Los autores desean agradecer a la Dra. Birgit Werner por su ayuda en la elaboración de este artículo de vídeo. Esta investigación fue financiada por un premio CARRERA NSF.

Parte 1: Preparación Experimental Los procedimientos experimentales realizados en los cangrejos de herradura ha sido aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en la Universidad de Boston. Los animales son comprados a los laboratorios de Biología Marina (Woods Hole, MA) o de otros proveedores y ubicado en un tanque de agua salada en una habitación aireada expuestos a un mercado regulado ciclo luz-oscuridad. El régimen de la iluminación es importante para el arrastre del reloj circadiano del cangrejo y el ciclo de los ojos todos los días entre sus estados durante el día y la noche. Inmediatamente antes de iniciar cualquier procedimiento invasivo, el animal se enfría en un cubo de hielo durante 10-15 minutos hasta que su movimiento es lento y sujeto a una plataforma de madera con dos tornillos de acero inoxidable insertado en el prosoma y dos en el opistosoma. La plataforma se inclina por debajo de granito para que se hunda en el agua. Después de experimentos terminales el animal es sacrificado por inmersión en suspensión de hielo nuevo y descabello en el cerebro, que se encuentra por encima de la boca, con un bisturí. Parte 2: Soluciones Solución Limulus Ringer se compone de 430 mM NaCl, 9,56 mM KCl, 9,52 mM CaCl2, 9,97 mM de MgCl2, 21,05 mM MgSO4, 50 micras de los TES, HEPES 50 micras, y 10 ml / L Pen-estreptococo mezcla (penicilina-estreptomicina, las unidades de 10,000 / ml) . Parte 3: Grabación Electrorretinograma Herramientas necesarias para este procedimiento incluyen un destornillador, vaselina, solución de Ringer, una pipeta de transferencia, un LED verde, una cámara de registro, tornillos de acero inoxidable, y un hisopo de algodón. <ol><li> Una cámara de mano se utiliza para registrar el ERG (Figura 1). El cuerpo de la cámara está diseñada para mantener un depósito de solución salina en contacto con el ojo. La tapa contiene un cable de cloruro de plata para el acoplamiento de la solución conductora de un amplificador y un agujero de pequeño tamaño para dar cabida a un LED. Un LED ultrabrillante con pico de emisión en torno a 520 nm que funciona mejor. </li><li> Para empezar, la parte inferior de la cámara está cubierta con vaselina y asegura sobre el ojo con dos tornillos. </li><li> La cámara se llena con solución salina y se tapa con la tapa. </li><li> Después de la unión de cámara del cangrejo se coloca en una jaula a prueba de luz en un tanque lleno de agua de mar en las branquias. </li><li> El cable de LED se inserta en la tapa de la cámara. </li><li> El cable de señal se recorta para que el cable de cloruro, y el cable de referencia y se recorta en uno de los tornillos implantados. </li><li> Ambos cables están conectados a la etapa de la cabeza de un amplificador diferencial de alta impedancia (X-cell 3x4, FHC Inc) para la amplificación de la señal y el filtro del amplificador se encuentra para pasar las frecuencias inferiores a 10Hz. </li><li> La salida del amplificador se alimenta a un osciloscopio para la visualización y una tarjeta de adquisición de datos para el análisis informáticos y de almacenamiento. </li><li> Después de la configuración de la puerta de la jaula se cierra para bloquear la luz de la sala de alcanzar el animal. </li><li> Los datos se recogen con un programa personalizado escrito en LabView. El programa parpadea el LED, los registros de la señal evocada ERG, y mide la amplitud de la respuesta de pico a pico. La elección del paradigma de flash depende de los objetivos experimentales. Por ejemplo, una breve (100 ms) de pulso de 5V aplica cada 10 minutos hasta que el LED evita los efectos de la adaptación a la luz cuando la vigilancia de los cambios circadianos en la sensibilidad de los ojos. </li></ol> Parte 4: Grabación del nervio óptico Herramientas necesarias para este procedimiento incluyen un destornillador, hilo, un trépano, solución de Ringer, gubias, tijeras Vannas, una cámara de registro, pinzas curvas, las sondas con aguja fina, una aburrida tijeras bisturí quirúrgico, y un electrodo de succión. <ol><li> Una cámara de mano se utiliza para registrar las respuestas del nervio óptico (fig. 1B). El interior de la cámara es de 2 cm de diámetro y abierto que tiene una delgada abertura semicircular con ranura en la pared de fondo para dar cabida a los nervios y aislarlo del tejido circundante. </li><li> Antes de colocar la cámara de una aguja de calibre 16 se inserta entre los músculos de la bisagra en el corazón y el ~ 20 cc de sangre es drenada del animal. Exanguinación no es necesario, pero hace la disección del nervio óptico más fácil. </li><li> La localización del nervio óptico se calcula mediante la elaboración en el caparazón de una línea ligeramente curvada entre los ojos laterales y la mediana. </li><li> Un agujero circular se corta en el caparazón con un trépano. El agujero es el mismo diámetro que la cámara también. El centro del agujero se encuentra 2-3 cm por delante del lateral del ojo y ligeramente dorsal a la línea para que el nervio discurre por la parte ventral del pozo. </li><li> El tejido conectivo se borra hasta que el nervio es totalmente visible y libre de los alrededores y el tejido subyacente. </li><li> Una hebra de hilo se enrolla alrededor del nervio y entró en la cámara a través de la ranura en la parte inferior. A través de esta misma apertura del nervio es guiado delicadamente en la cámara, tirando de la cuerda. Al mismo tiempo, la cámara también se inserta en el agujero. Se cerrará la cámara colocada en el caparazóncon tornillos y así se rellena con solución de Ringer. </li><li> Después de la unión de cámara el animal se encuentre en una jaula a prueba de luz en un tanque lleno de agua de mar en las branquias. </li><li> El pozo se visualiza en un estereoscopio (SMZ-168, Jed Pella Inc) y se rellena de algodón alrededor de la abertura en la parte inferior para evitar la fuga de sangre en solución salina y fuera de la cámara. </li><li> Tejido residual conectivo alrededor del nervio se retira con unas tijeras y unas pinzas finas, y la cámara se rellena con solución de Ringer fresca. </li><li> Un nick se hace en el vaso sanguíneo que encapsula el nervio y por esta abertura el nervio está cuidadosamente desheathed a lo largo de su longitud usando tijeras finas, pinzas, agujas y sondas. </li><li> Un pequeño haz de fibras se separan del nervio con la sonda y el corte en el extremo más alejado del ojo para la grabación de fibras aferentes y en el extremo más cercano al ojo para la grabación de fibras eferentes. En el video al final de las grabaciones de fibras aferentes se corta. </li><li> Un electrodo microsucción (AM Systems Inc) lleno de solución de Ringer se utiliza para la grabación del nervio óptico. La punta del electrodo se coloca en el conjunto de nervios por el fuego pulido final de una copa de 1mm de diámetro borosilicato capilares. </li><li> La punta del electrodo se introduce en la cámara y con un manipulador de manual (WPI Inc), y el haz de fibras cortadas se aspira en la punta. Succión es proporcionada por una jeringa Gilmont conectado al electrodo a través de la tubería. </li><li> La conexión BNC proporciona el cable de señal y un cable de cloruro de plata envuelta alrededor del electrodo para reducir el ruido proporciona el cable de referencia. Los dos cables están conectados a la etapa de la cabeza de un amplificador diferencial para la amplificación de la señal y filtrado de ruido (X-cell 3x4, FHC Inc). La salida del amplificador es enviada a un osciloscopio para la visualización y una tarjeta de adquisición de datos para el análisis informáticos y de almacenamiento. </li><li> Los datos se recogen con un programa personalizado escrito en LabView. El programa de control de estímulos de luz a través de un procesador de video digital (Bits + +, Cambridge Research Systems Inc) y se conecta con un discriminador digital de punta (APM, FHC Inc) que los registros de los trenes de espiga. La luz puede ser entregado a las células individuales en el ojo a través de un tubo de luz de fibra óptica o de todo el ojo a través de una pantalla de vídeo controladas por ordenador. </li></ol> Parte 5: grabación intrarretinianas Herramientas necesarias para este procedimiento incluyen un destornillador, una plataforma en forma de L lucite con agujeros de los tornillos de rosca, el titular de microelectrodos con una pipeta de vidrio, tornillos de acero inoxidable, pinzas, bisturí y una multa. <ol><li> Un plato hecho a mano lucite con agujeros de los tornillos preestablecido se utiliza para registrar las respuestas intracelulares. Los agujeros están espaciados para el montaje de un micromanipulador motorizados (PPM5000, WPI Inc). La placa se sujeta al animal con dos tornillos en el lateral y en la parte superior. </li><li> Después de fijación de la placa que el animal es colocado en una jaula a prueba de luz en un tanque lleno de agua de mar en las branquias. </li><li> El micropositioner se atornilla en la placa, con su brazo móvil alineados sobre el ojo. </li><li> Un lote de pipetas de vidrio se tira de 1 mm de diámetro exterior de vidrio de borosilicato y las puntas son rellenados a través de la acción capilar mediante la colocación de las pipetas en un pequeño frasco de solución de KCl 3M. </li><li> El resto de las pipetas se llenan manualmente con la solución salina y se inserta en un porta-electrodos. </li><li> El titular del electrodo se conecta a la etapa de la cabeza de un amplificador intracelular (IR-283, Cygnus Technology Inc) fijado al brazo micropositioner. </li><li> Una pequeña sección de la retina (~ 1mm2) está expuesta al cortar la interfaz de la córnea con una cuchilla de afeitar. </li><li> Una gota de solución de Ringer se coloca en la retina expuesta para prevenir la sequedad y la punta de la micropipeta se avanza a través de la abertura en el tejido de la retina. </li><li> Cuando la punta entra en la solución, el modo de inyección de corriente del amplificador intracelular se dedica y la impedancia del electrodo se mide. Micropipetas con una impedancia fuera del rango de 20 a 70 MW se descartan. Los que están en este rango son los pasos avanzados en micras y empalado en las células por la vibración de la punta de la pipeta electrónica o mecánicamente. </li><li> Tres tipos de células se pueden encontrar en el ojo. Células Retinular mostrar sólo una respuesta de despolarización a la luz, las células excéntricas muestran un tren de potenciales de acción de montar una respuesta de despolarización, y las células de pigmento no mostrar respuesta alguna luz. </li><li> Los datos se recogen con un programa personalizado escrito en Labview. El programa de control de estímulos de luz a través de un procesador de video digital (Bits + +, Cambridge Research Systems). Los estímulos se entregan a las células empalado con un tubo de fibra óptica o la pantalla de vídeo. Las respuestas de tensión se observa en el osciloscopio y digitalizadas por el programa a la computadora. </li></ol> Parte 6: Resultados de Representante Un representante del ERG se muestra en la Figura 2A. La forma de onda eléctrica representa la sumarespuesta a la luz de todo las células fotorreceptoras retinular, ya que son mucho más numerosos que las células excéntricas y están acopladas eléctricamente con ellos. No hay forma de onda de varios componentes de los diferentes tipos de células de la retina de mamíferos como el ERG. Retroalimentación de un reloj circadiano en el cerebro Limulus modula las propiedades fisiológicas de las células de la retina en una base diaria, haciendo que el curso de la amplitud y el tiempo del ERG a variar con el tiempo (1). Como se muestra en la Figura 2B, ERG amplitud es mayor durante la noche subjetiva de los animales más bajos y durante el día subjetivo. Un seguimiento de representante de una sola respuesta óptica de la fibra nerviosa a la luz se muestra en la Figura 3. Células excéntrica todos se comportan más o menos lo mismo, mostrando un aumento transitorio en la tasa de descarga en punta seguido por un deterioro a un nivel sostenible. La tasa de decaimiento refleja la acción combinada de adaptación a la luz y la punta-dependiente de auto-inhibición de las células excéntrico (2). Otros patrones de pico, como dependiente de la luz disminuye en la tasa, se ve en el cerebro Limulus, pero no el ojo (3). Rastros representante de la respuesta de tensión de una célula de las células pigmentarias, células retinular y excéntrico a la luz se muestra en la Figura 4. Sólo estos dos últimos tipos de células de la retina son visuales. El curso de la amplitud y el tiempo de su respuesta depende de la calidad de la grabación y la ubicación de los electrodos dentro de la célula. Por lo general, el electrodo penetra en las células de pigmento o células retinular debido a su gran tamaño y número. En este último caso, una despolarización transitoria que disminuye a un nivel constante se registra. La decadencia se debe a la adaptación a la luz por las células retinular (2). Si el electrodo entra en una célula de excéntrico, un gran potencial de acción se registró en el axón (40-70mV) y pequeños potenciales de acción cabalgando sobre una forma de onda de despolarización (&lt;25mV), cerca del soma. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig1.jpg" alt="la figura 1" /> Figura 1. Esquemas de las cámaras utilizadas para la grabación de electrorretinograma (A) y la grabación del nervio óptico (B). Bar es igual a 7 mm de A y de 5 mm en B. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig2.jpg" alt="la figura 2" /> Figura 2. Rastro Ejemplo de un ERG Limulus evocada por un pulso de 100ms LED de 5V en la oscuridad (A) y la fluctuación de pico a pico en el ERG amplitud en el tiempo en la oscuridad constante (B). La oscuridad se inició en el momento indicado por el triángulo blanco. El crecimiento de la ERG amplitud a través de la hora indicada por el triángulo negro se debe a la adaptación a la luz, lo que aumenta la sensibilidad del ojo en la oscuridad. La variación cíclica en el ERG amplitud a partir de entonces se debe al reloj circadiano interno del animal. Los puntos de tiempo en el B son cada 5 minutos. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig3.jpg" alt="la figura 3" /> Figura 3. Rastro Ejemplo de una respuesta nerviosa de fibra óptica a la luz brilló sobre un receptor ommatidial sola. Forma de onda por encima de la traza muestra el tiempo de estímulo. Células excéntrico, cuyos axones dar lugar a las fibras nerviosas, todos muestran un patrón similar de disparar, ya que en las condiciones de iluminación del experimento (5 segundos de flash en la oscuridad total). Codificación de la retina con clavos es un Limulus propiedad tiene en común con los mamíferos, a diferencia de otros invertebrados. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig4.jpg" alt="la figura 4" /> Figura 4 rastros Ejemplo de la respuesta de tensión a la luz de los tres tipos de células presentes en el lateral del ojo Limulus:. Células pigmentarias (A), células retinular (B), y la célula excéntrica (C). La primera célula no es visual. Los dos últimos despolarizar a un destello de luz. La despolarización es mayor en las células retinular porque la transducción de la luz y envían la señal a través de uniones de la célula excéntrica, con alguna pérdida en el camino. En la celda excéntrico, los potenciales de acción lanzado por el axón se ven a caballo por la despolarización debido a backpropagation espiga en el soma. La amplitud de los potenciales de acción se ha atenuado en la figura para una mejor visualización del potencial de despolarización. El potencial de reposo de las células es-50mV.

<ol>
	<li>Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+the+Limulus+visual+system.">Circadian rhythms in the Limulus visual system.</a> J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).</li><li>Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+based+model+of+the+Limulus+lateral+eye.">Cell based model of the Limulus lateral eye.</a> J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).</li><li>Snodderly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+visual+inputs+by+the+brain+of+Limulus.">Processing of visual inputs by the brain of Limulus.</a> J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).</li><li>Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+a+neural+code+for+vision.">Deciphering a neural code for vision.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).</li><li>Barlow, R. B., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limulus+lateral+eye:+properties+of+receptor+units+in+the+unexcised+eye.">Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye.</a> Science. 174, 1027-1029 (1971).</li><li>Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Bellows+Cup+Electrode+Demonstrates+Low-frequency+Properties+of+Long-term+Electroretinographic+Recordings+in+the+Limulus+Lateral+Eye.">Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye.</a> J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).</li></ol>

Hemos ilustrado cómo realizar grabaciones de ERG, las grabaciones del nervio óptico, y las grabaciones intra en los cangrejos de herradura en vivo. Las técnicas de grabación cada uno proporcionar ideas diferentes a las bases neuronales de la visión, y todos ellos pueden ser utilizados para estudiar la función de la retina en animales vivos gracias a sus grandes ojos del cangrejo y de caparazón duro. La actividad del nervio óptico, incluso se pueden grabar libremente comportarse animales en el océano con la cons...

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		<tr>
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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>LED</td>
<td>Light source</td>
<td>Newark Inc</td>
<td>33C1292</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suction electrode</td>
<td>Electrode</td>
<td>A-M Systems, Inc</td>
<td>573000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XCell 3*4-Channel Extracellular Amplifier</td>
<td>Amplifier</td>
<td>FHC Inc.</td>
<td>40-40-8B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intracellular Recording</td>
<td>Amplifier</td>
<td>Cygnus</td>
<td>IR-283A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>APM</td>
<td>Neural Spike Discriminator</td>
<td>FHC Inc.</td>
<td>APM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bits++</td>
<td>Video Board</td>
<td>Cambridge Research Systems Inc</td>
<td>Bits++</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Piezopatch Manipulator</td>
<td>Micropositioner</td>
<td>WPI Inc</td>
<td>PPM5000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Square Pulse Stimulator</td>
<td>Nerve Stimulator</td>
<td>Grass Instrument Division, Astro-Med, Inc.</td>
<td>Model S48</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97</td>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Model P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Glass Capillary</td>
<td>Electrode glass</td>
<td>WPI Inc</td>
<td>1B150-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horseshoe crab (Limulus polyphemus)</td>
<td>Animal</td>
<td>Marine Biological Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Glass Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zoom Stereoscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Jed Pella Inc.</td>
<td>SMZ-168</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

using the horseshoe crab, limulus polyphemus, in vision research

El cangrejo de herradura de América, Limulus Polifemo es una de las criaturas más antiguas de la tierra, y el animal sigue desempeñando un papel indispensable en la investigación biomédica. No sólo su sangre contiene células especiales que utilizan los científicos para detectar bacteriotoxins en nuestras medicinas, pero sus ojos también contienen una red neuronal que han permitido comprender mucho acerca de los procesos fisiológicos que operan en nuestro sistema visual, como la adaptación a la luz y la inhibición lateral. El cangrejo de herradura sigue siendo un modelo atractivo para la investigación de la visión, porque el animal es grande y resistente para un invertebrado, sus neuronas de la retina son grandes y de fácil acceso, su sistema visual es compacto y estudiado ampliamente, y su comportamiento visual está bien definido. Por otra parte, la estructura y función de los ojos son moduladas sobre una base diaria por un reloj circadiano en el cerebro del animal s. En resumen, el sistema visual de los cangrejos de herradura es bastante simple de entender pero lo suficientemente complejo como para ser interesante. En este vídeo se presentan tres paradigmas electrofisiológicos para investigar las bases neuronales de la visión que se pueden realizar en vivo con Limulus. Se está grabando electrorretinograma, la grabación del nervio óptico, y la grabación intra. Electrorretinograma (ERG), grabaciones de medida con una superficie del electrodo resume la respuesta eléctrica de las células en el ojo a un destello de luz. Pueden ser utilizados para controlar la sensibilidad de los ojos para prolongar los períodos de tiempo. Grabaciones del nervio óptico medir la actividad de adición de las fibras nerviosas individuales con un electrodo extracelular microsucción. Pueden ser utilizados para estudiar los mensajes visuales transmitidos desde el ojo hasta el cerebro, así como reloj circadiano mensajes realimentada desde el cerebro hasta el ojo. Medida grabaciones intrarretinianas con un microelectrodo intracelular las fluctuaciones de tensión inducida por la luz en las células individuales del ojo. Se pueden utilizar para dilucidar los mecanismos celulares de procesamiento de la retina.

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Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

En este vídeo podemos realizar la grabación electrorretinograma, la grabación del nervio óptico, y la grabación intrarretinianas con el cangrejo de herradura de América,<em&gt; Limulus polyphemus</em&gt;. Estos paradigmas electrofisiológicos se puede utilizar para investigar las bases neuronales de la visión en un laboratorio de investigación o enseñanza.

Utilizando el cangrejo de herradura, Limulus polyphemus, En la Investigación de la Visión

The American horseshoe crab, Limulus Polyphemus is one of the oldest creatures on earth, and the animal continues to play an indispensable role in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

14.2K vistas.  Boston University. En este vídeo podemos realizar la grabación electrorretinograma, la grabación del nervio óptico, y la grabación intrarretinianas con el cangrejo de herradura de América, Limulus polyphemus. Estos paradigmas electrofisiológicos se puede utilizar para investigar las bases neuronales de la visión en un laboratorio de investigación o enseñanza.

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Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate. The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated by the ease in collecting large volumes of blood and from the simplicity of the blood. Horseshoe crabs show only a single cell type in the general circulation, the granular amebocyte. The plasma has the salt content of sea water and only three abundant proteins, hemocyanin, the respiratory protein, the C-reactive proteins, which function in the cytolytic destruction of foreign cells, including bacterial cells, and &alpha;2-macroglobulin, which inhibits the proteases of invading pathogens. Blood is collected by direct cardiac puncture under conditions that minimize contamination by lipopolysaccharide (a.k.a., endotoxin, LPS), a product of the Gram-negative bacteria. A large animal can yield 200 - 400 mL of blood. For the study of the plasma, blood cells are immediately removed from the plasma by centrifugation and the plasma can then be fractionated into its constituent proteins. The blood cells are conveniently studied microscopically by collecting small volumes of blood into LPS-free isotonic saline (0.5 M NaCl) under conditions that permit direct microscopic examination by placing one of more LPS-free coverglasses on the culture dish surface, then mounting those coverglasses in simple observation chambers following cell attachment. A second preparation for direct observation is to collect 3 - 5 mL of blood in a LPS-free embryo dish and then explanting fragments of aggregated amebocytes to a chamber that sandwiches the tissue between a slide and a coverglass. In this preparation, the motile amebocytes migrate onto the coverglass surface, where they can readily be observed. The blood clotting system involves aggregation of amebocytes and the formation of an extracellular clot of a protein, coagulin, which is released from the secretory granules of the blood cells. Biochemical analysis of washed blood cells requires that aggregation and degranulation does not occur, which can be accomplished by collecting blood into 0.1 volumes of 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, followed by centrifugation of the cells and washing with 0.5 M NaCl.

The American horseshoe crab, Limulus polyphemus, is arguably the most convenient source for large quantities of blood of any invertebrate. The blood is simple in composition, with only one cell-type in the general circulation, the granular amebocyte, and only three abundant proteins in the plasma, hemocyanin, the C-reactive proteins, and &alpha;2-macroglobulin. Blood is collected from the heart and the blood cells and plasma are separated by centrifugation.

Extracción de sangre del cangrejo herradura de América, Limulus polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Investigación

Biología

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

Preparación de muestras para perfiles metabólicos utilizando imágenes de espectrometría de masas MALDI

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) human corneal epithelial cell cultures. Cells were exposed to UV radiation and toxic doses of benzalkonium chloride (BAK), hydrogen peroxide (H2O2), and sodium dodecyl sulfate (SDS). Metabolic activity was measured using a metabolic assay. The release of inflammatory cytokines was measured using a multi-plex interleukin (IL)-1&#946;, IL-6, IL-8, and tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) assay, and cells were evaluated for viability using fluorescent dyes. 
The damaging effects of UV on cell metabolic activity and cytokine release occurred at 5 min of UV exposure for iHCEC and 20 min for pHCEC. Similar percent drops in metabolic activity of the iHCEC and pHCEC occurred after exposure to BAK, H2O2, or SDS, and the most significant changes in cytokine release occurred for IL-6 and IL-8. Microscopy of fluorescently stained iHCEC and pHCEC BAK-exposed cells showed cell death at 0.005% BAK exposure, although the degree of ethidium staining was greater in the iHCECs than pHCECs. Utilizing multiple methods of assessing toxic effects using microscopy, assessments of metabolic activity, and cytokine production, the toxicity of UV radiation and chemical toxins could be determined for both primary and immortalized cell lines.

This article describes the procedures used to evaluate the toxicity of UV radiation and chemical toxins on a primary and immortalized cell line.

Determinación de la toxicidad de la radiación UV y los productos químicos en las células epiteliales corneales humanas primarias e inmortalizadas

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent retinal and vascular tissues. At present, the limited reparative capacity of mammalian RPE, which is restricted to small injuries, has hindered progress to understanding in vivo RPE regenerative processes. Here, a detailed methodology is provided to facilitate the study of in vivo RPE repair utilizing the zebrafish, a&#160;vertebrate model capable of robust tissue regeneration. This protocol describes a transgenic nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ)-mediated injury paradigm (rpe65a:nfsB-eGFP), which results in ablation of the central two-thirds of the RPE after 24 h treatment with MTZ, with subsequent tissue recovery. Focus is placed on RPE ablations in larval zebrafish and methods for testing the effects of pharmacological compounds on RPE regeneration are also outlined. Generation and validation of RpEGEN, a MATLAB script created to automate quantification of RPE regeneration based on pigmentation, is also discussed. Beyond active RPE repair mechanisms, this protocol can be expanded to studies of RPE degeneration and injury responses as well as the effects of RPE damage on adjacent retinal and vascular tissues, among other cellular and molecular processes. This zebrafish system holds significant promise in identifying genes, networks, and processes that drive RPE regeneration and RPE disease-related mechanisms, with the long-term goal of applying this knowledge to mammalian systems and, ultimately, toward therapeutic development.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

This protocol describes the methodology to genetically ablate the retinal pigment epithelium (RPE) using a transgenic zebrafish model. Adapting the protocol to incorporate signaling pathway modulation using pharmacological compounds is extensively detailed. A MATLAB platform for quantifying RPE regeneration based on pigmentation was developed and is presented and discussed.

Ablación mediada por nitrorreductasa/metronidazol y una plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudiar la regeneración del epitelio pigmentario de la retina del pez cebra

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Investigación del mecanismo de transporte de zinc en células de mamíferos con el ensayo FluoZin-3

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

Autor destacado: Explorando la regulación celular del zinc a través de la funcionalidad de ZnT1 

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

Caracterización de transportadores de zinc en mamíferos mediante un ensayo de transporte de zinc in vitro

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...

Flujos de trabajo TEM, análisis de resultados y gestión de datos mediante un enfoque de visión artificial

A Machine-Vision Approach to Transmission Electron Microscopy Workflows, Results Analysis and Data Management

Transmission electron microscopy (TEM) enables users to study materials at their fundamental, atomic scale. Complex experiments routinely generate thousands of images with numerous parameters that require time-consuming and complicated analysis. AXON synchronicity is a machine-vision synchronization (MVS) software solution designed to address the pain points inherent to TEM studies. Once installed on the microscope, it enables the continuous synchronization of images and metadata generated by the microscope, detector, and in situ systems during an experiment. This connectivity enables the application of machine-vision algorithms that apply a combination of spatial, beam, and digital corrections to center and track a region of interest within the field of view and provide immediate image stabilization. In addition to the substantial improvement in resolution afforded by such stabilization, metadata synchronization enables the application of computational and image analysis algorithms that calculate&#8239;variables between images. This calculated metadata can be used to analyze trends or identify key areas of interest within a dataset, leading to new insights and the development of more sophisticated machine-vision capabilities in the future. One such module that builds on this calculated metadata is dose calibration and management. The dose module provides state-of-the-art calibration, tracking, and management of both the electron fluence (e-/&#197;2&#183;s-1) and cumulative dose (e-/&#197;2) that is delivered to specific areas of the sample on a pixel-by-pixel basis. This enables a comprehensive overview of the interaction between the electron beam and the sample. Experiment analysis is streamlined through a dedicated analysis software in which datasets consisting of images and corresponding metadata are easily visualized, sorted, filtered, and exported. Combined, these tools facilitate efficient collaborations and experimental analysis, encourage data mining and enhance the microscopy experience.

Autor destacado: Un enfoque de visión artificial para los flujos de trabajo de microscopía electrónica de transmisión, el análisis de resultados y la gestión de datos  

Here, we present a protocol to utilize machine-vision software to stabilize dynamic processes during TEM imaging, while concurrently indexing multiple streams of metadata to each image into a navigable timeline. We demonstrate how this platform enables automated calibration and mapping of the electron dose over the course of an experiment.