage In Vivo Nutzlasten Lieferung mit einem Blut-Hirnschranke Tumor in einer Petrischale

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

Forschung

Krebsforschung

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Biotechnik

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Einrichten einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Ratte Blut-Hirn-Schranke (BBB): Ein Fokus auf BBB-Undurchlässigkeit und Rezeptor-vermittelten Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Medizin

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell der Blut-Hirn-Schranke Mit Impedanzspektroskopie: Ein Fokus auf T-Zell-Endothelzellinteraktion

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Immunologie und Infektion

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Neurowissenschaften

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Ein 3D-Blut-Hirn-Schranken-Modell, das aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gewonnen wurde

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting the brain from pathogens. The inherent barrier properties of the BBB pose a challenge for therapeutic drug delivery into the CNS to treat neurological diseases. Impaired BBB function has been related to neurological disease. Cerebral amyloid angiopathy (CAA), the deposition of amyloid in the cerebral vasculature leading to a compromised BBB, is a co-morbidity in most cases of Alzheimer&#39;s disease (AD), suggesting that BBB dysfunction or breakdown may be involved in neurodegeneration. Due to limited access to human BBB tissue, the mechanisms that contribute to proper BBB function and BBB degeneration remain unknown. To address these limitations, we have developed a human pluripotent stem cell-derived BBB (iBBB) by incorporating endothelial cells, pericytes, and astrocytes in a 3D matrix. The iBBB self-assembles to recapitulate the anatomy and cellular interactions present in the BBB. Seeding iBBBs with amyloid captures key aspects of CAA. Additionally, the iBBB offers a flexible platform to modulate genetic and environmental factors implicated in cerebrovascular disease and neurodegeneration, to investigate how genetics and lifestyle affect disease risk. Finally, the iBBB can be used for drug screening and medicinal chemistry studies to optimize therapeutic&#160;delivery to the CNS. In this protocol, we describe the differentiation of the three types of cells (endothelial cells, pericytes, and astrocytes) arising from human pluripotent stem cells, how to assemble the differentiated cells into the iBBB, and how to model CAA in vitro using exogenous amyloid. This model overcomes the challenge of studying live human brain tissue with a system that has both biological fidelity and experimental flexibility, and enables the interrogation of the human BBB and its role in neurodegeneration.

Autor im Rampenlicht: Ein personalisierter Ansatz zur Erforschung der Alzheimer-Krankheit unter Verwendung eines In-vitro-Blut-Hirn-Schrankenmodells 

The blood-brain barrier (BBB) has a crucial role in sustaining a stable and healthy brain environment. BBB dysfunction is associated with many neurological diseases. We have developed a 3D, stem-cell-derived model of the BBB to investigate cerebrovascular pathology, BBB integrity, and how the BBB is altered by genetics and disease.

Rekonstruktion der Blut-Hirn-Schranke in vitro zur Modellierung und therapeutischen Behandlung neurologischer Erkrankungen

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...

In-Vitro- Assays zur Beurteilung der Blut-Hirn-Schranke Mesh-artigen Gefäßbildung und -störung

Zusammenfassung

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Vorhersage In Vivo Nutzlasten Lieferung mit einem Blut-Hirnschranke Tumor in einer Petrischale

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

Einrichten einer

Ein

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung

Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

Rekonstruktion der Blut-Hirn-Schranke in vitro zur Modellierung und therapeutischen Behandlung neurologischer Erkrankungen

Rekonstruktion der Blut-Hirn-Schranke in vitro zur Modellierung und therapeutischen Behandlung neurologischer Erkrankungen

Rekonstruktion der Blut-Hirn-Schranke in vitro zur Modellierung und therapeutischen Behandlung neurologischer Erkrankungen