Este protocolo describe un método para examinar rápidamente miles de genomas utilizando esperma de pez cebra inyectado con F0 CRISPR. Esta técnica es ventajosa en su accesibilidad. En lugar de costosos enfoques especializados basados en secuenciación, nuestro método utiliza enzimas de restricción de PCR y electroforesis en gel para detectar portadores masculinos F0 para detectar indeles o ediciones específicas del genoma.
La parte más difícil de este procedimiento es obtener el esperma rápidamente, pero se convierte en una buena técnica para la fertilización in vitro si trabajamos con muchos peces dismórficos, por lo que es una manera fácil de cruzar peces que nos están dando problemas. Comience instalando tanques de cría tanto para el tipo salvaje como para los peces F0 e incube los tanques durante la noche. Después de anestesiar al pez macho al día siguiente, use una cuchara ranurada para transferirlo a una pila de toallas de papel limpias.
Enrolle suavemente el pescado para eliminar el exceso de agua. Retire el agua secándola secándola con un pañuelo plegado limpio. Usando la cuchara ranurada, transfiera el pescado a la esponja preparada.
Coloque el pez con el lado ventral hacia arriba y seque suavemente el área alrededor de las aletas anales con un papel de seda doblado limpio. Para recolectar los espermatozoides, use un tubo capilar para mover suavemente las aletas pélvicas lejos de la línea media, exponiendo la cloaca. Coloque el tubo capilar cerca de la cloaca.
Con los dedos o un par de pinzas de filtro, apriete suavemente los lados del pez desde las branquias hacia abajo. Usando la acción capilar, recolecte el esperma en el tubo y colóquelo en un tubo de PCR que contenga 40 microlitros de solución de hidróxido de sodio milimolar de 50, luego expulse la muestra al tubo. Después de girar las muestras de esperma en una mini centrífuga, coloque los tubos de PCR en un termociclador.
Haga funcionar el ciclador calentando las muestras durante 40 minutos a 95 grados centígrados, seguido de un enfriamiento a 25 grados centígrados. Después de retirar las muestras del ciclador, neutralizar el pH añadiendo 10 microlitros de un clorhidrato de tris molar de pH ocho. Mezclar aspirando la suspensión y luego centrifugar las muestras.
Ajuste el termociclador a 95 grados centígrados para el precalentamiento. Y mientras tanto, prepare 25 microlitros de la mezcla de reacción de PCR para cada muestra de esperma. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo, luego girar las muestras.
Coloque las muestras en el termociclador precalentado y ajuste el ciclo. Para obtener una solución de gel, microondas una solución de gel de agarosa al 4% preparada mezclando polvo de agarosa, tinción de gel y tampón TBE. Vierta la solución de gel en un marco de fundición de gel e inserte un peine en un lado.
Después de la solidificación del gel, retire con cuidado el peine. Coloque el gel en una plataforma de electroforesis de tal manera que los pocillos estén más cerca del electrodo negativo. Vierta el búfer de ejecución TBE en la plataforma hasta que los pozos estén completamente sumergidos.
Comience a cargar el gel pipeteando cinco microlitros de escalera de ADN en el primer pozo. Cargue los pocillos restantes con 5 a 10 microlitros del producto de PCR. Ejecute el gel durante 1 hora a 150 voltios para asegurar una separación adecuada de los amplicones.
Utilice el generador de imágenes de gel para ver las bandas de ADN. El análisis del locus p2ry12 mostró que el amplicón de tipo salvaje mostraba una sola banda de 250 pares de bases de longitud, mientras que los amplicones masculinos inyectados con F0 que contenían indeles corrían como múltiples bandas. El análisis del locus DNAH10 mostró que el amplicón de tipo salvaje se ejecuta como una sola banda larga de 400 pares de bases.
Los amplicones masculinos inyectados con F0 que contenían indeles corrían como múltiples bandas o como una sola banda con disminución de la movilidad del gel. El número uno masculino inyectado con F0 tenía una banda adicional en el producto digerido, que estaba ausente en el producto de PCR, lo que lo convertía en el mejor candidato fundador para el establecimiento de la línea mutante. Si un pez macho no produce esperma cuando se aprieta, lo mejor es descansar el pescado durante una semana y volver a intentarlo en lugar de apretarlo demasiado fuerte y arriesgarse a lastimarlo.
Una vez que el FC o el fundador masculino se cruzan, los alelos deben verificarse en la progenie F1. Secuenciar los amplicones F1 directamente y realizar análisis de alelos heterocigotos es una manera fácil de hacerlo.
