Con este protocolo, introdujimos el primer método capaz de perfilar simultáneamente múltiples modificaciones de ARN en neuronas individuales, abriendo nuevas áreas de investigación que involucran la regulación post-transcripcional en células individuales. Al aprovechar las condiciones optimizadas de preparación de muestras y la espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida, se pueden detectar y cuantificar más de una docena de nucleósidos modificados en una sola neurona por experimento. Las células individuales son diferentes en términos de sus funciones, morfología y sus perfiles químicos.
Es importante que podamos medir el mosaico químico completo de estas células, incluidos sus perfiles de ARN, para que haya suficientes células para comprender sus diferencias, tanto en la salud como en la enfermedad. El grado de preparación de los ganglios antes del aislamiento de una sola neurona depende de las preferencias del individuo que realiza el aislamiento. Intente tratamientos de proteasa más largos y más cortos para identificar las condiciones adecuadas.
Para comenzar, coloque el lado ventral anestesiado de Aplysia californica hacia arriba en una bandeja de disección. Comience a diseccionarlo usando tijeras quirúrgicas con una punta roma colocada hacia el animal y haciendo cuidadosamente un corte longitudinal a través del pie. Después de fijar los lados rostral, caudal y lateral del cuerpo del animal para exponer los órganos internos y los ganglios del sistema nervioso central en la cavidad corporal, aísle los principales ganglios del sistema nervioso central del animal cortando quirúrgicamente los nervios y algunos conectivos que se originan en los ganglios.
Sumergir los ganglios en 10 miligramos por mililitro de solución de proteasa tipo XIV de Streptomyces griseus e incubar durante 30 minutos a una hora a 34 grados centígrados. A continuación, enjuague los ganglios seis veces con solución antibiótica artificial de agua de mar. Luego, utilizando una pipeta de transferencia de polipropileno que se ha cortado a una abertura de cinco milímetros, transfiera todos los ganglios a un plato recubierto de polímero de silicona lleno de la solución antibiótica artificial de agua de mar.
Mantenga los ganglios siempre sumergidos en agua de mar artificial. A continuación, para quitar las vainas ganglionares, fije los ganglios y use microscisores y fórceps finos. Con un tratamiento enzimático suficientemente fuerte, use agujas de vidrio o metal para desenfundar.
Identificar visualmente las neuronas de interés. Usando un capilar de vidrio agrupado o agujas de tungsteno afiladas, aísle cuidadosamente la célula identificada del ganglio a granel. Después de extraer aproximadamente un microlitro de agua de mar artificial en una micropipeta de plástico, transfiera la célula aislada a un tubo de muestra de PCR que contiene cuatro microlitros de acetato de amonio molar 0.365.
Para mediciones en blanco, recoja cinco alícuotas de microlitros de la solución antibiótica artificial de agua de mar del plato que contiene el ganglio y mezcle con el tampón de digestión. Lisar las neuronas aisladas mediante aspiración repetida y prescindir de una micropipeta en acetato de amonio molar 0,365. Es posible que algunas células no se rompan inmediatamente.
Para lisarlos, aplique presión a través del diámetro de la celda con un capilar de vidrio agrupado. A continuación, caliente la muestra en un ciclo térmico antes de agregar 3.375 microlitros de tampón de digestión de ARN a la muestra. Mezcle esta solución con una micropipeta retirando y dispensando la solución varias veces.
Haga girar las gotas de líquido que se adhieran a las paredes del tubo de PCR con una centrífuga de sobremesa en miniatura. Luego incube las muestras en el ciclo térmico a 37 grados Celsius durante tres horas, seguido de una retención a 10 grados Celsius con la tapa calentada configurada en On.Una vez que las muestras se hayan enfriado, transfiera inmediatamente siete microlitros de la solución a un vial de automuestreador equipado con un inserto de 250 microlitros sin ninguna formación de burbujas en el tubo de automuestreador. Para preparar el sistema de cromatografía líquida para la separación de los nucleósidos canónicos y modificados, equilibre una columna C18 utilizando 99% de fase A móvil y 1% de fase B móvil a un caudal de 0,2 mililitros por minuto durante 12 minutos a 36 grados centígrados.
Opere el instrumento de espectrometría de masas en modo positivo con la válvula desviadora configurada para desperdiciar durante los primeros dos minutos de análisis y para obtener durante el resto de la ejecución. A continuación, recoja espectros de masas en un rango de m/z de 110 a 600. Seleccione iones para la disociación inducida por colisión a 35 a 40 electronvoltios durante un tiempo de ciclo de tres segundos utilizando una lista de masa preferida construida a partir de la base de datos y una ventana de aislamiento de 0.5.
Utilice la exclusión activa para excluir los iones de la fragmentación después de tres espectros. Establezca la adquisición dinámica de espectros MS/MS para iones con intensidades por encima y por debajo de 50, 000 recuentos a cuatro Hertz y un Hertz, respectivamente. Y un umbral mínimo para la selección de iones en 1, 990 recuentos.
Para el análisis cuantitativo de modificación de ARN de neurona única por espectrometría de masas, construya curvas de calibración utilizando áreas pico de cromatograma iónico extraídas obtenidas para estándares de nucleósidos modificados a un mínimo de cinco concentraciones para permitir la interpolación de concentraciones de analitos endógenos desconocidos. El análisis de modificación de ARN de una sola neurona por espectrometría de masas implica el aislamiento manual de las neuronas identificadas en pequeños volúmenes de muestra para la digestión de la lisis y el análisis LC-MS / MS. El análisis de modificación de ARN de neurona única por espectrometría de masas detectó rutinariamente más de una docena de modificaciones de ARN en neuronas individuales del sistema nervioso central de Aplysia californica, lo que representa una cobertura de casi la mitad del epitranscriptoma conocido de este animal en una sola célula.
Los resultados revelaron por primera vez que los perfiles de modificación de ARN de células individuales podrían divergir de las células a granel en el mismo tejido. Se obtuvo un apoyo adicional para patrones únicos de nucleósidos modificados de una cohorte separada de animales en la que se realizaron comparaciones por pares para 13 modificaciones de ARN, comúnmente detectadas tanto en neuronas individuales como en tejido a granel. Las modificaciones de ARN en células funcionalmente diferentes formaron grupos únicos en la gráfica de puntuación, mientras que las neuronas R2 / LPl1 homólogas se agruparon.
La gráfica de carga muestra que las diferencias fueron impulsadas principalmente por la abundancia de isómeros posicionales de metiladenosina, incluyendo 2'O-metiladenosina y N1-metiladenosina. Se generaron curvas de calibración externas para N1-metiladenosina, pseudouridina, 2'O-metilguanosina, 2'O-metiladenosina y N6-dimetiladenosina. Y la cantidad de cada nucleósido modificado en las células metacerebrales y los pares de células R2/LPl1 se determinó por interpolación.
Asegúrese de que se transfiera un volumen mínimo de agua de mar artificial al tubo de PCR junto con la única neurona aislada. Esto minimiza la dilución de la muestra, lo que en última instancia afecta la detección de analitos. Este protocolo se puede utilizar para investigar las distribuciones de las modificaciones del ARN en estructuras subcelulares, como axones y dendritas, para mejorar la comprensión de los mecanismos de traducción local dependiente de la actividad.
