El pez cebra está emergiendo como un excelente modelo de vertebrados para estudiar los eventos cromosómicas de la meiosis, incluyendo el emparejamiento cromosómica homóloga, la sinapsis y la recombinación. Este protocolo de propagación de la superficie nuclear nos ha permitido visualizar las características clave de la arquitectura cromosómica meyótica utilizando una microscopía de super resolución. Los investigadores pueden esperar cientos de núcleos bien extendidos por diapositiva con menos escombros que otros protocolos de propagación de peces cebra.
La parte técnicamente más difícil de este procedimiento es la disección de los testículos de pez cebra ya que está cerca de la piel y también se une a otros órganos. Visualizar el procedimiento de disección permitirá a los investigadores saber qué esperar cuando vean la gónada incrustada en el tejido del animal. Después de eutanasiar el pez cebra macho, decapitar un pez a la vez con tijeras pequeñas y luego utilizar micro tijeras para cortar a lo largo de la línea media ventral para exponer la cavidad del cuerpo.
Coloque el pescado en un plato de Petri recubierto de silicona y cúbralo junto a una piscina poco profunda de 1X PBS. Bajo un microscopio con un aumento de 1,65X, diseccionar los testículos utilizando fórceps. Retire la mayor cantidad de grasa y tejido circundante de los testículos como sea posible.
La gónada aparecerá translúcida bajo la luz del alcance de la disección, mientras que la grasa circundante puede tener un aspecto ligeramente más oscuro. Se puede dejar cierta cantidad de grasa en la gónada sin impedir el procedimiento. Agregue cada testículo diseccionado directamente en un tubo de cinco mililitros con dos mililitros de DMEM y manténgalos en hielo.
Para disociar las células de los testículos, añadir 200 microlitros de solución de colagenasa al tubo de cinco mililitros con los testículos. Mezclar la solución inviriéndola varias veces. Agitar suavemente los testículos en una coctelera de incubadora horizontalmente a 100 RPM a 32 grados centígrados.
Invierta rápidamente el tubo cada 10 minutos para facilitar la disociación. Después de una hora, el DMEM está nublado y los testículos están en pequeños trozos. Mientras que los testículos se incuban en colagenasa, precalienta 100 microlitros de 0.1 solución de sacarosa molar a 37 grados Celsius.
Para lavar la colagenasa, añadir DMEM a un volumen final de cinco mililitros e invertir el tubo un par de veces. Pele el testículo a 200 g durante tres minutos a temperatura ambiente. Retire tres mililitros del sobrenadante para que sólo queden dos mililitros.
Repita el lavado DMEM dos veces adicionales. Después del último lavado DMEM, retire cuatro mililitros del sobrenadante y agregue un mililitro de DMEM, 200 microlitros de solución de trippsina y 20 microlitros de solución DNase I. Invierta el tubo unas cuantas veces para mezclar la solución.
Agite el tubo horizontalmente a 32 grados centígrados a 100 RPM. Invierta rápidamente el tubo cada cinco minutos para facilitar la disociación. Después de cinco a 15 minutos, la solución DMEM contiene solo unos pocos grupos.
Añadir 500 microlitros de la solución inhibidora de la trippsina y 50 microlitros de la solución DNase I. Invierta el tubo unas cuantas veces para mezclar y luego gire brevemente a 200 g durante tres minutos a temperatura ambiente para eliminar el líquido o los grumos que pueden adherirse a la tapa del tubo o al lado del tubo. Coloque el tubo sobre hielo y resusppend la suspensión celular pipeteando repetidamente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de transferencia de plástico durante dos minutos para facilitar la disociación de los grumos restantes.
Asegúrese de que la suspensión celular no entre en la bombilla de la pipeta de transferencia. A continuación, pre-mojar un colador celular de 100 micras con DMEM y colóquelo encima de un tubo de 50 mililitros sobre hielo. Transfiera la suspensión celular a través del colador una gota a la vez utilizando una pipeta de transferencia de plástico.
Transfiera el filtrado utilizando una pipeta de transferencia de plástico a un nuevo tubo de cinco mililitros. Asegúrese de recoger las celdas agrupadas conectadas a la parte inferior del filtro. Agregue DMEM en el tubo a un volumen final de cinco mililitros.
Pele las células a 200 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Retire tanto sobrenadante como sea posible sin alterar el pellet y agregue cinco microlitros de la solución DNase I directamente en el pellet. A continuación, mezcle el pellet con la solución DNase I raspando suavemente el fondo exterior del tubo de cuatro a cinco veces a lo largo de un bastidor de tubo de microcentrífuga vacío.
Añadir DMEM a un volumen final de cinco mililitros y mezclar la solución invirtiendo el tubo varias veces. Pele la suspensión celular a 200 g durante dos minutos a temperatura ambiente. Repita el tratamiento con DNase una a tres veces adicional hasta que el pellet resuspendido no se agrupe al adición de DMEM.
Después del último giro, retire tanto como sobrenadante como sea posible sin alterar el pellet. A continuación, agregue un mililitro de 1X PBS y resuspender el pellet raspando suavemente la parte inferior exterior del tubo a lo largo de un bastidor de tubo vacío. Pele la suspensión celular a 200 g durante cinco minutos y luego retire tanto sobrenadante como sea posible sin alterar el pellet.
Corte tres milímetros desde el final de una punta de pipeta de 200 microlitros para ampliar la abertura. Con la punta de la pipeta cortada, resuspender el pellet en 80 microlitros de solución de sacarosa molar 0.1 pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Deje reposar la suspensión celular a temperatura ambiente durante tres minutos.
A continuación, con una punta de pipeta, cubra una diapositiva con 100 microlitros de 1% de formaldehído con 0,15%Tritón X-100. A continuación, agregue 18 microlitros de la suspensión de la celda de sacarosa en el centro de la diapositiva en una línea recta perpendicular al borde largo. Incline la corredera hacia adelante y hacia atrás para facilitar la propagación de la suspensión de la celda a todas las esquinas.
Coloque los portaobjetos planos en una cámara de humedad abierta ligeramente agrietada para evitar que la solución de formaldehído se seque. Coloque la cámara de humedad en un cajón oscuro durante la noche. Por la mañana, retire la tapa de la cámara de humedad y deje que los portaobjetos se sequen por completo.
Coloque los portaobjetos en un frasco de coplina y luego llene el frasco de coplina con agua destilada. Incubar durante cinco minutos con un suave temblor a temperatura ambiente. Vierta el agua y llene el frasco con uno a 250 agente humectante.
Lavar dos veces durante cinco minutos cada uno con un suave temblor a temperatura ambiente. Deje que los portaobjetos se sequen completamente y guárdelos a menos 20 grados Centígrados hasta que estén manchados. Este protocolo delineó un método para preparar y visualizar la propagación de espermatozoides de peces cebras que produce núcleos no superpuestos bien extendidos.
Los paneles de la izquierda muestran tres etapas de profase meótica, leptoteno, cigeno temprano y paquiteno. Los telómeros se tiñeron de magenta para cada etapa. Un ejemplo de spreads de mala calidad debido a tratamientos DNase I insuficientes se muestran aquí.
Los cromosomas meyóticos manchados para SYCP3 indican núcleos superpuestos debido a una suspensión de células de sacarosa viscosa que impide que las células se propaguen correctamente en la diapositiva. Es muy importante comenzar con la cantidad correcta de material de partida, tratar los testículos de pez cebra durante el tiempo adecuado en tripina, y llevar a cabo el número necesario de tratamientos DNase I, ya que no hacerlo puede conducir a muy pocos núcleos o núcleos aglucuados. Siempre se debe usar un EPP adecuado cuando se trabaja con formaldehído.
Después del procedimiento de propagación, los cromosomas se pueden teñir para visualizar varias estructuras cromosómicas, así como roturas de doble hebra para analizar la dependencia de tiempo y la localización de eventos meóticos. Nuestra técnica ha allanado el camino para mostrar que el pez cebra puede ser un mejor modelo de espermatozoides humanos que el ratón basado en las características cromosómicas y el ramo de telómeros.
