En este estudio, utilizamos Bat MHC Clase I como modelo para resumir la metodología, y para evaluar la viabilidad de un híbrido MHC clase I complejo con microglobulina beta-2 heterologosa. Estudios anteriores han demostrado que la sustitución B2M de mamíferos no afecta significativamente a la presentación del péptido. De hecho, el híbrido MHC Clase I puede activar una estructura y función similares a la molécula original.
Estas técnicas se pueden utilizar para facilitar el estudio funcional y estructurado del MHC I para la evaluación de la respuesta a los tejidos durante enfermedades infecciosas e inmunoterapia tumoral. Para la transformación del cultivo de E.coli añadir 10 nanogramos de plásmido que contienen murciélago o humano MHC Clase I beta dos cadena de hidrógeno de microglobulina a 100 microlitros de suspensión igualada y bañar la suspensión en hielo durante 30 minutos. Al final de la incubación, el calor impacta las bacterias durante 90 segundos a 42 grados centígrados, y devuelve el cultivo al baño de hielo durante dos minutos.
A continuación añadir 800 microlitros de caldo de lisógena a la cultura, y agitar la suspensión en una plataforma de balanceo durante 20 minutos a 37 grados Celsius, y 200 rotaciones por minuto. Al final de la incubación, esparce 100 microlitros de la bacteria en una hoja de cultivo adecuada resistente a los antibióticos. A la mañana siguiente, elija un solo clon bacteriano recientemente transformado e inocular el clon con tres mililitros de LB con medio antibiótico.
Coloque la cultura en la plataforma de balanceo a 37 grados Celsius durante 12 a 16 horas. A la mañana siguiente, transfiera 500 microlitros del caldo bacteriano activado a 50 mililitros de LB con medio antibiótico, y devuelva la bacteria a la incubadora de rocas durante la noche. Divida el material bacteriano activado restante en 500 alícuotas de microlitro y agregue cada alícuota a 500 volúmenes de microlitro del 40% de glicerol, para menos 80 grados centígrados de almacenamiento.
Para generar grandes cantidades de proteína recombinante, a la mañana siguiente transfiera la suspensión bacteriana a dos litros de LB con medio antibiótico a una proporción de uno a 100, y devuelva el cultivo a la incubadora de mecedoras hasta que se logre una absorbancia de 0,6 a 600 nanómetros. A continuación, agregue un IPTG mililitro al cultivo para inducir la expresión del gen trans. Después de cuatro a seis horas de inducción, transfiera el cultivo bacteriano a botellas para una centrifugación y vuelva a suspender los pellets celulares bacterianos en 60 mililitros de PBS por botella.
A continuación, libere la proteína recombinante expresada por disruptor de células ultrasónicas 99 veces, durante seis segundos y un intervalo de 12 segundos a 300 vatios por sonicación. Para su inclusión, la purificación del cuerpo recoge las bacterias sonicadas mediante centrifugación y vuelve a suspender los pellets en un volumen adecuado de amortiguador de lavado para dos centrifugaciones adicionales. Después del segundo lavado, vuelva a suspender los cuerpos de inclusión y vuelva a suspender el búfer, y reserve un aliquot de 20 microlitros de la muestra para la página SDS para probar la pureza del cuerpo de inclusión.
Centrífuga la muestra restante y sopese el cuerpo de inclusión que contiene pellets. Añadir búfer de disolución a los pellets a una concentración final de 30 miligramos de cuerpo de inclusión por mililitro de buffer. Y usa un agitador magnético para agitar lentamente la solución a cuatro grados centígrados, hasta que los cuerpos de inclusión se disuelvan en el búfer de disolución.
Después de descartar los precipitados, guarde los cuerpos de inclusión a menos 20 o menos 80 grados Celsius. Para el reencuentro complejo MHC, agregue cinco mililitros de glutatión reducido y 0,5 mililitros de glutatión oxidado a 250 a 300 mililitros, un amortiguador de refolding de cuatro grados Celsius. Y revuelva lentamente la solución en un agitador magnético a cuatro grados Celsius durante 10 a 20 minutos.
Para la cadena de hidrógeno MHC y la dilución beta de dos microglobulinas, cargue el cuerpo de inclusión en una jeringa de un mililitro e inyecte todo el volumen de un mililitro de solución corporal de inclusión en un litro de búfer de refoldado cerca de la barra de agitación, para obtener una dilución rápida y eficiente. A continuación, disolver cinco miligramos por mililitro de péptido en sulfóxido de dimetil, e inyectar rápidamente 200 microlitros de péptido en la solución de redil como se acaba de demostrar. Después de 10 a 20 minutos de agitación lenta, inyecte tres mililitros de cuerpos de inclusión en cadena H en un nuevo volumen de un litro de búfer de reencuacamiento y permita que el refolding continúe a cuatro grados Celsius durante ocho a 10 horas.
Para determinar la concentración de proteínas refolded añadir búfer de intercambio a una cámara presurizada con una membrana oxidasa multi cobre de 10 kilodalton, y concentrar el amortiguador a 30 a 50 mililitros de volumen. Transfiera la solución de reenfoque a un tubo centrífugo y retire los precipitados por centrifugación. Transfiera cuidadosamente el supernato a la cámara y concentre aún más el búfer a un volumen final de aproximadamente un mililitro.
Retire los contaminantes finales por centrifugación y transfiera el supernato a un tubo estéril. Utilice una columna de exclusión de tamaño de diez trescientos GL para purificar las proteínas, recogiendo las muestras en el pico y analizándolas utilizando la página SDS. Recoge el pico complejo MHC y concentra la proteína a una concentración final de 15 miligramos por mililitro.
A continuación, diluya el complejo a 7,5 miligramos por concentración de mililitro. Para realizar la cristalización del complejo MHC y péptido utilizando la técnica de difusión de vapor de caída sentado, agregue 0,8 microlitros de la muestra a una placa de cristal comercial y selle la placa. Eequilibrar la solución de muestra contra 100 microlitros de solución de reservorio a cuatro o 18 grados Celsius, y utilizar un microscopio para observar regularmente el crecimiento del cristal durante los próximos seis meses.
Para la protección criogénica, al final del experimento, transfiera los cristales a una solución de almacenamiento que contenga un 20% de glicerol antes de enfriar rápidamente las muestras en una corriente de nitrógeno gaseoso Kelvin de 100 grados. A continuación, recopile datos de difracción de rayos X de acuerdo con los protocolos estándar. Para determinar la estructura de los complejos cristalinos, abra los datos estructurales de difracción de rayos X de alta resolución en el programa Denzo dentro del paquete de software HK L 2000 y seleccione un modelo inicial en el banco de datos de proteínas.
Para determinar la estructura de la proteína, abra los datos en el Programa de MR Phaser en CCP4 y utilice el modelo de rayos X refinado para el refinamiento de juntas inicial. A continuación, utilice los modos de refinamiento de Phoenix solo y articulaciones para el refinamiento solo de rayos X, y el neutrones articular para el refinamiento de rayos X. Después de cada ronda de refinamiento, compruebe manualmente el modelo contra el Fo-Fc, y mapas de densidad nuclear positiva 2Fo-Fc en Coot.
En estos experimentos representativos, se evaluaron las capacidades de unión del virus Hendra derivado del péptido Hendra Virus One para batear cadenas de hidrógeno MHC Clase I con murciélago homologoso beta dos microglobulina y betaglobulina humana heterologosa dos microglobulina. En ambos análisis, se formaron cristales con una alta resolución mediante la reaturación con la cadena de luz beta de dos microglobulinas. En ausencia de beta dos microglobulina, estos complejos no se forman.
En la cadena de hidrógeno MHC Clase I Hendra Virus uno, estructura beta dos de microglobulina humana, residuos conservados H31, D53, W60 y Y63 de microglobulina beta dos humana, que corresponden a microglobulina beta dos murciélagos, hacen contacto con la parte inferior de la ranura de unión de péptidos y conservan Q8, Y10, R12 y 24 residuos, que corresponden a las dos microglobulinas beta vinculadas al dominio alfa tres. En las estructuras generales de murciélagos y humanos, la derivación cuadrada media de la raíz media de residuos de una a 184 de las cadenas de hidrógeno es de 0,248 bajo todas las superposiciones del átomo alfa de carbono, lo que indica que no hay diferencias entre estos dos complejos. La estructura de la alineación de péptidos muestra que las confirmaciones de Hendra Virus un péptido en estos dos complejos son bastante similares.
La alineación de secuencias también muestra que los aminoácidos de la microglobulina beta dos de diferentes especies están altamente conservados. Es importante ofrecer a los complejos adversarios una alta eficiencia en la presentación de informes. Por lo tanto, es crucial seleccionar beta dos micro globulina adecuada y utilizar cuerpos de inclusión altamente purificados.
Este protocolo se puede utilizar para obtener complejo MTC I estable a través de posibles sustituciones beta de dos microglobulinas en otras especies, y para existir son estructura y función MTC I. Los datos obtenidos de estos estudios se pueden utilizar para evaluar las respuestas de las células T durante enfermedades infecciosas e inmunoterapias tumorales.
